Name: Attine Karıncalarının Bahçelerinin Mikrobiyotası: Elektron Mikroskobunu Tarayarak Mikrobiyal Bir Manzarayı Görselleştirmek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Keşfedin attine karıncalarının mantar bahçelerindeki mikrobiyota yapısını tarama elektron mikroskobu ile. Bu yöntem, biyofilm aracılığıyla mikroorganizma-fungus etkileşimlerini detaylı incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Örnekleme alanı kolonileri
NOT: Karınca kolonilerini toplarken, toplamadan önce yerel mevzuatın gerektirdiği tüm izinlerin alındığını onaylayın. Bizim durumumuzda, #74585 toplama izni Instituto Chico Mendes de Conservação e Biodiversidade (ICMBio) tarafından verilmiştir. Numuneler bir laboratuvar kolonisinden geldiğinde, bölüm 2'ye gidin.
<ol>
	<li>Koloniyi bulun ve işaretleyin. Bahçe odası açığa çıkana kadar yuva alanını çevreleyen bir hendek kazın (Şekil 2A). NOT: Bazı attine türleri kolonilerini yaprak çöpünün altına veya çürümüş kütüklerin içine inşa edebilir. Bu gibi durumlarda, çöpü dikkatlice döndürün veya numuneleri toplamak için kütükleri dikkatlice kırın. Çeşitli attine karınca türlerinin canlı kolonilerinin bulunması, toplanması ve bakımı hakkında ayrıntılı bilgi için Sosa-Calvo ve ark.46'ya bakınız.</li>
	<li>Toprağın bahçe yüzeyine düşmesini önlemek için bahçe odasını yanlamasına açın. Bahçe büyüklüğüne bağlı olarak entomolojik forseps, kaşık veya mutfak kepçesi kullanarak bahçe örneklerini dikkatlice toplayın. NOT: Toplamadan önce aletleri sterilize ettiğinizden emin olun. Yaprak kesen karıncaların bahçelerini toplarken, işçi ısırıklarını önlemek (veya en azından azaltmak) için kalın kumaş eldivenler giyin. Diğer attin türleri için kumaş eldivenler isteğe bağlıdır.</li>
	<li>Bahçe numunelerini, bahçenin nemini dengelemek için bir sıva tabakası içeren temiz bir plastik alıcıya aktarın. Bahçe ve karınca işçilerini aktardıktan sonra, numunenin kurumasını önlemek için alıcıyı hava geçirmez şekilde kapatın. Bahçe numunelerini işlenene kadar 23-25 °C'de saklayın.</li>
	<li>Açmayı daha önce çıkarılmış toprakla kapatın.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67334/67334fig02v3.jpg"> 
Şekil 2: Numune hazırlama protokolü. (A) Tarla kolonilerinden numune alınması. (B) Numune işleme. (C) Numune hazırlama için kısa temeller ve iş akışı: 1. Sabitleme: numune yapısını güçlendirmek ve korumak için. 2. Dehidrasyon: numunelerin su içeriği etanol ile değiştirilir. 3. Kritik nokta kurutma: sıvı CO2 etanolün yerini alır ve buharlaştırılır. 4. Montaj: analiz için görüntülenen örnek. 5. Altın ile püskürtme kaplama: numune şarjını önleyin. 6. Görüntüleme. İllüstrasyonlar ve fotoğraflar Mariana Barcoto'ya aittir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67334/67334fig02largev3.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
2. Reaktifler
NOT: Aşağıdaki çözümlerin önceden hazırlanması gerektiğini unutmayın.
