Name: 2D-TAU Jel Elektroforezi Kullanılarak Histon Proteoformlarının Ortaya Çıkarılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Keşfedin histon proteoformlarının 2D-TAU jel elektroforezi ile karakterizasyonunu. Bu yöntem, epigenetik değişiklikler ve metabolik yeniden yapılanma arasındaki ilişkiyi anlamak için kanser tedavisinde yeni terapötik hedefler belirlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Histon İzoform Zenginleştirme ve PTM Karakterizasyonu için 2D Jel Ayırma

<ol><li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li>
<li>Cutter, A. R., Hayes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+review+of+nucleosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A brief review of nucleosome structure.</a> FEBS Lett. 589 (20 Pt A), 2914-2922 (2015).</li>
<li>Millán-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+post-translational+modifications+-+cause+and+consequence+of+genome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function.</a> Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+and+epigenetic+modifications+on+the+path+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer.</a> Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).</li>
<li>Kinnaird, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+control+of+epigenetics+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metabolic control of epigenetics in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 16 (11), 694-707 (2016).</li>
<li>Díaz-Hirashi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+and+signaling+to+chromatin+modifications+in+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming and signaling to chromatin modifications in tumorigenesis.</a> Adv Exp Med Biol. 1219, 225-241 (2020).</li>
<li>Panatta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+by+p53+prevents+R-loop-associated+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation by p53 prevents R-loop-associated genomic instability.</a> Cell Rep. 41 (5), 111568(2022).</li>
<li>Scumaci, D., Zheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+meets+metabolism%3A+novel+vulnerabilities+to+fight+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Epigenetic meets metabolism: novel vulnerabilities to fight cancer.</a> Cell Commun Signal. 21 (1), 249(2023).</li>
<li>Chiaradonna, F., Scumaci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metabolism+as+a+new+real+target+in+tumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cancer metabolism as a new real target in tumor therapy.</a> Cells. 10 (6), 1393(2021).</li>
<li>Scumaci, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DJ-1+proteoforms+in+breast+cancer+cells%3A+The+escape+of+metabolic+epigenetic+misregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">DJ-1 proteoforms in breast cancer cells: The escape of metabolic epigenetic misregulation.</a> Cells. 9 (9), 1968(2020).</li>
<li>Olivo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+beyond+the+tip+of+the+iceberg%3A+DJ-1+implications+in+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Moving beyond the tip of the iceberg: DJ-1 implications in cancer metabolism.</a> Cells. 11 (9), 1432(2022).</li>
<li>Zheng, Q., Maksimovic, I., Upad, A., David, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-enzymatic+covalent+modifications%3A+a+new+link+between+metabolism+and+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Non-enzymatic covalent modifications: a new link between metabolism and epigenetics.</a> Protein Cell. 11 (6), 401-416 (2020).</li>
<li>Maksimovic, I., David, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-enzymatic+covalent+modifications+as+a+new+chapter+in+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Non-enzymatic covalent modifications as a new chapter in the histone code.</a> Trends Biochem Sci. 46 (9), 718-730 (2021).</li>
<li>Lowe, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3+mutations%3A+an+updated+view+of+their+role+in+chromatin+deregulation+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Histone H3 mutations: an updated view of their role in chromatin deregulation and cancer.</a> Cancers. 11 (5), 660(2019).</li>
<li>Karsli-Ceppioglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epigenetic+landscape+of+promoter+genome-wide+analysis+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The epigenetic landscape of promoter genome-wide analysis in breast cancer.</a> Sci Rep. 7 (1), 6597(2017).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methyltransferase+and+drug+resistance+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Histone methyltransferase and drug resistance in cancers.</a> J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 173(2020).</li>
