Name: NMR Bazlı Metabolomikler Kullanılarak Kritik Hastalarda Düzensiz Metabolitlerin Tanımlanması ve Miktar Tayini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T14:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Keşfedin NMR bazlı metabolomikler kullanarak yoğun bakım hastalarında düzensiz metabolitleri ve biyokimyasal yolları tanımlama yöntemini. Bu yaklaşım ARDS şiddetini belirlemeye ve kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Etik onay (IEC kodu: 2022-71-PhD-126), Lucknow'daki Sanjay Gandhi Tıp Bilimleri Lisansüstü Enstitüsü (SGPGIMS) IEC'den alınmıştır. Çalışmanın gerçekleştirilmesi ve verilerin araştırma amaçlı yayınlanması için hasta veya yakınlarından yazılı ve bilgilendirilmiş onam alındı. Ayrıca, araştırma kurumsal yönergelere uygun olarak yürütülmüştür.
1. Çalışma tasarımı ve etik izin
<ol>
	<li>Her grup için örnek boyutunu belirleyin. Katılımcılar için seçim kriterlerini dikkatlice gözden geçirin ve oluşturun. Ek olarak, çalışma tasarımı insan veya hayvan örneklerinin dahil edilmesini gerektiriyorsa, örnek toplamaya başlamadan önce uygun kurumsal etik komiteden (IEC) etik izin alın.</li>
	<li>Arteriyel kandaki oksijenin kısmi basıncının (PaO2) solunan oksijen (FiO2) fraksiyonuna (P/F) oranına dayalı Berlin 2012 tanımının tanı kriterlerine göre hafif, orta ve şiddetli olarak kategorize edilen ARDS hastalarını seçin. P/F aralığı 300-200 arasında olan ARDS hastaları hafif, 200-100 yaş arası orta, 100'ün altı olanlar ise ağır olarak kabul edilir38. Burada hafif ve orta şiddette ARDS hastaları olmak üzere iki grup üzerinde yoğunlaştık (bakınız Tablo 1). NOT: Çalışma, NMR bazlı metabolomikleri gerçekleştirmek için kan örneklerinden elde edilen serumun kullanımını içermektedir. Bu çalışmada, referans olarak dahil edilen katılımcıların yaş ortalaması 42 (± 10.9 yıl) olup, cinsiyet dağılımı 2 erkek ve 6 kadındır.</li>
</ol>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kategori</td>
			<td>F/K oranı</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hafif</td>
			<td>300-200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ilımlı</td>
			<td>200-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Şiddetli</td>
			<td>100-0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: ARDS hastalarının kategorizasyonu.
2. Numune seçimi, toplanması ve işlenmesi
<ol>
	<li>Aşağıda açıklanan adımları izleyerek serum izolasyonu gerçekleştirin.<ol>
		<li>Deney için, düz (hiçbir katkı maddesi içermeyen) ve steril bir şişede steril bir iğne kullanarak arterlerden 2 mL kan örneği toplayın. Numuneyi oda sıcaklığında 30 dakika pıhtılaşmaya bırakın. Bu çalışma için hafif derecede ARDS tanısı alan 4 hasta ve orta derecede ARDS tanısı alan 4 hasta seçildi.</li>
		<li>Serumu25 ayırmak için numuneyi 3100 x g'da 15 dakika santrifüjleyin. Serumu steril mikrosantrifüj tüplerine aktarın, daha küçük hacimli (yani 400-500 μL) alikotlar yapın, uygun şekilde etiketleyin (Hasta adı, CR no., gün noktası, vb.) ve gelecekteki analizler için -80 ° C'de saklayın. NOT: Bu noktada, deney uygun bir zamanda duraklatılabilir ve devam ettirilebilir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aşağıdaki adımları kullanarak NMR deneylerinden önce serum örneğini işleyin.<ol>
		<li>NMR deneylerini gerçekleştirmeden önce numuneyi çözün. PH değişimini en aza indirmek için serumun 250 μL alikotunu 250 μL tuzlu fosfat tampon çözeltisi (% 100 D2O,% 0.9 NaCl, 50 mM sodyum fosfat tamponu, pH 7.4 içeren) ile karıştırın.</li>
		<li>Homojen bir şekilde karıştığından emin olmak için karışımı birkaç saniye (~ 15 sn) vorteksleyin. Son olarak, hazırlanan numuneyi, kalibrasyon ve miktar tayini için harici bir standart görevi gören 0,05 mM'lik bir konsantrasyonda trimetilsilil propiyonat (TSP) içeren bir koaksiyel ek parçaya sahip temiz bir NMR tüpüne aktarın41. NOT: Referans olarak, analitlerle etkileşime girmeyen inert ve reaktif olmayan bir bileşik kullanılır. Yaygın olarak kullanılan diğer referans bileşikler arasında Tetrametilsilan (TMS) ve sodyum trimetilsililpropansülfonat (DSS) bulunur.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. NMR deneyi
NOT: Odak noktası, serum örneklerindeki küçük molekülleri tanımlamaktır, bu nedenle, makromolekül sinyallerini baskılayan Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) darbe dizisini kullandık. Bu çalışmadaki tüm serum örnekleri, kriyojenik olarak soğutulmuş üçlü rezonans TCI 5 mm geniş bant ters prob kafası ve korumalı z-gradyanı ile donatılmış 800 MHz NMR spektrometresi kullanılarak kaydedildi.
<ol>
	<li>Numuneyi mıknatısın içine yerleştirin. cpmg nabız programı ile bir proton deneyi ayarlamak için wrpa (deney numarasını belirtin) komutunu yazın ve enter tuşuna basın. Başlık seçeneğine tıklayarak hastanın adını ve gerekli diğer ayrıntıları belirtin.</li>
	<li>Lock komutunu yazarak manyetik alanı kilitleyin, enter tuşuna basın ve</li><li></li><li></li><li></li><li> </li></ol><ol><li><ol><li></li><li></li><li></li></ol></li><li><li><li></li><li> </li></ol><ol><li></li><li><ol><li><li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></ol></li></ol><ol><li></li><li><li><li></li><li><li></li><li></li></ol><ol><li><li></li><li><li></ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67319/67319fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67319/67319fig01large.jpg" target="_blank"></a>

