Kalvarial Kemik İliğinde Vasküler Dinamiklerin İntravital Longitudinal Görüntülenmesi

Bu araştırma, intravital mikroskopi kullanarak kemik iliği makro çevresindeki vasküler dinamikleri anlamaya odaklanmakta ve kan damarlarının normal ve patolojik hematopoezise nasıl tepki verdiğini ortaya çıkarmayı amaçlamaktadır. Fotomikroskopi, transgenik hayvan modelleri gibi gelişmiş görüntüleme teknolojilerini kullanıyoruz ve zaman içinde canlı dokudaki dinamik vasküler değişiklikleri görselleştirmek ve ölçmek için bir izleyiciyi analiz ediyoruz. En önemli ilerleme, hayvan refahını iyileştirmek ve üç R ile uyum sağlamak için protokolümüzün iyileştirilmesidir.Boylamsal yaklaşımımız, cerrahi adımları en aza indirir ve çalışmamız için gereken hayvan sayısını önemli ölçüde azaltır.

Protokolümüz, derin doku penetrasyonuna ve hücre davranışı ve etkileşiminin yüksek çözünürlüklü görselleştirilmesine olanak tanıyan iki fotonlu bir mikroskop kullanarak toksik olmayan, uzun süreli intravital görüntüleme ihtiyacını karşılar. 3D baskılı kafa implantını kullanmak, boylamsal görüntüleme seansı sırasında yüksekliği, açıyı veya sırayı değiştirmeyi hedeflemeden ilgi alanını bulmayı çok kolaylaştıracaktır. Şu anda bu protokolü, hastalık patogenezi üzerindeki katkılarını daha iyi anlamak için spesifik endotelyal alt tipleri ve bunların lösemi gelişimine ve ilaç tedavisine yanıtlarını izlemek için kullanıyoruz.

Başlamak için, segmentasyon yazılımını başlatın ve kafatasını izole etmek için mikro-CT DICOM dosyalarını içe aktarın. Kemik dokusunu çevredeki yapılardan ayırmak için eşik tabanlı segmentasyon gerçekleştirin. Segmentasyonu iyileştirmek için karmaşık veya gürültülü bölgeleri manuel olarak ayarlayın.

3D Slicer'da DICOM dosyalarını içeri aktarın ve veri kümesini yükleyin. Eksenel, sagital ve koronal kesit görünümlerinde BT dilimlerini gözlemleyin. Segment düzenleyiciyi açın ve yeni bir segmentasyon oluşturmak için Ekle'yi tıklayın, ardından eşikleme için yeni bir segment oluşturmak üzere tekrar ekle'yi tıklayın.

Segment düzenleyici panelinde, eşik efektine tıklayın. Alt ve üst eşik kaydırıcılarını ayarlayın veya bölümlere ayrılmış bölgeyi kırmızıyla vurgulamak için sayısal değerler girin. Bölümlere ayrılmış kafatasını bir stl dosyası olarak dışa aktarmak için segmentasyon modülüne geçin.

Eşikli segmentin seçildiğinden emin olun. Modelleri ve etiket haritalarını dışa/içe aktar bölümünde, dışa aktarma türünü modeller ve dosya biçimini stl olarak ayarlayın, ardından dosyayı kaydetmek için dışa aktar'a tıklayın. Kafatası modelinin CAD'de hazırlanması için, önce basitleştirilmiş kafatası modelini stl formatında CAD yazılımına yeni bir parça veya model olarak aktarın.

Medyan düzlemde, calvaria'ya teğet bir eksen oluşturun, ardından hazırlanan kafatası modelini kaydedin. Kalvarial düzlemde bir çizim oluşturun ve AP artı 6,5'ten eksi ikiye kadar armut biçimli bir spline tasarlayın. AP 0.0'da altı milimetre genişlikte bu, gözlemlenebilir yüzey konturu olacaktır.

İmplantın kuyruğunu, mevcut hacme saygı gösterirken uygun sabitleme için kafatası yapısına uymasını sağlayacak şekilde tasarlayın. Son olarak, kullanılmadığı zaman gözlem penceresini korumak için koruyucu bir kapak oluşturun. Anestezi uygulanmış bir fareyi 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin ve solunum hızını görsel olarak izleyin.

Farenin kafasını elektrikli tıraş makinesiyle tıraş edin. Ardından farenin gözlerine bir damla oftalmik jel uygulayın. Görüntüleme artefaktlarını önlemek ve yara enfeksiyonu riskini azaltmak için tüm tüylerin alındığından emin olun.

Şimdi, merkezi kemik izini ortaya çıkarmak için kafa derisinin orta kısmında küçük bir kesi yapmak için bir çift steril forseps ve makas kullanın. Kafatası ile kafa derisi arasındaki bağ dokusunu çıkarın. Bir macun yapmak için yeterli diş çimentosunu bir Petri kabında karıştırın.

Kafa sabitleme implantının altına hızlıca uygulayın. Diş çimentosunun görüntüleme alanına girmesine izin vermeden, kafa tutucuyu açıkta kalan kafatasına yerleştirin ve sertleşmesine izin verin. Mikroskobun stereotaksik maskesine doğru İzofluran akışını açın.

Şimdi fareyi hızla mikroskoba getirin. Bir elinizle burnunu kaldırarak uygun izofluran penetrasyonunu sağlamak için farenin dişlerini dikkatlice maskeye yerleştirin. Fareyi bir elinizle tutarken, diğer elinizi kullanarak kafa sabitleme implantının kırlangıç kuyruğunu sabitleme tutucusuna yavaşça kaydırın.

