Çoğullanmış Zebra Balığı Görüntüleme için Düşük Maliyetli Polietilen Tereftalat Laminasyon Mikroakışkan Tasarımları

Laboratuvarımız, doku hasarı, enfeksiyon ve kanserde nötrofil göçünü ve aktivasyonunu düzenleyen mekanizmalarla ilgilenmekte ve yara iyileşmesinde hücre içi kalsiyum sinyalizasyonunun özelliklerine ve biyolojik önemine odaklanmaktadır.

[Kabuklu] Geleneksel mikroakışkan tasarım yöntemleri maliyetli ve karmaşıktır, bu nedenle farklı ortamlar gerektiren gelişim biyolojisi gibi alanlarda ilerlemeyi yavaşlatır. Bireysel tasarımları geliştirmek ve test etmek için daha hızlı ve verimli bir yaklaşım gördük. Dolayısıyla bu yapım yöntemi, standart PDMS cihazlarından daha hızlı ve daha kolay yineleme sağlarken, benzer şekilde basit protokollerden daha fazla tasarım esnekliği ve uzamsal çözünürlük sağlar. Bunu kullanarak, tek bir görüş alanı içinde birden fazla zebra balığı embriyosunu aynı anda görüntülemek için RADISH'i geliştirdik.

Yüksek çözünürlüklü yaşam görüntülemeyi destekleyen bu tuzak cihazıyla, iltihabı ve yara iyileşmesini koordine etmek için kimyasal ve mekanik uyaranlar da dahil olmak üzere çeşitli sinyallerin nasıl entegre edildiğini anlamaya hazırız.

[Öğretim Görevlisi] Başlamak için, tercih ettiğiniz yazılımı kullanarak cihazın desenini tasarlayın. Embriyonun yaşına ve boyutuna bağlı olarak, kanalın genişliğini ve merkezi görüntüleme odasının boyutunu en iyi uyum için ayarlayın. Her katmanı aynı boyutlara sahip ayrı bir görüntü dosyası olarak kaydedin. Şimdi, kesme makinesini üreticinin talimatlarına göre başlatın. Tasarım çalışma alanında, yeni yüklenen tasarımları seçin. Aynı kalınlıktaki PET levha için tasarlanan desenleri aynı kesimde gruplandırın. Kesimdeki desenlerin sayısını ve türünü onaylayın, ardından kesilen malzemeyi seçin. Ardından, PET levhayı hava kabarcıklarını gidermek için sıkıca bastırarak istenen kalınlıkta kesme matına takın ve matı kesme makinesine yükleyin. Kesme makinesinin kesime başlamasını istemek için ekrandaki talimatları izleyin. Ardından, bitmiş kesimleri kesme matından çıkarın. Şimdi, katmanları yardımsız veya önceden kesilmiş kayıt işaretleriyle bir kapak camı üzerinde hizalayın. Laminasyon sırasında kaymayı önlemek için katmanları ofis bandı ile sabitleyin. Cihaz boyutuna ve laminasyon kapasitesine bağlı olarak, laminatör beslemesinin sıkışmasını veya tıkanmasını önlemek için küçük tasarımları daha fazla bantla daha büyük bir desteğe monte edin. Daha sonra, üreticinin talimatlarına göre laminatörü ve laminatı açın. Bir sonraki katmanı hizalamadan önce ofis bandını çıkarın. Siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak, cihazı üç çeyrek inçlik bir delikle delinmiş 35 milimetrelik bir tabağa sabitleyin. Ardından, dış cihaz kenarlarını siyanoakrilat yapıştırıcı ile iyice kaplayarak laminatı su geçirmez hale getirin. Dış kenarları boşluk bırakmadan tamamen kaplamak için yeterli yapıştırıcı kullanın. Başlamak için, zebra balığı embriyolarını E3'te veya başka bir uygun embriyo yetiştirme ortamında döllenmeden en az iki gün sonrasına yükseltin. Daha sonra, litre başına 164 miligram MS-222 kullanarak embriyoları uyuşturun. Daha sonra, monte edilmiş cihazı içeren tutma kabını beş mililitre E3 veya litre başına 164 miligram MS-222 içeren başka bir embriyo ortamı ile doldurun. Bir transfer pipeti kullanarak, cihazın her bir tutma odasına anestezi uygulanmış bir embriyo yerleştirin. Daha sonra, bir saç halkası kullanarak, embriyoları, her bir embriyonun kuyruğu merkezi görüntüleme odasına çıkıntı yapacak ve yumurta sarısı kama şeklindeki kanalda hareketsiz hale getirilecek şekilde yönlendirin. İstenirse, bir mikro pipet kullanarak tutma haznesine %1,5 düşük eriyik agaroz ekleyerek embriyonun başını sabitleyin. Son olarak, görüntülemeye başlamak için embriyoların bulunduğu cihazı tercih edilen görüntüleme sistemine taşıyın, Deney için uygun görüntüleme sistemini ve hedefi seçin. Optimum sinyal-gürültü oranı ve çekim hızı için örnek odağını ve görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Embriyoyu manuel transeksiyon yoluyla sarmak için, stereo mikroskop altında notokordun ucundaki kuyruk yüzgeci dokusu boyunca bir neşter bıçağıyla baskı uygulayın. Ardından, cihazı sahne alanına geri getirin. Embriyoyu lazer stimülasyonu ile sarmak için, kuyruk yüzgeci kıvrımının kenarına yakın bir ilgi alanı tanımlayın ve mevcut lazer gücüne göre uyarın. Embriyoyu oda sıcaklığında, GFP ve RFP kanalını kullanarak, toplam bir saat boyunca bir dakikalık çerçeve aralığı ile görüntüleyin. Gerekirse, bir transfer pipeti kullanarak başın yakınında hafifçe emerek veya tabağı döndürerek görüntülemeden sonra embriyoları serbest bırakın.