<li>Vardabasso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+variants%3A+emerging+players+in+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Histone variants: emerging players in cancer biology.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (3), 379-404 (2014).</li>
<li>Ilango, S., Paital, B., Jayachandran, P., Padma, P. R., Nirmaladevi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+alterations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic alterations in cancer.</a> Front Biosci. 25 (6), 1058-1109 (2020).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H2AX+promotes+metastatic+progression+by+preserving+glycolysis+via+hexokinase-2%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Histone H2AX promotes metastatic progression by preserving glycolysis via hexokinase-2.</a> Sci Rep. 12 (1), 3758(2022).</li>
<li>Nowsheen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZNF506-dependent+positive+feedback+loop+regulates+H2AX+signaling+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ZNF506-dependent positive feedback loop regulates H2AX signaling after DNA damage.</a> Nat Commun. 9 (1), 2736(2018).</li>
<li>Ribeiro-Silva, C., Vermeulen, W., Lans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF%3A+Complex+complexes+in+genome+stability+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF: Complex complexes in genome stability and cancer.</a> DNA Repair. 77, 87-95 (2019).</li>
<li>Yang, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+epigenetic+regulation+in+plasticity+of+tumor+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of epigenetic regulation in plasticity of tumor immune microenvironment.</a> Front Immunol. 12, 640369(2021).</li>
<li>Miranda Furtado, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidrugs%3A+targeting+epigenetic+marks+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Epidrugs: targeting epigenetic marks in cancer treatment.</a> Epigenetics. 14 (12), 1164-1176 (2019).</li>
<li>Thomas, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+for+analysis+of+histone+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry%3A+best+practices+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide for analysis of histone post-translational modifications by mass spectrometry: best practices and pitfalls.</a> Methods. 184, 53-60 (2020).</li>
<li>Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+characterization+of+histones+in+clinical+samples%3A+applications%2C+progress%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges.</a> FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).</li>
<li>Kwak, H. G., Dohmae, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+histone+variants+in+the+mouse+testis+by+mass+spectrometry-based+top-down+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Trends%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of histone variants in the mouse testis by mass spectrometry-based top-down analysis.</a> Biosci Trends. 10, 357-364 (2016).</li>
<li>Sidoli, S., Simithy, J., Karch, K. R., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+resolution+data-independent+acquisition+in+an+LTQ-Orbitrap+allows+for+simplified+and+fully+untargeted+analysis+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-Orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications.</a> Anal Chem. 87, 11448-11454 (2015).</li>
<li>Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction%2C+purification+and+analysis+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Extraction, purification and analysis of histones.</a> Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).</li>
<li>Basak, S. K., Ladisch, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+electrophoretic+mobilities+of+proteins+and+peptides+with+their+physicochemical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Correlation of electrophoretic mobilities of proteins and peptides with their physicochemical properties.</a> Anal Biochem. 226 (1), 51-58 (1995).</li>
<li>Nuccio, A. G., Bui, M., Dalal, Y., Nita-Lazar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+methodology+for+identification+of+native+histone+variant+modifications+from+mammalian+tissues+and+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based methodology for identification of native histone variant modifications from mammalian tissues and solid tumors.</a> Methods Enzymol. 586, 275-290 (2017).</li>