Vida topuzunu yarım tur çevirerek sabitleyin. Daha sonra, farenin sıcaklığını izlemek için su bazlı bir jel ile önceden yerleştirilmiş bir rektal prob ekleyin. Kafa görüntüleme odasını büyük miktarda su bazlı jel veya PBS ile doldurun.

İki fotonlu uyarım sırasında optimum uyarım ve sinyal tespiti için suya daldırma hedefini tamamen suya daldırılıncaya kadar indirin. İskele izindeki merkezi kemiğe odaklanmak için x, y aşamasını ve z sürücüsünü hareket ettirin. Kemik yüzeyi ve merkezi ven tarafından işaretlenen dokuyu tanımlayın.

Odadaki ışığı kapatın ve mikroskop standının etrafındaki kutuyu kapatın. TOSCAN olmayan dedektörleri etkinleştirdikten sonra. PMT1'i 423 ila 461 nanometrede ikinci SHG'yi, GFP için 485 ila 548 nanometrede yüksek D2'yi ve 551 ila 645 nanometrede TD D'Amato için yüksek D3'ü algılayacak şekilde ayarlayın.

Ofseti sıfırda bırakın. Şimdi, PMT SHG kazancını 850 volta ve yüksek D kazançlarını %100'e ayarlayın Üç kanalın en küçüğünde 200 gri seviyeli dinamik aralığa sahip bir görüntü görünene kadar kızılötesi lazer gücünü artırın. Toplama yazılımında, kemik iliği ceplerini içeren yer belirleme bölgesi, kemik yüzeyleri içinde gösterilmiştir.

Farklı ilgi alanlarını veya yatırım getirilerini belirlemek için Loss Navigator'ı etkinleştirin ve spiral modu kullanarak bir genel bakış oluşturun. Seçilen ROI konumlarını kaydetmek ve görev listesindeki her konumu yeniden adlandırmak için tek resim simgesine tıklayın. Z yığını birimi almak için Z yığını modunu seçin ve adım boyutunu üç mikrometre olarak tanımlayın.

Tüm bölgeler için aynı yığın boyutu seçeneğinin seçimini kaldırın, ardından başlamak için başlat'a ve bitirmek için bit'e basın. Yakaladıktan sonra yığını yeniden tanımla'yı tıklatın. Görüntü toplamayı başlatmak ve görüntüleri uygun klasöre kaydetmek için başlat'a basın.

Vasküler geçirgenlik gibi dinamik bir özelliği ölçmek için, zaman atlamalı çekim elde etmek için edinme modunu XYZT olarak değiştirin. T modülünde, zaman aralığını üç dakikaya ve süreyi bir saate ayarlayın. Şimdi, mililitrede dört miligram konsantrasyonda intravenöz olarak 100 mikrolitre 70 kilodalton Dekstran TRITC enjekte edin ve alıma başlayın.

Fareyi 37 santigrat derecelik bir ısıtma yastığı üzerindeki ameliyat işaretine aktardıktan sonra, nemli kalması için kafatasına intrasite jeli uygulayın. Kafa implantının görüntüleme alanını özel kapakla kapatın ve kapağı bir vidayla dikkatlice sabitleyin. Fareyi 37 santigrat dereceye ayarlanmış ısıtma kutusuna yerleştirin ve uyanmasını bekleyin.

Fare tamamen iyileştikten sonra, hayvan tesisine nakledin ve hidrojel ve çevresel zenginleştirme ile temiz bir kafese koyun. Uzunlamasına edinimler için, önceden takılmış bir kafa tutucusu olan bir farenin gözlerine küçük bir damla oftalmik jel damlatın. Daha önce gösterildiği gibi genel bakış görüntüsünü elde edin.

Gerekirse, görüntüyü yükle ve hizala modülünü kullanarak önceki ve yeni görüntüleri yeniden hizalayın. Konumları orijinal yerlerinde işaretlemek için ekran yakalama görüntüsünü açın. Titanyum kafa sabitleme implantının CAD modeli, kafatasının anatomik yapısına uyacak şekilde tasarlandı ve hücresel düzeyde görüntüleme için mikroskop aşamasına stabil bir şekilde bağlanmasını sağladı.

İmplant, fare kafatasına başarılı bir şekilde takıldı ve farenin normal aktivitelerini sürdürmesine izin verirken zaman içinde stabil görüntüleme sağladı. Kalvarial kemik iliği damar sistemi, karmaşık bir arteriyol, geçiş kılcal damarları ve sinüzoid ağını ortaya çıkaran bir karo taraması kullanılarak görselleştirildi. Kantitatif damar analizi, damar çapının, uzunluğunun ve düzlüğünün ölçülmesine ve bunların korelasyonuna izin veren vasküler yapıların segmentasyonunu gösterdi.

Boyuna görüntüleme, lösemi ilerlemesi sırasında kalvarial damar sisteminin ilerleyici yeniden şekillenmesini ve zamanla gözlenen artan vasküler yoğunluğu yakaladı. Vasküler geçirgenlik dinamik olarak değerlendirildi, floresan boyanın zaman içinde farklı tutulduğunu gösterdi ve farklı kemik iliği damarlarının farklı geçirgenliğini gösterdi.