<ol>
	<li>0.2 M sodyum kakodilat tamponu hazırlayın. Bunun için 42.8 g sodyum kakodilatı 800 mL damıtılmış su içinde çözün, çözünene ve 7.2'de pH stabilizasyonuna kadar karıştırın (gerekirse pH'ı hidroklorik asit kullanarak ayarlayın). Damıtılmış su ekleyerek çözeltinin hacmini 1 L'ye yükseltin. Solüsyonu 4 °C'de saklayın (~ 1 ay). DİKKAT: Gluteraldehit ve paraformaldehit toksiktir ve çeker ocak içinde ele alınmalıdır. Bu tür reaktifleri kullanırken her zaman nitril eldiven ve koruyucu gözlük kullanın.</li>
	<li>Karnovsky'nin fiksatifini hazırlayın (Karnovsky'den değiştirilmiş)47. Bunun için 25 mL 0.2 M sodyum kakodilat tamponuna 10 mL % glutaraldehit sulu çözeltisi ve 10 mL paraformaldehit sulu çözeltisi ekleyin ve karıştırın. 1 mL 0.1 M kalsiyum klorür (CaCl2) ekleyin ve damıtılmış su ekleyerek hacmi 100 mL'ye yükseltin. Solüsyonu 4 °C'de saklayın (1 aya kadar). DİKKAT: Karnovsky fiksatifi solunduğunda zararlıdır ve cilt ve göz tahrişine neden olabilir. Bu nedenle, yalnızca açık havada veya iyi havalandırılan bir alanda kullanarak buharları solumaktan kaçının. Solüsyonu tutarken her zaman nitril eldiven ve koruyucu gözlük kullanın.</li>
	<li></ol><ol><li></li><li> </li></ol><ol><li> </li><li> </li><li> </li><li><li> </li><li><li><li><li><li> </li></ol><ol><li><li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li> </li><li><li></ol><ol><li><ol><li><li><li></ol></li><li> </li><li><li></ol><ol><li><li><li><li></li><li></li><li></li><li> </li></ol><ol><li> </li><li><li></li><li></li><li><li></li><li> </li><li><ol><li><li><li><li></ol></li><li> </li><li></li><li><li></ol>

<meta charset="utf8"></head><body> Mantar Üreyen Karınca Kültürlerinde Mikrobiyal Toplulukların Mikro Ölçekli SEM Analizi

Ekosistemler, belirli bir coğrafi konumdaki (yani çevre) süreçlerle birbirine bağlanan organizmalardan oluşur. Organizmalar zamanla çevreleriyle etkileşime girer ve bu da karmaşık ve heterojen mekansal kalıpların ortaya çıktığı anlamına gelir. Mekansal modelleme, ekolojik çeşitliliği ve istikrarı ve nihayetinde ekosistem işleyişini belirler 1,2,3,4. Sulak alanlar, savanlar, mercan resifleri ve kurak ekosistemler gibi makro ölçekli ekosistemlerde, mekansal modeller kaynak akışı ve konsantrasyonu ile ilişkilidir. Kaynak optimizasyonuna, mekansal heterojenliğe ve modellemeye izin vermek, homojen olanlardan daha esnek ekosistemlerle sonuçlanır2. Topluluk ekolojisinin temelinde yer alan organizmaların mekansal lokalizasyonu, mikrobiyal dünyaya da tercüme edilir.
Mikrobiyal ekosistemler, mikroorganizmalar boyunca rastgele ve homojen bir şekilde karışmış organizmalardan uzakta, işlevlerinin çoğunu tanımlayan mekansal modeller sergiler 5,6,7. Winogradsky sütunlarından çevre ve konakçı ile ilişkili mikrobiyotaya kadar, bu ekosistemler uzayda heterojen bir şekilde düzenlenmiştir ve mekansal düzenlemeler farklı fenotipik tepkileri ortaya çıkarır. Birlikte yaşayan türlerin etkileşime girme ve birbirlerinin fizyolojisini etkileme olasılığı daha yüksektir. Bu nedenle, topluluk mekansal organizasyonu, kendi başına bileşiminden daha fazla, ekosistem özelliklerini ve ekolojik nişleri sınırlar 5,7,8. Bu kavramları açıklamak için, uzamsal desenlemedeki değişiklikler diş plaklarının, çürüklerin, diş eti hastalıklarının 9,10, inflamatuar bağırsak hastalığının11, kistik fibrozun akciğer enfeksiyonlarının, kronik yara enfeksiyonlarının12,13, kolorektal kanserin ve adenomların14 patolojik ilerlemesi ile ilişkili görünmektedir.