<li>Zhang, S., Roche, K., Nasheuer, H. P., Lowndes, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+histones+by+sugar+%CE%B2-N-acetylglucosamine+%28GlcNAc%29+occurs+on+multiple+residues%2C+including+histone+H3+serine+10%2C+and+is+cell+cycle-regulated%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Modification of histones by sugar β-N-acetylglucosamine (GlcNAc) occurs on multiple residues, including histone H3 serine 10, and is cell cycle-regulated.</a> J Biol Chem. 286 (43), 37483-37495 (2011).</li>
<li>Perri, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+proteomics+reveals+novel+post-translational+modifications+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Histone proteomics reveals novel post-translational modifications in breast cancer.</a> Aging. 11, 11722-11755 (2019).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Omenn, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+the+human+proteome+reaches+a+major+milestone%3A+%3E90%25+of+predicted+human+proteins+now+credibly+detected%2C+according+to+the+HUPO+human+proteome+project%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Research on the human proteome reaches a major milestone: >90% of predicted human proteins now credibly detected, according to the HUPO human proteome project.</a> J Proteome Res. 19 (12), 4735-4746 (2020).</li>
<li>Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+characterization+of+histones+in+clinical+samples%3A+applications%2C+progress%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges.</a> FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).</li>
<li>Starkova, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+profile+of+post-translational+modifications+of+histone+H1+in+chromatin+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">The profile of post-translational modifications of histone H1 in chromatin of mouse embryonic stem cells.</a> Acta Naturae. 11 (2), 82-91 (2019).</li>
<li>García-Giménez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+carbonylation+occurs+in+proliferating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Histone carbonylation occurs in proliferating cells.</a> Free Radic Biol Med. 52 (8), 1453-1464 (2012).</li>
<li>García-Saura, A. G., Schüler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP10+multi-site+auto-+and+histone+MARylation+visualized+by+acid-urea+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">PARP10 multi-site auto- and histone MARylation visualized by acid-urea gel electrophoresis.</a> Cells. 10, 654(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,4-Ditiyoeritritol</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>D8255&nbsp;</td><td>Bakım için reaktif &eksi; İndirgenmiş durumdaki SH grupları; disülfidleri kantitatif olarak azaltır.</td></tr><tr><td>1,5 M Tris-HCL tamponu, pH 8.8</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0798</td><td>Çözünen Jel Tamponu</td></tr><tr><td>10x Tris/Glisin/SDS&nbsp;</td><td>BİYO-RAD&nbsp;</td><td>1610772</td><td>Protein örneklerini SDS-PAGE ile ayırmak için bu önceden karıştırılmış 10x Tris/glisin/SDS çalışan tamponu kullanın.</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>33539</td><td>2-Propanol (İzopropanol) ikincil bir alkoldür. Çeşitli yakıt hücrelerinde kullanım için yakıtın yerine geçecek şekilde test edilmiştir. 2-propanol içinde çözünen CuO tozu, Cu kolloidlerinin lazer ablasyon destekli sentezi için kullanılmıştır. Zn (NO3) 2 ile 2-propanolün süspansiyonu, düzgün kalınlıkta P25-TiO2 tabakası ile kaplanmış titanyum dioksit kaplı paslanmaz çelik (P25-TiO2 / SS) fotoanotun imalatı için kullanılmıştır.</td></tr><tr><td>%30 Akrilamid/Bis Solüsyonu&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1610158</td><td>%2.6 Çapraz bağlayıcıdır. Elektroforez saflık reaktifi&nbsp;</td></tr><tr><td>Asetik Asit Buzulu</td><td>Carlo Erba Reagennts</td><td>401392</td><td>Asetik asit, birçok endüstriyel uygulamaya sahip önemli bir kimyasal reaktiftir.</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Panreac Uygulaması</td><td>211007.1214</td><td>Aseton&nbsp; çeşitli laboratuvar, üretim ve temizleme uygulamalarında çok yönlülüğü ile tanınan bir çözücüdür.</td></tr><tr>HPLC için <td>Asetonitil</td><td>VWR</td><td>83640320</td><td>&nbsp; &nbsp; LC-MS sınıfı</td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td>Agaroz&nbsp; a&nbsp; heteropolisakkarit&nbsp; moleküler biyolojide sıklıkla kullanılır.</td></tr><tr><td>Amonyum bikarbonat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A6141</td><td>minimum %99,0</td></tr> <tr><td>Amonyum persülfat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A3678</td><td>Moleküler Biyoloji için, Elektroforez için, vb; %98 ve nbsp;</td></tr><tr><td>Bioruptor plus</td><td>Diagenode</td><td>B01020001 - B01020002- B01020003</td><td>sonikatör</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>D9163-5G</td><td>Proteinlerdeki disülfid bağlarını azaltmak için kullanılan indirgeyici ajan.