NMR Bazlı Metabolomikler Kullanılarak Kritik Hastalarda Düzensiz Metabolitlerin Tanımlanması ve Miktar Tayini

Araştırmamız, kritik yoğun bakım hastalarında değişen düzensiz metabolitleri ve biyokimyasal yolları tanımlamak için NMR tabanlı metabolomikler kullanıyor ve ayrıca ciddi bir akciğer rahatsızlığı olan ARDS hastalarını da dahil ettik. Metabolik imzaların profilini çıkararak ve karşılaştırarak, hastalığın ilerlemesiyle bağlantılı biyokimyasal bozuklukları ortaya çıkarmayı ve sonuçları iyileştirmek için tedavileri özelleştirmeyi amaçlıyoruz. Aslında, hafif, orta ve şiddetli ARDS hastalarını içeren tüm ARDS hasta kategorilerinde metabolik düzensizliği anlamadaki boşluğu ele almaya çalışıyoruz.

İçgörülerimizi geliştirmek, hastalığın daha iyi anlaşılması için, ilerlemesi için, hassas ve kişiselleştirilmiş tıp sağlayarak hasta sonucunu iyileştirmek amacıyla genel olarak. NMR, kolay numune hazırlama, yeniden analiz için serum bütünlüğünü koruma ve kimyasal türevlendirme olmadan bilinen ve bilinmeyen metabolitleri tespit etme imkanı sunar. Tekrarlanabilir, nicel veriler sağlayarak güvenilir metabolit ölçümü sağlar.

Hedeflenen yaklaşımların aksine, NMR, metabolik değişikliklerin hassas, tarafsız bir şekilde araştırılmasını sağlayarak, hastalığın ilerlemesindeki imzaları ve yolları keşfetmek için ideal hale getirir. Bulgularımız, yeterince çalışılmamış olan farklı aşamalardaki metabolik değişiklikleri ortaya çıkararak ARDS araştırmalarını geliştirecektir. NMR tabanlı metabolomikleri kullanarak, erken tanı, prognoz, daha zamanında tahmin ve tedaviler için potansiyel imzalara yol açan düzensiz metabolitleri ve yolakları tanımlamayı amaçlıyoruz.

Bu yaklaşım, kişiselleştirilmiş yönetimi geliştirir ve çok durumlu metabolik profil oluşturmadaki bilgileri derinleştirir. Sonuçlarımız, aşağıdaki gibi yeni bilimsel soruların önünü açtı: ARDS'nin farklı aşamalarında tanımlanan spesifik metabolitler hastalık ilerlemelerini nasıl etkiler? Bu düzensiz yollar erken terapötik müdahaleler için hedeflenebilir mi?

Ek olarak, bu metabolik değişiklikler diğer solunum veya enflamatuar durumlar arasında nasıl değişir? Başlamak için, steril bir iğne kullanarak, hafif veya orta derecede akut solunum sıkıntısı sendromu veya ARDS teşhisi konan bir hastanın arterlerinden iki mililitre kan toplayın. Kanı steril bir şişeye aktarın ve oda sıcaklığında 30 dakika pıhtılaşmasına izin verin.

Serumu ayırmak için pıhtılaşmış kanı 3, 100 G'de 15 dakika santrifüj edin. Serumu steril mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve 400 ila 500 mikrolitrelik alikotlar yapın. Tüpleri hastanın detaylarıyla etiketleyin ve 80 santigrat derecede saklayın.

NMR deneyleri için, pH değişimini en aza indirmek için 250 mikrolitre serum alikotunu 250 mikrolitre tuzlu fosfat tamponu ile karıştırın. Homojen bir karışım sağlamak için karışımı yaklaşık 15 saniye vorteksleyin. Hazırlanan numuneyi, 0.05 milimolar konsantrasyonda TSP içeren bir koaksiyel insert ile temiz bir NMR tüpüne aktarın.

Ardından, NMR tüpünü mıknatısın içine yerleştirin. CPMG nabız programı ile bir proton deneyi ayarlamak için WRPA yazın ve uygun deney numarasını seçin. Hastanın adını ve diğer gerekli ayrıntıları girmek için Başlık seçeneğine tıklayın.

Manyetik alanı kilitlemek için lock yazın ve Enter'a basın. Ardından, %90 su ve %10 döteryum oksit seçeneklerini seçin. Ardından, probun ayarını ve eşleştirmesini gerçekleştirmek için ATMM yazın ve Enter'a basın.

Ardından, Edinme Parametreleri seçeneğinden, optimizasyon verilerini toplamak için parametreleri 128 taramada 64.000 puan olarak seçin. Beş saniyelik gevşeme gecikmesini, 12 PPM'lik spektral tarama genişliğini ve 300 kez tekrarlanan 200 mikrosaniyelik yankı süresini ayarlayın. Üstel pencere işlevi kullanarak 0,3 hertz'lik satır genişletme uygulayın.

Ardından, NMR işleme ve analiz araçlarını kullanarak NMR spektrumlarını elde edin. Son spektrumlar elde edildikten sonra, sırasıyla faz düzeltmesi ve taban çizgisi düzeltmesi yapmak için APK ve ABSN yazın. Ardından, üst paneldeki Ekseni Kalibre Et seçeneğine tıklayın ve TSP tepe noktasını otomatik veya manuel olarak 0 PPM'ye kalibre edin.