Mikrobiyal biyocoğrafya (mikro ölçekte uzay ve zaman boyunca biyolojik çeşitlilik dağılımı ve modelleme çalışması) kapsamında, mikrobiyal ekosistemlerin bilgisi, mekansal kalıplarını kavrayarak büyük ölçüde yararlanılır 6,13,15,16,17. Karizmatik mantar yetiştiren attine karınca (Hymenoptera: Formicidae: Myrmicinae: Attini: Attina) kolonilerinin merkezinde bulunan, böcek yapılı bir mikrobiyal ekosistemin mekansal modellerini inceledik. Leucocoprinae (Basidiomycota: Agaricaceae) kabilesinde veya Pterulaceae (Basidiomycota: Agaricales) familyasında bir basidiomycete mantarı etrafında merkezlenmiş bir "mikrobiyal bahçe" bulunur.18,19,20,21,22. Bahçe, karıncalar tarafından dahil edilen çoğunlukla bitki bazlı substratı metabolize ederek büyüyen iç içe geçmiş bir hif ağından çıkan süngerimsi bir yapıdır (Şekil 1). Bunlar, attine cinslerine göre şunları içerebilir: kuru bitki kısımları, böcek parçaları ve leşleri, taze kesilmiş yapraklar, tohumlar ve çiçek kısımları23,24. Dış otçul bir bağırsağa benzer şekilde, bahçe enzimatik ve kimyasal olarak inatçı polimerleri kararsız besin kaynaklarına dönüştürür ve karıncalara esansiyel amino asitler, lipitler ve çözünür şekerler sağlar 21,25,26,27,28.
Yaprak kesme cinsleri Atta ve Acromyrmex'in bahçeleri için gerçekleştirilen ultrayapısal, enzimatik ve transkriptomik analizler, bu ortamların substrat bozulması ve beslenme yamalarının sürekliliğini yapılandırdığını göstermektedir 26,29,30,31,32. Bahçenin genç kısımları, parçalandıktan sonra yeni eklenen alt tabaka nedeniyle daha koyu olma eğilimindedir. Yakın zamanda eklenen bu substratlar genellikle karınca işçileri tarafından kesilen ve misel kümeleri ile aşılanan kenarlardan kolonize edilir. Kesilmiş kenarlardan yayılan mantar hifleri substrat üzerine yayılır 29,32,33. Substrat bozunması ilerledikçe hif bolluğu artar, bu da beyazımsı ve metabolik olarak aktif bölgelerle sonuçlanır 30,31,32. Daha fazla bozulmuş substrat ve bol miktarda mikrobiyota29,32 içeren daha eski bölgeler, kahverengimsi tonlar ve daha yüksek nem sunma eğilimindedir. İşçiler bu bölgenin parçalarını çıkarır, onları atık yığınlarına ayırırlar ve burada mantar simbiyotuna zarar veren substratları da alırlar 34,35,36. Atık yığınları, bahçeden fiziksel olarak ayrılmış olmasına rağmen, bol miktarda yaşayan mikrobiyota 29,32,37,38,39 tarafından sürekli substrat bozulması ve besin döngüsünün bir noktasıdır.
Esas olarak Enterobacter, Klebsiella, Pantoea, Pseudomonas ve Serratia'dan oluşan bir mikrobiyota da bahçede yaşar ve görünüşe göre çeşitli attine mantar kültür sistemleri tarafından paylaşılır. Mantar metabolizmasını tamamlayabilecek metabolik yolları kodlayan mikrobiyota, bahçenin fizyolojik tepkilerine potansiyel olarak katılır 40,41,42,43,44. Metagenomik veriler sadece mikrobiyotanın orada olduğunu göstermeklekalmadı 41,42, aynı zamanda yaprak kesen karıncaların mantar kültürünün Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) analizi, bitki substratı üzerinde çoğunlukla çubuk şeklindeki bakterileri gösterdi32. Bakteriler (selülolitik suşlar dahil) tüm bahçeden izole edilmiş olsa da, yalnızca bahçenin eski kısımlarında ve atık yığınlarında ve ayrıca kurucu kraliçeler tarafından taşınan ilk peletlerdegörüntülendi 29,32. Mikrobiyotanın metabolik kapasitelerinin42 önerdiği ve in vitro44'te gözlemlendiği gibi in vivo (yani bahçede ve atıkta) biyofilm oluşturup oluşturamayacağı da belirsizdi.