</td></tr><tr><td>Dodeca Gümüş Leke Kiti&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0480</td><td>Dodeca gümüş leke kiti, poliakrilamid jellerdeki proteinlerin nonagram seviyelerinin tespiti için kullanımı kolaydır.</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>GE - Sağlık Yaşam Bilimleri</td><td>171325010L</td><td>Gliserol basit bir triol bileşiğidir, gradyan jellerin, protein stabilizatörünün ve depolama tamponu bileşeninin dökümüne yardımcı olmak için kullanılır.</td></tr><tr><td>Halt Fosfataz İnhibitörü&nbsp;</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>78428</td><td>Thermo Scientific Halt Fosfataz İnhibitörü Kokteyli, hücre lizizi veya doku proteini ekstraksiyonu sırasında ve sonrasında proteinlerin fosforilasyon durumunu korur&nbsp; Tek Kullanımlık Kokteyl (100X).&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Halt Proteaz İnhibitörü&nbsp;</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>78430</td><td>Thermo Scientific Halt Proteaz İnhibitör Kokteyli (100X), hücre lizisi ve protein ekstraksiyonu sırasında proteolitik bozulmayı önlemek için numunelere ilave olarak proteaz inhibitörlerinin kullanıma hazır konsantre stok çözeltileridir. Tek Kullanımlık Kokteyl (100X).&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr>Moleküler biyoloji için <td>hidroklorik asit</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H1758</td><td>BioReagent,</td></tr><tr><td>İyodoasetamid</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I6125</td><td>&ge; %99 (NMR), kristal</td></tr><tr><td>KCl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9541</td><td>Potasyum klorür, KCl, is&nbsp; Genellikle laboratuvar rutinlerinde kullanılır. pH elektrotları için bir depolama tamponu ve iletkenlik ölçümleri için bir referans çözelti olarak kullanımı iyi bilinmektedir.</td></tr><tr><td>MCF10 hücre hattı</td><td>atcc</td><td>CRL-10317&nbsp;</td><td>1984 yılında fibrokistik göğüsleri olan 36 yaşında beyaz bir kadının meme bezinden izole edilen epitel hücre hattı. Bu hücre dizisi Michigan Kanser Vakfı tarafından yatırıldı.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>208337</td><td>Magnezyum klorür renksiz kristal bir katıdır.</td></tr><tr><td>N, N, N', N'-Tetrametiletilen-diamin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T9281</td><td>Elektroforez için, yaklaşık% 99</td></tr> <tr><td>Fosfat salin tamponu 1X</td><td>Corning</td><td>15373631</td><td>1 X PBS (fosfat tamponlu salin) is&nbsp; arabelleğe alınmış&nbsp; Dengeli tuz çözeltisi&nbsp; Ayrışmadan önce hücrelerin yıkanması, hücrelerin veya dokunun taşınması, hücrelerin sayım için seyreltilmesi ve reaktiflerin hazırlanması gibi çeşitli biyolojik ve hücre kültürü uygulamaları için kullanılır.</td></tr><tr><td>Potasyum hekzasiyanoferrat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>60299</td><td>Elektron alıcısı, elektron taşınmasını içeren sistemlerde kullanılır,</td></tr> <tr><td>SDS Çözeltisi% 20 (a / h) &nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0418</td><td>Sodyum dodesil sülfat. Elektroforez saflık reaktifi&nbsp;</td></tr><tr><td>Sodyum tiyosülfat, ReagentPlus %99</td> <td>SIGMA-ALDRICH</td><td>21,726-3</td><td>Sodyum tiyosülfat, ReagentPlus %99</td></tr> <tr><td>Sülfürik asit</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>339741</td><td>Sülfürik Asit, Reaktif, is&nbsp; Sarımsı hafif viskoz sıvı olarak gelen son derece aşındırıcı bir asit. Suda çözünür ve diprotik bir asittir. Higroskopik olmasının yanı sıra çok güçlü aşındırıcı, dehidre edici ve oksitleyici özelliklere sahiptir.</td></tr><tr><td>Trikloroasetik asit</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T6399-5G</td><td>Trikloroasetik asit (TCA)&nbsp; proteinlerin 1,2 ve nükleik asitlerin 3.&nbsp;</td></tr><tr><td>Trifloroasetik asit</td><td>Riedel-de Ha&euml; n</td><td>34957</td><td>Trifloroasetik asit</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>T9284-1L</td><td>Triton X-100, proteinleri ekstrakte etmek ve çözündürmek için en sık kullanılan noniyonik bir polioksietilen yüzey aktif maddedir.</td></tr><tr><td>Domuz pankreasından elde edilen tripsin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T6567</td><td>Proteomik Sınıfı, BioReaktif, Dimetillenmiş</td></tr><tr><td>ÜRE</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>33247</td><td>Üre, kaotropik bir ajandır ve protein denatürasyonu için kullanılır. Proteinlerin ikincil, üçüncül ve dördüncül yapısındaki hidrojen bağlarını bozar. Ayrıca DNA'nın ikincil yapısında bulunan hidrojen bağını da bozabilir</td></tr></tbody></table>