<meta charset="utf8"></head><body>Düzensiz Metabolitleri Tanımlamak için NMR Spektroskopisi Kullanan Metabolomik

<table><tbody><tr><td>Centirfuge</td><td>Sigma aldrich</td><td>3-18KS</td><td></td></tr><tr><td>Chenomx NMR süiti&nbsp;</td><td>NMR Suite, v9, Chenomx Inc., Edmonton, Kanada</td><td></td><td>NMR metabolit miktar tayin yazılımı</td></tr><tr><td>Koaksiyel kesici uç</td><td>Sigma aldrich</td><td>Z278513</td><td></td></tr><tr><td>Deuterim oksit</td><td>Sigma aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tüpleri</td><td>Tarsons</td><td>500020</td><td></td></tr><tr><td>Metaboanalyst</td><td>Wishart Araştırma Grubu</td><td></td><td>Metabolomik istatistiksel analiz yazılımı</td></tr><tr><td>NMR tüp</td><td>Wilmad</td><td>Z412007</td><td>5mm çaplı</td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Eppendorf araştırma artı</td><td>3123000039</td><td>0-100 &mu; l</td></tr><tr><td>Örnek toplama</td><td>şişeleri Tarsons cryo chill şişeleri</td><td>523194</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür kristali</td><td>Sigma aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik</td><td>Sigma aldrich</td><td>567550</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik</td><td>Sigma aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Topspin 3.6.4</td><td>Bruker</td><td></td><td>NMR işleme ve analiz aracı</td></tr><tr><td>Tsp tuzu</td><td>Sigma aldrich</td><td>269913</td><td></td></tr></tbody></table>

nmr bazlı metabolomikler kullanılarak kritik hastalarda düzensiz metabolitlerin tanımlanması ve miktar tayini

Identification and Quantification of Deranged Metabolites in Critically Ill Patients Using NMR-Based Metabolomics