Son olarak, daha fazla analiz için elde edilen verileri NMR sisteminden iş istasyonuna aktarın. Hafif veya orta şiddette ARDS tanısı alan hastaların NMR spektrumlarını aldıktan sonra, veri işleme için NMR metabolit kantifikasyon yazılımını açın. Whitaker yöntemini kullanarak manuel taban çizgisi düzeltmesi yapmak için, NMR metabolit niceleme yazılımının işlemci modülünde spektral dosyayı açın.

Taban çizgisi düzeltmesi'ni seçin, ardından Whitaker yöntemini seçin. Tüm spektrumlardaki zirvelerin tabanına noktalar yerleştirin. Tamamlandığında, taban çizgisi düzeltilmiş spektral dosyaları tek bir klasöre kaydedin.

Ardından, Profil Oluşturucu modülünü kullanarak spektral gruplama gerçekleştirmek için Araçlar'ı, ardından Toplu İşlem'i ve ardından Spektral Gruplama'yı seçin. İstatistiksel analiz için son gruplama sayfasını oluşturmak için, tüm taban çizgisi düzeltilmiş spektral dosyaların bulunduğu klasörü seçin. Spektrumları, milyonda 0,01 ila 0,04 parça arasında değişen tanımlanmış bir spektral genişliğe sahip eşit boyutlu kutulara bölün.

Klasör boyutunu ve başlangıç ve bitiş PPM değerlerini belirtin. Çıktı gruplama sayfalarını kaydetmek için bir klasör seçin. Spektral paraziti önlemek için suya ve çözücü TSP'ye karşılık gelen kimyasal kayma bölgelerini hariç tutun.

Son elektronik tablo, bir satırda örnek adları ve diğer satırlarda karşılık gelen PPM ile bölme değerlerini görüntüler. İstatistiksel analiz gerçekleştirmeden önce, bazı normalleştirme, günlük dönüşümü ve Pareto ölçeklendirmesi kullanarak verileri normalleştirin. Çok değişkenli analiz için, gruplar arasındaki ayrımı gözlemlemek için Temel Bileşen Analizi, Kısmi En Küçük Kareler Diskriminant Analizi ve Ortogonal Kısmi En Küçük Kareler Diskriminant Analizi gerçekleştirin ve metabolik profildeki farktan sorumlu her metabolit için projeksiyon puanlarının değişken önemini elde edin.

P değeri 0.05'ten düşük olan önemli metabolitleri tanımlamak için Student t-testini gerçekleştirin. T-testleri, metabolit konsantrasyonlarındaki farklılıkları gösteren kutu bıyık grafikleri üretir. Ardından, alıcı çalışma karakteristik eğrisi grafiğinin altında bir alan oluşturmak için biyobelirteç analizi yapın.

Birden büyük projeksiyon puanının değişken önemine, 0.05'ten küçük bir Bonferroni düzeltilmiş p değerine ve 0.8'den büyük eğrinin altındaki bir alana dayalı olarak önemli metabolitlerin son listesini seçin. İnsan Metabolom Veritabanını kullanarak, belirli PPM değerlerine karşılık gelen metabolitleri tanımlayın. Kuantifikasyona başlamadan önce, işlemci modülünü kullanarak, etüt için seçilen referans bileşiği kalibre edin.

Kimyasal Değişim Göstergesini Kalibre Et seçeneğine tıklayın ve referans bileşiğin konsantrasyonunu girin. Yazılım tepe noktasını spektral referans tepe noktasına sürükleyin ve yüksekliğini ve genişliğini ayarlayın. Spektral referans tepe noktaları yazılımın tepe noktasıyla hizalandığında, Kabul Et'e tıklayın.

Ardından, Profil Oluşturucu modülünde istediğiniz spektrumu açın ve çalışma için uygun bileşik kitaplığı seçin. Ekranın alt kısmında, metabolitlerin bir listesi görüntülenecektir. Listeden ilgilenilen metaboliti seçin.

Ekranın üst köşesindeki PPM değerine tıklayın. Spektrumları metabolitin spesifik PPM ölçeğine yakınlaştırın. Bu noktada, ekranda biri kaydedilen verileri temsil eden, diğeri ise yazılım tepe noktasını temsil eden noktalı bir çizgi olarak gösterilen iki tepe noktası belirir.

Kaydedilen tepe noktasıyla hizalamak için yazılım tepe noktasını sürükleyin, yüksekliği ve konumu eşleşecek şekilde ayarlayın. Tepe noktaları düzgün bir şekilde hizalandıktan sonra, milimolar cinsinden konsantrasyon başlığı altında görüntülenen değerden metabolitin konsantrasyonunu okuyun. Çıktı dosyasını oluşturmak için, Araçlar menüsü altında, Toplu İşlemler seçeneğine tıklayın ve çıktı dosyasını kaydetmek için istediğiniz klasörü belirtin.

Temel Bileşen Analizi, hafif ve orta şiddette ARDS hasta grupları arasında belirgin bir kümelenme gösterdi. Ortogonal Kısmi En Küçük Kareler Diskriminant Analizi, hafif ve orta ARDS grupları arasında net bir ayrım olduğunu ortaya koyarak metabolik farklılıkları vurguladı. Student'ın t-testi ve biyobelirteç analizi, hafif ve orta şiddette ARDS arasında anahtar disregüle metabolitleri ortaya çıkardı.

Laktat ve izolösin, ARDS şiddeti ile ilişkili olarak önemli ölçüde düzensiz metabolitler olarak tanımlandı.