Burada, mikrobiyota-substrat ve mikrobiyota-hiflerin fiziksel etkileşimlerini detaylandırarak, bahçe bölgelerindeki mikrobiyota mekansal organizasyonunu daha iyi anlamak için SEM'i kullandık. SEM, daha büyük odak derinliğine sahip görüntüler sağlayarak, üç boyutlu mikroskobik yapıların yüksek çözünürlükte gözlemlenmesine izin vererek, bahçe mikrobiyotası mekansal modellerinin kapsamlı bir analizini sağlar. Bu tür heterojen ve hassas mantar bazlı örnekleri düzeltmek, kurutmak, kurutmak, püskürtmek ve görüntülemek için adımları detaylandırıyoruz. Osmiyum tetroksit (OsO4) kullanarak postfiksasyon adımını kaldırarak ve dehidrasyon süresini azaltarak, SEM analizi için bahçe ve atık numunelerinin hazırlanması için 32,33,45 protokollerini basitleştirdik. Bu uyarlanmış protokol, hifal yapısal modellerin yanı sıra mikrobiyota ve biyofilm mekansal organizasyonunu korur ve diğer hassas mikrobiyal ekosistemlere ve biyofilmlere uygulanabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67334/67334fig01v2.jpg"> 
Şekil 1: Attine mikrobiyal bahçeleri. Bahçe, karıncalar tarafından dahil edilen çoğunlukla bitki bazlı substratı metabolize ederek büyüyen iç içe geçmiş bir hif ağından kaynaklanan sünger benzeri bir yapıdır. Ayrıca bahçede yaşayan, mantar metabolizmasını tamamlayabilecek metabolik yolları kodlayan mikrobiyota da bulunur. Metagenomik veriler ve önceki Taramalı Elektron Mikroskobu analizi, mekansal organizasyonu ve substrat ve mantar hifleri ile fiziksel etkileşimleri hakkında çok az bilgimiz olmasına rağmen, varlığını gösterdi. Mikrobiyota ve biyofilm mekansal organizasyonunu ve modellemesini ortaya çıkarmak için SEM'i kullandık. Mariana Barcoto'nun çizimleri (Barcoto ve Rodrigues 94'ten uyarlanmış bahçe ve mikrobiyota) ve Mariana Barcoto ve Enzo Sorrentino'nun fotoğrafları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67334/67334fig01largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>2 mL tüp</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-BRA</td><td>Numuneleri sabitlemek ve kurutmak için</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür susuz</td><td>Merck</td><td>C4901</td><td>CaCl2 Karnovsky'yi hazırlamak için susuz s sabitleyici</td></tr><tr><td>Kritik nokta kurutucu</td><td>Leica</td><td>EM CPD 300</td><td>Kritik nokta kurutma için</td></tr><tr><td>Çift Taraflı Karbon İletken Bant, 12 mm (G) X 5 M (U)</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>77819-12</td><td>Numuneleri monte etmek için</td></tr><tr><td>Entomolojik forseps</td><td>Belirli bir tedarikçi</td><td></td> yok <td>Bahçe örneklerini manipüle etmek için</td></tr><tr><td>Etil alkol (=etanol), saf (&ge; %99,5)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td>Dehidrasyon</td></tr><tr><td>forseps</td> için <td>Belirli bir tedarikçi</td><td></td> yok <td>Bahçe örneklerini manipüle etmek için</td></tr><tr><td>Cam beher</td><td>Belirli bir tedarikçi</td><td></td> yok <td>Dehidrasyon için</td></tr><tr><td>Cam Petri kabı</td><td>Belirli bir tedarikçi</td><td></td> yok <td>Bahçe örneklerini manipüle etmek için</td></tr><tr><td>Cam