2d-tau jel elektroforezi kullanılarak histon proteoformlarının ortaya Çıkarılması

Unveiling Histone Proteoforms using 2D-TAU Gel Electrophoresis

Şekil 1A'da, histon proteinlerinin 1D bir jel içinde nasıl göç ettiğini gözlemlemek mümkündür. Bu, ilk boyutun çalışma süresini anlamak için önemli bir ön adımdır. Doğru ayrılma zamanı belirlendikten sonra, ikinci boyutu çalıştırın. Histon proteoformlarının 2B haritası, belirgin bir topografik model gösterir (Şekil 1B). Şekil 1B'deki her nokta belirli bir histon tipini temsil eder. Her bir histon proteoformunun bulunabileceği jelin tam bölgesini gözlemleyin. Her histon proteoformu için kütle spektrometresi tanımlaması Perri ve ark.32'de rapor edilmiştir. Bu nedenle, bu durumdaki her nokta belirli bir histon tipi ile ilişkilidir. Kanonik olanların yanı sıra ek noktaların varlığı, yeni değişikliklerin varlığına işaret edebilir. Jel görüntüler dansitometri kullanılarak elde edilebilir ve elde edilen görüntü, görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edilebilir.
2D TAU haritasının güvenilirliği, noktanın yuvarlaklığına bağlıdır. Çalıştırma doğru bir şekilde gerçekleştirildiyse, noktalar farklı sinyaller olarak görünecek ve yatay ve dikey çizgiler görünmeyecektir. Tersine, numunedeki, çözeltilerdeki ve agaroz kaplamasındaki safsızlıklar jelde çizgilere ve/veya şeritlere neden olabilir. Jelin kalitesi, görüntü dijitalleştirmesini ve aşağıdaki nicel ve nitel analizi etkileyecektir. Ayrıca, Western Blot analizinin ve MS araştırmalarının başarısını etkileyebilir. Yöntemin güvenilirliğini doğrulamak için, birincil antikor Asetillenmiş-Lizin (Ac-K2-100) Tavşan mAb32 ile çözülmüş histon proteoformlarının nitroselüloz membranını inceledik (Şekil 2). Histon sinyallerini tespit etmek için bir anti-tavşan HRP ikincil antikoru kullanıldı. Beklendiği gibi, bir dansitometre kullanarak, lekede bulunan her bir histon varyantı üzerindeki tuhaf translasyon sonrası modifikasyonu ölçmek mümkündür.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67321/67321fig01.jpg"> 
Resim 1: 1D ve 2D TAUgel. (A) 1D TAUgel kullanılarak elde edilen histon topografik deseninin temsili görüntüsü. (B) 2D TAUgel kullanılarak elde edilen histonların topografik deseninin temsili görüntüsü. Veri tanımlamaları Perri ve ark. 32. Beklendiği gibi, her nokta belirli bir histon proteoformunu temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67321/67321fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67321/67321fig02.jpg"> 
Resim 2: Temsili 2DTAU Western blot. Görüntüde, her bir histon proteoformunda lizin asetilasyon seviyesini gözlemlemek mümkündür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67321/67321fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reaktif</td>
			<td>Konsantrasyon: </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>@ Akrilamid/Bis</td>
			<td>3.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5 m tris pH 8,8</td>
			<td>2,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ su</td>
			<td>3,6 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> SDS</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> APS</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED (TEMED)</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: Jel çözeltisi bileşiminin çözülmesi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adım</td>
			<td>Saat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P metanol / %5 asetik asit sabitleme</td>
			<td>1 saat,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>% 30 etanol yıkayın</td>
			<td>2 x 20 dk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deiyonize suyu yıkayın</td>
			<td>1 x 20 dk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hassaslaştırıcı Tiyosülfat reaktifi</td>
			<td>1 dk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deiyonize suyu yıkayın</td>
			<td>3 x 20 sn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gümüş Gümüş nitrat</td>
			<td>30 dk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deiyonize suyu yıkayın</td>
			<td>3 x 1 dk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geliştirme Geliştiricisi</td>
			<td>25-30 dk Not: Lekeler görünene kadar jeli geliştirin (açık kahverengi)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durdurma Çözümü</td>
			<td>1 x 10 dk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deiyonize suyu yıkayın</td>
			<td>2 x 5 dk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deiyonize suyu yıkayın</td>
			<td>1 saat,</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 2: Gümüş boyama yöntemi.

