İki Tip Yapışık Hücre Hattı Kullanan Ko-Kültür Modeli
8 Kasım 2024
Protokol, üç boyutlu (3D) baskılı bir iskele ile iki tür yapışık hücre hattının biyolojisini özetleyebilen yeni bir in vitro deneysel modeli göstermektedir. Bu modelin inşası ve hücre hazırlığı ve hücre kültüründen analiz ve değerlendirmeye kadar işletme prosedürleri açıklanmaktadır.
Kurumumuzun adı olan Maternal-Fetal Tıp Enstitüsü'nden de anlaşılacağı gibi, araştırmalarımız ağırlıklı olarak kadın üreme biyolojisine odaklanmaktadır. Üreme bozukluklarının mekanizmasını anlamayı ve bunları tedavi etmek için potansiyel hedefleri belirlemeyi amaçlıyoruz. Bu yaklaşımın en önemli avantajlarından biri, ticari olarak mevcut ko-kültür sistemlerine kıyasla zaman ve harcamada önemli bir azalma sağlamasıdır.
Ev yapımı iskele, kolayca bulunabilen malzemelerden yapılmıştır ve kurulum maliyetini önemli ölçüde düşürür. Bu çok hücreli in vitro modeller, implantasyon bölgesinin karmaşık bir in vivo anatomisini daha iyi temsil eder. Gelecekte, laboratuvarımız bu karışık tohumlama çok hücreli in vitro modele diğer hücre tiplerini tanıtacak ve endometriyal yaralanma ve intrauterin yapışma gibi hastalıkların patogenezinde hem implantasyon çalışmalarını hem de uterus fonksiyonunu daha fazla araştıracaktır.
Başlamak için, model yapımı için 3D baskılı iskeleyi edinin. Hücre kültürü için, 12 oyuklu bir plakanın altına temiz ve steril 18 milimetre kare bir lamel yerleştirin. Lameli mililitre başına 200 ila 300 mikrogram konsantrasyonda 200 mikrolitre hücre dışı matris ile kaplayın.
Plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derecede tutun. Ardından hücre dışı matrisi plakadan çıkarın. Daha sonra, uygun birleşmeyi doğrulamak için önceden kültürlenmiş insan embriyonik kök hücrelerini ve Ishikawa hücrelerini mikroskop altında inceleyin.
Daha sonra harcanan ortamı kuyulardan çıkarın ve hücreleri iki kez üç mililitre PBS ile yıkayın. Şimdi hücreleri ayırmak için iki mililitre ayrışma enzimi ile 37 santigrat derecede iki dakika inkübe edin. Tam bir kültür ortamı kullanarak reaksiyonu nötralize edin.
Ardından, yukarı ve aşağı pipetleyerek tek hücreli bir süspansiyon oluşturun. Şimdi 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu tripan mavisi ile karıştırın ve iki seyreltme faktörünü koruyun. Ardından lamel hemositometre odasının üzerine kaydırın.
Her iki yan bölmeyi de tripan mavisi ile karıştırılmış hücre süspansiyonu ile doldurun. 20X mikroskop altında her iki taraftaki karelerdeki hücre sayısını sayın ve sayımlara göre hücre yoğunluğunu hesaplayın. Şimdi insan embriyonik kök hücrelerini, taze ortam içeren hazırlanmış plakada mililitrede beş hücrenin gücüne 10 ila 10 konsantrasyonda tohumlayın ve 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ishikawa hücre hattı için, ertesi gün hücreleri lamel olmadan kuyuya tohumlayın. İskeleleri iki gün boyunca etil alkol ve çift damıtılmış su ile iyice ıslatın. Suya batırdıktan sonra, çift damıtılmış suyu çıkarın ve metal kutuyu kapatın.
Daha sonra iskeleleri 121 santigrat derecede bir otoklav kullanarak sterilize edin. Bundan sonra kurumasına izin verin. Ishikawa hücreleri ile kuyuya yaklaşık iki mililitre tamamlayıcı ortam ekleyin.