Bir metabolomik çalışma yapmak için, örneklem büyüklüğünü ve analiz edilecek spesifik grupları belirlemek önemlidir. Hastalık şiddeti48 ile doğru bir şekilde ilişkili olan önemli sonuçlar elde etmek için yeterli bir örneklem büyüklüğünün seçilmesi esastır. Bununla birlikte, bu özel çalışmada, öncelikle referans amaçlı olan NMR bazlı metabolomikler kullanılarak metabolitlerin tanımlanması ve miktarının belirlenmesinde yer alan adımları göstermek için küçük bir örneklem boyutu kullandık. Bu çalışmada, YBÜ'ye yatışlarının 1. gününde ARDS'nin hafif ve orta evrelerindeki hastalar arasındaki metabolik farklılıkları toplam 8 denek dahil olmak üzere inceledik. Protokolün ardından, tüm numunelerin NMR spektrumları alındı ve işlendi ve sonunda gruplama sonuçlarıyla bir elektronik tablo oluşturuldu.
Daha sonra, gruplama sayfalarının giriş dosyaları olarak kullanıldığı ve sum, log ve Pareto kullanarak verileri normalleştiren titiz bir istatistiksel analiz gerçekleştirdik. PCA (Şekil 2A) ve OPLS-DA (Şekil 2B) gerçekleştirdik, burada birincisi kümelenme gösterdi, ancak ikincisi gruplar arasında net bir ayrım olduğunu ortaya koydu ve metabolik farklılıkları vurguladı. Permütasyon testi istatistiksel analizi (20x) R2Y=0.99 ve Q2=0.47 değerlerini verdi. Daha sonra, düzensiz metabolitleri tanımlamak için bir öğrencinin t-testi (Şekil 2C) ve biyobelirteç analizi (Şekil 2D) gerçekleştirdik. Protokol bölümünde belirtilen kriterleri takiben, sonuçları önemli metabolitlere göre filtreledik (Tablo 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67319/67319fig02.jpg"> 
Şekil 2: Çok değişkenli ve tek değişkenli analiz. (A) Hafif ARDS hastalarının (kırmızı renkle temsil edilir) ve orta ARDS hastalarının (yeşil renkle temsil edilir) ortogonal kısmi en küçük kareler diskriminant analizi (OPLS-DA). (C) Kutu-cum-bıyık çizimleri, serum örneklerinde proton nükleer manyetik rezonans spektroskopisi ile tespit edilen hafif ve orta dereceli ARDS hastaları arasındaki metabolitlerin nispi konsantrasyonundaki farklılıkları vurgulamaktadır. X ekseni çalışma gruplarını temsil eder ve y ekseni, hafif ARDS hastaları (kırmızı renkle temsil edilir) ve orta ARDS hastaları (yeşil renkle temsil edilir) yoğun bakım ünitesine kabulün 1. gününde karşılaştırıldığında nispi konsantrasyonu gösterir. (D) Yoğun bakım ünitesine kabulün 1. gününde hafif ve orta şiddette ARDS hastalarını karşılaştıran biyobelirteç analizi yapıldıktan sonra elde edilen şiddeti öngören önemli metabolitlerin eğri altındaki alan (AUC) grafiği. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67319/67319fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>S.No.</td>
			<td>Ad</td>
			<td>Spektral konum (ppm)</td>
			<td>p-değeri</td>
			<td>VIP</td>
			<td>AUC değeri</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Laktat</td>
			<td>1.34</td>
			<td>0.04</td>
			<td>1.99</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>İzolösin</td>
			<td>1.42</td>
			<td>0.03</td>
			<td>2.01</td>
			<td>0.875</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 2: Yoğun bakım ünitesine kabulün 1. gününde hafif ve orta şiddette ARDS hastaları karşılaştırıldıktan sonra elde edilen önemli metabolitlerin listesi.
Sonuçlar ppm değerlerinde elde edildiğinden, önceki literatürü kullanarak metabolitleri atadık ve bunları profilleyici aracılığıyla doğruladık. Atamadan sonra, laktat ve izolösin önemli metabolitler olarak elde edildi ve bunlar daha önceki bazı ARDS çalışmalarında da bildirilmiştir30,40. İyi çözümlenmiş, örtüşmeyen tepe noktalarının seçimini sağladık. Tanımlamadan sonra, protokolde belirtilen kriterleri kullanarak önemli metabolitlerin listesini filtreledik. Daha sonra, spektrumları açarak, ilgilenilen metaboliti arayarak ve yazılım zirvesini spektrumlarda elde edilen zirveye uydurarak profil oluşturucu modülünü kullanarak ilgilenilen metabolitleri ölçtük. Bu, mM cinsinden metabolitlerin niceliksel değerlerini sağladı. Referans için numune adlarını, metabolit adlarını ve konsantrasyonları içeren bir elektronik tablo oluşturuldu. Yazılımla miktar tayininden sonra, proteomik gibi diğer yaklaşımlarla doğrulama gerçekleştirilebilir.
Ayrıca, tanımlanan metabolitler, hastalık şiddeti ile korelasyonlarını belirlemek ve bu metabolitlerin aktif olarak yer aldığı biyokimyasal yolakları belirlemek için kapsamlı bir şekilde analiz edilir. Gereç ve yöntem bölümünde belirtilen kriterler kullanıldıktan sonra sadece iki anlamlı metabolit tanımlandığından, yazılım kullanılarak yolak analizi mümkün olmamıştır. Bu nedenle, düzensiz metabolik döngüleri vurgulamak için kapsamlı bir literatür taraması yapılmıştır. Bu çalışmada tanımlanan iki metabolit, ARDS'nin şiddeti ile başarılı bir şekilde korelasyon gösterdi. Artan laktat, akciğer iltihabını ve anaerobik solunumu gösterirken, artan izolösin, akciğer hasarı, enfeksiyon ve enerji metabolizması ile ilişkili protein katabolizmasını gösterdi40. Bu metabolik yolları anlamak ikili bir amaca hizmet eder. İlk olarak, hastalığın karmaşıklığını ortaya çıkarır ve biyolojik mekanizmaları hakkında fikir verir. İkinci olarak, klinisyenlere tedavileri hastalara göre uyarlamada rehberlik ederek ve sonuçta klinik sonuçları iyileştirerek terapötik ilerlemelere yardımcı olur.