2D-TAU Jel Elektroforezi Kullanılarak Histon Proteoformlarının Ortaya Çıkarılması

Histones undergo various post-translational modifications (PTMs) such as methylation, acetylation, phosphorylation, acylation, and ubiquitination, which ...

unveiling-histone-proteoforms-using-2d-tau-gel-electrophoresis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video, kolorektal kanser hücrelerinde bir fosfataz testi ile tau proteininin fosforilasyon durumunu değerlendirmek için bir protokolü açıklar. Fosfataz enzimi, tau proteini üzerinde bulunan fosfat grupları üzerinde etki ederek, tedavi edilmemiş tau proteini örneklerine kıyasla tau proteininin SDS PAGE jeli üzerindeki hareketliliğini arttırır.

CRC Hücrelerinde Fosfataz Deneyi: Kolorektal Kanser Hücrelerinde Tau Proteininin Fosforilasyon Durumunu İncelemek İçin Bir Yöntem

Bu video, bir proteindeki çoklu fosforilasyonları tanımlamak için nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) tekniklerinin kullanımını göstermektedir. Bir proteinin spesifik amino asitte fosforilasyonu, komşu amid hidrojenin deshieldasyonuna neden olur ve bu da spektral farkı oluşturur.

Proteinlerdeki Çoklu Fosforilasyonları Tanımlamak için Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Kaynak: Bennett, S. A.,  ve diğerleri, Maya Nörodejeneratif Proteinopati Modellerinde Histon Translasyon Sonrası Modifikasyon Değişikliklerinin Karakterize Edilmesi. J. Vis. Uzm. (2019). Bu video, nörodejeneratif proteinleri aşırı eksprese eden maya hücrelerindeki histon modifikasyonlarını değerlendirme prosedürünü göstermektedir. Adımlar, hücre lizizi, santrifüjleme, elektroforez, membran transferi ve modifiye histonların antikor bazlı tespitini içerir.

Nörodejeneratif Protein Aşırı Ekspresyonu ile Maya Hücrelerinde Histon Modifikasyonlarının Saptanması

İnsan ve fare beyin dokusu için üre / tiyoüre / SDS tamponu kullanılarak ortak bir protein ekstraksiyon protokolü sağlar: 2D-dige ve mini 2DE immunoblotting kendi müteakip özellik tayini ile protein indentification. Bu yöntem, insan biyopsi ve deneysel modellerden gerçekleştirilen daha güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için bir olanak sağlar.