Bağlı insan embriyonik kök hücrelerinin bulunduğu lamel iskeleye aktarın ve hücre tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirin. İskeleyi Ishikawa hücreleri içeren kuyuya takın. İkinci kurulum için, Ishikawa hücreli lamel iskeleye yerleştirin ve embriyonik kök hücreleri içeren kuyuya takın.
Ko-kültür sistemlerini 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübe edin. Kültür ortamını kuyucuklardan dikkatlice çıkarın ve hücreleri steril PBS ile nazikçe durulayın. İnce forseps veya cımbız kullanarak, ekli hücrelere sahip lamelleri kültür kaplarından çıkarın.
İsteğe bağlı olarak, transfer işlemi sırasında nemli kalmalarını sağlamak için lamelleri PBS ile yeni bir kaba koyun. Temiz bir mikroskop lamına bir damla PBS ekleyin ve hücreleri içeren lamel yavaşça damlanın üzerine aktarın ve hücrelerin lam üzerine bakacak şekilde olduğundan emin olun. Hazırlanan slaydı ters çevrilmiş bir mikroskop tablasına yerleştirin.
Uygun objektif lensi seçin ve odağı ayarlamak için kaba ve ince odak düğmelerini kullanın. Aydınlatma yoğunluğu ve kamera ayarları dahil olmak üzere mikroskop parametrelerini ayarlayın. İstenilen büyütme ve görüş alanlarında görüntü yakalamak için mikroskop yazılımını kullanın.
Her iki hücre tipinin yoğunluğu 72 saat sonra ko-kültür koşulunda düşük kalırken, bağımsız olarak kültürlenen hücre yoğunlukları önemli ölçüde artmıştır. Birlikte kültürlenmiş insan embriyonik kök hücrelerinin uzunluğu, bağımsız olarak kültürlenenlerden daha kısaydı.
Genel Bakış
Bu çalışma, insan embriyonik kök hücreleri ve Ishikawa hücre hatlarının kültürünü desteklemek için maliyet etkin, 3B yazıcıyla üretilmiş bir iskele kullanan, kadın üreme biyolojisini incelemeye yönelik yeni bir in vitro model sunmaktadır. Çok hücreli in vitro model, implantasyon bölgesinin daha doğru bir şekilde temsil edilmesine olanak tanır ve geleneksel ko-kültür sistemlerine kıyasla zaman ve maliyet tasarrufu avantajlarını vurgular.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Dişi üreme biyolojisi
- Üreme bozuklukları
- Hücre kültürü teknikleri
Arka Plan
- Üreme bozukluklarının altında yatan mekanizmalara odaklanılması
- Tedavi için potansiyel hedeflerin belirlenmesi
- Ticari olarak mevcut sistemlere maliyet etkin alternatifler
Kullanılan Yöntemler
- Hücre kültürü için 3B yazıcı ile üretilmiş iskeleler
- Biyolojik sistem olarak insan embriyonik kök hücreleri ve Ishikawa hücreleri
- Hücre yoğunluğu ve morfolojisinin değerlendirilmesi için mikroskopi
Ana Sonuçlar
- Ko-kültür sistemi, hücre etkileşimlerine dair önemli bulgular sağlayarak, bağımsız kültürlere göre daha düşük hücre yoğunluklarını korumuştur
- Ko-kültür edilen insan embriyonik kök hücrelerinin daha kısa uzunlukta olduğu gözlemlenmiştir
- Elde edilen sonuçlar, implantasyon ve uterus fonksiyonları üzerine yapılacak gelecek çalışmalar için temel veriler sağlamaktadır
Sonuçlar
- Bu çalışma, in vitro üreme biyolojisi araştırmaları için 3B yazıcıyla üretilmiş bir iskelenin kullanılabilirliğini kanıtlamaktadır
- Bu model, implantasyonla ilişkili bozuklukların patogenezinin anlaşılmasına katkıda bulunabilir
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulama ve İlgi Alanları
Maternal-fetal arayüzündeki hücre-hücre etkileşimlerinin modellenmesi, erken üreme biyolojisi hedeflerindeki risklerin azaltılması ve implantasyonun altında yatan mekanizmaların açıklığa kavuşturulması açısından kritik öneme sahiptir. 3D baskılı iskelelerin kullanıldığı bu ko-kültür sistemi, endometrial ve trofoblast hücre etkileşimlerinin maliyet etkin ve ölçeklenebilir in vitro çalışmalarına olanak tanıyarak, hedef doğrulama ve yolak incelemelerinde öngörülebilir güveni destekler. Bu yaklaşım, üreme sağlığı portföylerindeki keşif aşamasından preklinik araştırmalara kadar translasyonel sürekliliği kolaylaştırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Endometrial epitel-stroma ve trofoblast-endometrial etkileşimlerin mekanistik olarak incelenmesine olanak tanır.