NMR Bazlı Metabolomikler Kullanılarak Kritik Hastalarda Düzensiz Metabolitlerin Tanımlanması ve Miktar Tayini

Metabolomics is emerging as a significant approach to reflect the individual's response to pathophysiological conditions. Nuclear magnetic resonance (NMR) ...

identification-quantification-deranged-metabolites-critically-ill

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Mikrobiyal planktonik toplulukların metaboliti çıkarımı için bir yöntem sunulmaktadır. Tüm topluluk örnekleme özel hazırlanmış filtreler üzerine filtrasyon sağlanır. Liyofilizasyon sonra, sulu çözünür metabolitleri ekstre edilir. Bu yaklaşım doğal ya da deneysel mikrobiyal toplulukların trans-omik araştırmalar çevre metabolomik uygulaması için izin verir.

Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Çevre metabolomik için düşük yoğunluklu Planktonik topluluklardan Metabolitlerinin Konsantrasyon

İlerici bir kolonizasyon prosedürü daha ev sahipliği karaciğer metabolizması üzerine olan etkisini değerlendirmek için tarif edilir. Yüksek Çözünürlüklü Magic Angle İplik (İK MAS) bozulmamış biyopsi NMR profil hepatik metabolizma tarafından değerlendirilir Kolonizasyon NMR tabanlı metabolik profil mikrobiyal co-metabolitleri idrar atılımı değerlendirerek invazif olmayan izlenir.