Konsensus Beyin kaynaklı protein, 2D-DIGE ve Mini 2DE İmmünoblotting Hem kullanma İnsan ve Kemirgen Beyin proteomun Çalışmaları Ekstraksiyon Protokolü

Burada, Tau proteinini bir vaka çalışması olarak kullanarak, Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (NMR) ile içsel olarak düzensiz bir proteinin çoklu fosforilasyonlarını tanımlamak için bir yöntem açıklıyoruz. Rekombinant Tau, veri toplama ve analizinden önce bir kinaz ile in vitro olarak izotopik olarak zenginleştirilir ve modifiye edilir.

Özünde Düzensiz Proteinlerin Çoklu fosforilasyon Saptanma Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Uyumlu esneklik proteini fonksiyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Burada, düzenli ve düzensiz protein işlevi sürücü hızlı yapısal değişiklikleri algılama için hidrojen döteryum değişimi bağlanmış zamana bağımlı elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi kullanılmasını tarif eder.

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Bu el yazması tau hyperphosphorylation, tau bağlama mikrotübüller ve hücre içi tau ilaç tedavileri takip yerelleştirilmesini ölçme ölçmek için standart iletişim kurallarını açıklar. Bu protokoller sürekli uyuşturucu ya da tau hyperphosphorylation veya Mikrotubul bağlama hedef diğer bileşikler eleme için kullanılabilir.

Tahlil fosforilasyon ve yerelleştirme kolorektal kanser hücrelerinin Tau proteinin birlikte Mikrotubul bağlama için

Burada, kütle spektrometresi (ayırmak ve bir iyi ve tekrarlanabilir 2DE desen sunar insan hipofiz adenom doku Proteom tanımlamak için MS) ile birleştiğinde bir iki boyutlu Jel Elektroforez (2DE) mevcut. Çoğu protein her 2DE yerde karmaşık kanser Proteom yüksek-duyarlı MS kullanımı ile analiz ederken gözlenir.

İnsan hipofiz adenom doku Proteom analizi için kütle spektrometresi yöntemleri ile birleştiğinde iki boyutlu Jel Elektroforez

Bu iletişim kuralı genom genelindeki değişiklikleri Histon translasyonel modifikasyonlar ALS ve Parkinson hastalığı ile ilişkili proteinlerin overexpression ile bağlantılı olarak meydana gelen (PTM) düzeyde karakterize etmek için deneysel prosedürler özetliyor Saccharomyces cerevisiae modelleri. SDS-sayfa ayrılıktan sonra bireysel Histon PTM düzeyleri batı kurutma yoluyla değişiklik özel antikorlar ile tespit edilir.

Histon translasyonel modifikasyon değişiklikler Maya nörodejeneratif Proteinopathy modellerinde karakterize

Tau, hem mikrotübülleri bağladığı sitoplazmada hem de Alzheimer hastalığına bağlı genlerin modülasyonu da dahil olmak üzere alışılmadık işlevler uyguladığı çekirdekte bulunan nöronal bir proteindir. Burada, sitoplazmik Tau gelen herhangi bir girişim hariç nükleer Tau işlevini araştırmak için bir yöntem açıklar.

Tau Subsellojen Lokalizasyonunun Hastalıkla İlgili Genlerin İfadesini Araştırmaaracı Olarak Modülasyonu

Keşfedin histon proteoformlarının 2D-TAU jel elektroforezi ile karakterizasyonunu. Bu yöntem, epigenetik değişiklikler ve metabolik yeniden yapılanma arasındaki ilişkiyi anlamak için kanser tedavisinde yeni terapötik hedefler belirlemeye yardımcı olur.

2D-TAU Jel Elektroforezi Kullanılarak Histon Proteoformlarının Ortaya Çıkarılması

Daha fazla video keşfet