- İmplantasyonla ilgili doğrudan ve dolaylı hücre iletişimini modelleyerek biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Reprodüktif bozukluk araştırmaları için fonksiyonel hedef doğrulamasını kolaylaştırır.
- Maternal-fetal biyolojide hipotez odaklı yolak açıklığa kavuşturma çalışmaları için bir platform sağlar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Aşağı akış bileşik taramaları veya pertürbasyon çalışmaları için valide edilmiş ko-kültür sistemleri hazırlar.
- Tekrarlanabilir 3B yazıcıyla üretilmiş iskeleler ve tanımlanmış hücre hatları kullanarak analiz koşullarını standardize eder.
- Mikroskopi aracılığıyla hücre yoğunluğu ve morfolojisinin kantitatif değerlendirmesine olanak tanır.
- Birden fazla deneysel koşul için ölçeklenebilirliği ve platformun yeniden kullanımını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- In vitro bulguları, implantasyon ve uterus fonksiyonlarındaki hastalıkla ilgili mekanizmalarla ilişkilendirir.
- Üreme sağlığında adayların keşif aşamasından preklinik doğrulamaya geçişi için süreklilik sağlar.
- Endometrial hasar ve intrauterin yapışıklık patogenezini modelleyerek risk ayarlı kararlar alınmasına olanak tanır.
- Translasyonel biyobelirteç araştırmaları için öngörücü risk azaltma imkanı sunar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu ko-kültür modeli, hem erken mekanistik çalışmaları hem de translasyonel araştırmaları destekleyerek, üreme biyolojisi için keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürece entegre olmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Maternal-fetal arayüz hedefleri için hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturma süreçlerini kolaylaştırır.
- Tarama: Hücresel yanıtların değerlendirilmesi için analize hazır, tekrarlanabilir ko-kültür sistemleri sağlar.
- Analitik: Karşılaştırmalı analizler için hücre yoğunluğu ve morfolojisi üzerine kantitatif çıktılar sunar.
- Translasyonel Araştırma: Üreme sağlığında in vitro bulgular ile hastalıkla ilgili preklinik modeller arasında köprü kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Ek hücre tiplerine ve deneysel tasarımlara uyarlanabilen, düşük maliyetli ve ölçeklenebilir bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef doğrulamada öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: İş akışlarını standartlaştırır ve maliyet etkin 3D yazıcıyla üretilmiş iskeleler ile tekrarlanabilirliği artırır.
- Stratejik Değer: Güçlü erken aşama modellemeye olanak sağlayarak devam/dur kararlarını ve sermaye verimliliğini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Üreme sağlığı programlarının risk ayarlı önceliklendirilmesini ve ilerletilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Model kurulumu ve analizi için hücre kültürü ve mikroskopi alanında uzmanlık gerektirir.
- 3B baskı altyapısına ve standart hücre kültürü donanımlarına erişim gereklidir.
- İskele hazırlama ve hücre ekim protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Daha geniş kapsamlı hastalık modellemesi için çeşitli adherent hücre hatlarına uyarlanabilir.
- Sınırlamalar arasında mevcut odak noktasının iki hücre tipiyle sınırlı olması ve sadece in vitro bağlamı yer almaktadır.
