Yetişkin Farelerden Hipokampal Mikroglia'nın İzolasyonu ve Tam Hücre Yama-Kelepçe Kaydı

Araştırmamız, iyon kanalı aktivitesini anlamak için potasyum akımları da dahil olmak üzere tüm hücre kayıtları için mikroglia'yı akut olarak izole etmeye odaklanmaktadır. Protokol aynı zamanda çeşitli beyin bölgeleri için mikroglia'yı izole etmek için uyarlanabilir ve farklı nöroloji koşullarında sıfıra dair içgörüler sağlar.

Araştırma alanımızdaki en son gelişmeler arasında, floresan aktif hücre ayıklama yoluyla mikroglia saflaştırması ile birlikte geleneksel pankreatit enzim sindiriminin kullanılması yer almaktadır. Bu gelişmeler, daha fazla çalışma için belirli mikroglia popülasyonlarını izole etmenin doğruluğunu ve verimliliğini artırmıştır.

Protokolümüz, mikroglianın elektro-fizyolojik özelliklerini, birincil kültürlenmiş CS'ye güvenmek yerine, doğrudan yetişkin fare hipokampusundan araştırır. Bu yaklaşım, mikroglia fonksiyonlarının kendi doğal ortamlarında daha doğru bir şekilde analiz edilmesini sağlar.

Sonuçlarımız, hem fizyolojik hem de hastalık koşulları altında mikroglia'nın biyokimyasal ve fonksiyonel özelliği hakkında yeni bilimsel soruların önünü açmış ve araştırmacılara bu yönleri daha fazla keşfetme konusunda değerli rehberlik sağlamıştır.

[Sunucu] Başlamak için, anestezi uygulanmış hayvanı sırtüstü bir diseksiyon masasına yerleştirin ve uzuvlarını sabitleyin. Göğsü açığa çıkarın ve intravasküler dolaşımdaki kan hücrelerini çıkarmak için kalbi buz gibi, steril PBS ile perfüze edin. Sonra kafasını tutun ve kafatasını ortaya çıkarmak için beynin orta hattı boyunca cildi makasla kesin. Daha sonra, kafatasının arkasını iki taraflı olarak ve göz yuvaları arasında küçük bir makasla kesin. Kafatasını sagital sütür boyunca kesin ve kafatasını cımbızla çıkarın. Bundan sonra, beyin dokusunu hızlı bir şekilde çıkarın. Şimdi, beyin dokusunu buz gibi soğuk PBS içeren 10 santimetrelik kültür kaplarına yerleştirin. Serebral korteksi cımbızla iki taraflı olarak inceleyin. Hipokampal dokuyu izole edin ve daha küçük parçalara ayırın. Parçaları 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra küçük hipokampal doku parçalarını iki mililitre buz gibi Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi veya HBSS içinde yeniden süspanse edin. Ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, hipokampal doku parçalarını içeren 15 mililitrelik santrifüj tüpüne 1.950 mikrolitre enzim karışımı ekleyin. Santrifüj tüpünü 37 santigrat derecelik bir su banyosunda beş dakika boyunca sürekli olarak çalkalayın. Daha sonra, 15 mililitrelik santrifüj tüpüne 30 mikrolitre taze hazırlanmış enzim karışımı ekleyin. Doku parçalarını bir mililitrelik pipet ucuyla 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve 37 santigrat derecede sürekli çalkalayarak beş dakika boyunca bir su banyosunda inkübe edin. Santrifüj tüpünü çıkardıktan sonra, süspansiyonu bir mililitrelik pipetle büyük doku parçaları kalmayana kadar birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra hücre süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir hücre tarama filtresinden süzün ve süzüntüyü temiz bir 50 mililitrelik santrifüj tüpünde toplayın. Süzüntüyü yeni bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Ardından süpernatanı bir mililitrelik bir pipetle atın. Şimdi, hücre süspansiyonunu yıkamak için 15 mililitre HBSS ile 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletini bir mililitre manyetik olarak aktive edilmiş hücre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin. Başlamak için, hazırlanan tek hücreli süspansiyonun bir mililitresini iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve dört santigrat derecede üç dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Süpernatan çıkarıldıktan sonra, tek hücreli peleti 90 mikrolitre manyetik ile aktive edilmiş hücre sıralamasında veya maksimum tamponda yeniden askıya alın. 10 mikrolitre CD11b veya c mikro boncuk ekleyin ve süspansiyonu yatay bir çalkalayıcı üzerinde 15 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ardından, tek hücreli süspansiyonu yıkamak için doğrudan tüpe bir mililitre maksimum tampon ekleyin. Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini 500 mikrolitre maksimum tamponda yeniden askıya alın. Bir mililitrelik bir pipet kullanarak, yeniden askıya alınmış hücre süspansiyonunu manyetik alandaki sıralama sütununa aktarın. Manyetik alanda kalırken, sütunu 500 mikrolitre maksimum tampon ile üç kez yıkayın. Ardından sıralama sütununu manyetik alandan çıkarın. Kolona bir mililitre maksimum tampon ekleyin ve pistonla yavaşça itin. Akışı toplayın. Şimdi, seçilen hücreleri, Poli-L-lizin ile kaplanmış bir örtü kayma içeren 24 oyuklu bir plakaya tohumlayın. 200 mikrolitre kültür ortamı ekleyin ve %95 oksijen, %5 karbondioksit ve %60 ila 80 nem içeren 37 derecelik bir inkübatörde 20 dakika inkübe edin. Başlamak için, farelerin beyin dokusundan izole edilen kültürlenmiş mikroglia'yı alın. 40x objektifi kullanarak küresel mikrogliayı bir su mikroskobu altında bulun. Ardından, elektrodu hücre içi çözelti ile doldurun ve elektrofizyoloji kurulumunun amplifikatör kafası aşamasına takın. Pozitif basınç uygulayın. 4x objektife geçin ve elektrodu bulun. Ardından elektrodu banyo çözeltisine indirin. Membran testini banyo modunda gerçekleştirmek için amplifikatörü voltaj kelepçesi moduna ayarlayın. Bundan sonra, 40x hedefine geri dönün ve elektrot ucunu mikrogliaya yaklaştırın. Ardından, hücreyi tutmak için küçük bir negatif basınç uygulayın. Direnç 100 megaohm'a ulaştığında, membran testinde banyodan yama moduna geçin. Direnç 300 megaohm'a ulaştığında, negatif basıncı serbest bırakın. Direnç, elektrot ve mikroglial membran arasında giga-ohm'luk bir conta oluşumunu gösterdiğinde. Membran testinde yamadan hücre moduna geçin. Daha sonra az miktarda emme uygulayın ve zarı yırtmak için bir elektrik çarpması başlatın. Bundan sonra voltaj kelepçesi moduna geçin, kayıt programını açın ve 200 milisaniye boyunca potasyum akımlarını kaydedin.