Germ-free Mouse Aşamalı Kolonizasyon sırasında Karaciğer metabolik değişiklikler Değerlendirilmesi 1 H-NMR Spektroskopi

Metabolit profil sağlık ve hastalık metabolizmanın çalışmasında değerli bir varlık olmuştur. Polarizasyon değiştirmesi ve hızlı görev döngüsü ile yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi birleştiğinde normal aşamalı sıvı kromatografisi kullanarak, yüksek hassasiyet, doğruluk ve çözünürlük ile biyolojik madde polar metabolik bileşimini analiz etmek için bir protokol açıklar.

Hassas, Büyük Ölçekli Kantitatif metabolomik için bir strateji

Memeli beyninin nörokimyası birçok nörolojik ve sistemik hastalıkta değişmiştir. Serebral metabolitlerin karakteristik profilleri, beyin dokusunun ham ekstraktlarına dayalı olarak verimli bir şekilde elde edilebilir. Bu amaçla, metabolit konsantrasyonlarının (metabolomikler) ayrıntılı kantitatif analizini sağlayan yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi kullanılır.

Doku Esansı Yüksek Çözünürlük Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Sıçan Beyin metabolomic Analizi

Bu makale, bitkilerin metabolik profillemesinde PSYCHE ve SAPPHIRE-PSYCHE'nin kullanımını sunmakta ve numune hazırlama ve optimal Pure Shift NMR spektrum kaydı için ayrıntılı prosedürleri içermektedir. Homonükleer ayrışma ile elde edilen çözünürlük kazancının, sistemin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına izin verdiği örnekler tartışılmaktadır.

Saf Vardiya Nükleer Manyetik Rezonans: Bitki Metabolomikleri için Yeni Bir Araç

XY-Meta ve metaX'i birbirine entegre eden hedefsiz bir metabolomik iş akışı oluşturduk. Bu protokolde, açık erişim spektrumu referansından bir aldatmaca spektral kütüphanesi oluşturmak için XY-Meta'nın nasıl kullanılacağını gösterdik ve daha sonra FDR kontrolünü gerçekleştirdik ve metabolomik spektrumları tanımladıktan sonra metabolitleri ölçmek için metaX'i kullandık.

FDR Kontrol Tabanlı Hedefsiz Metabolom Üzerinde Entegre Bir Tanımlama ve Niceleme İş Akışı

Bu protokol, canlı hücrelerde gerçek zamanlı piruvat metabolizmasını ölçmek için özel olarak oluşturulmuş bir biyoreaktör sistemini hiperpolarize ¹³C NMR spektroskopisi ile entegre ederek metabolik çalışmalar ve ilaç tarama uygulamaları için tekrarlanabilirliği ve kinetik doğruluğu artırır.

Hiperpolarize 13C NMR kullanarak canlı hücrelerde gerçek zamanlı metabolik tespit

Bir moleküler marker olarak γH2AX oluşumu kullanarak DNA çift iplikli çizgiler Niceleme radyasyon biyoloji paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada hücreler radyasyona maruz kaldıktan sonra γH2AX odakları ölçümü için immünofloresan testinin kullanımını göstermek.

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

Üreaz yöntemi aracı metabolitlerin GC / MS analizi için numune hazırlama, mucit tarafından sunulmaktadır. Bu yöntem, bir adım, tek bir süreç niceleme karbonhidratlar, organik ve amino asitler tandem kütle spektrometresi ile doğumsal yenidoğan tarama takip.

Bir adım metabolomik: Karbonhidratlar, Tek Bir Usul Sayısallaştırılmış Organik ve Amino Asitler

Metabolizma aracılığıyla genomik, co-geni ifade analizi ve hedef bileşiklerin tanımlama kombinasyonu genin işlevsel bir açıklama verir.

Kombine Genomics metabolomiks ve Bilişim ile Bitki Gen Fonksiyonu ek açıklama

Keşfedin NMR bazlı metabolomikler kullanarak yoğun bakım hastalarında düzensiz metabolitleri ve biyokimyasal yolları tanımlama yöntemini. Bu yaklaşım ARDS şiddetini belirlemeye ve kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

NMR Bazlı Metabolomikler Kullanılarak Kritik Hastalarda Düzensiz Metabolitlerin Tanımlanması ve Miktar Tayini

Daha fazla video keşfet