pipet</td><td>Belirli bir tedarikçi</td><td></td> yok <td>Numuneleri sabitlemek ve kurutmak için</td></tr><tr><td>Glutaraldehit (Sulu Glutaraldehit EM Sınıfı% 25)</td> <td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>16220</td><td>Karnovsky'yi hazırlamak için s sabitleyici</td></tr><tr><td>Altın hedefi&nbsp;</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>8071</td><td>Altın Hidroklorik asit ile kaplamayı püskürtmek için</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Çözeltileri ayarlamak için pH</td></tr><tr><td>Görüntü düzenleyici</td><td>Photoshop</td><td>herhangi bir sürüm</td><td>Görüntüleri ayarlamak için</td></tr><tr><td>Paraformaldehit (Paraformaldehit% 20 Sulu Çözelti EM Sınıfı)</td> <td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15713</td><td>Karnovsky'yi hazırlamak için s fiksatif</td></tr><tr><td>Propilene alıcısı</td><td>Belirli bir tedarikçi</td><td></td> yok <td>Canlı karınca kolonilerini korumak için</td></tr><tr><td>Taramalı Elektron Mikroskobu</td><td>JEOL&nbsp;</td><td>IT300 SEM</td><td>Örnek görüntüleme için&nbsp;</td></tr><tr><td>Sodyum kakodilat trihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td>Sodyum kakodilat tamponu hazırlamak için</td></tr><tr><td>Spatula</td><td>Belirli bir tedarikçi</td><td></td> yok <td>Bahçe örneklerini manipüle etmek için</td></tr><tr><td>15 mm çapında numune kapları x 10 mm yüksekliğinde</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>4591</td><td>Kritik nokta kurutma için</td></tr><tr><td>Püskürtmeli kaplayıcı</td><td>Baltec&nbsp;</td><td>SCD 050</td><td>Altın Saplama ile kaplamak için</td></tr><tr><td>(Alüminyum montaj, düz uç pimi) 12,7 mm x 8 mm&nbsp;</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>75520</td><td>Numunelerin montajı için</td></tr></tbody></table>

attine karıncalarının bahçelerinin mikrobiyotası: elektron mikroskobunu tarayarak mikrobiyal bir manzarayı görselleştirmek

Microbiota of Attine Ants' Gardens: Visualizing a Microbial Landscape by Scanning Electron Microscopy

Burada, mantar hifleri, substrat, mikrobiyota ve biyofilmler gibi attine bahçesi ve atık örneklerinin bileşenlerini görselleştirmek için basitleştirilmiş bir protokol sunduk. SEM, bahçenin ve atığın mikrobiyotanın yapısal modellerini nasıl iskele kurduğuna dair anlayışımızı geliştirmiştir (Şekil 3). Attine bahçelerinde, mantar hifleri, substrat yüzeyinin bazı kısımlarını kaplayan dal benzeri yapılardır. Mantar hifleri dehidrasyona ve yırtılmaya karşı çok hassas olma eğiliminde olduğundan, kullanıcı, numune hazırlamanın sonuçlarını değerlendirmek için hif yönü tarafından yönlendirilebilir. Daha önceki eserlerdede görüldüğü gibi 32,33,45, hifler boru şeklinde bir görünüm sergiler; Sağlam, tüp şeklindeki hifler, etkili bir numune hazırlığını gösterir (Şekil 3A ve Şekil 4C). Hifler şerit şeklinde olduğunda, bu tür bir düzleştirme muhtemelen tekniğin bir eseridir (Şekil 4C).
Bitki substrat yüzeyleri, kütikül ve epidermal tabakaların yanı sıra stomalar ve trikomlar tarafından tanınabilir. Bu tür yapılar, substratlar henüz mantar hifleri ve mikrobiyota tarafından kolonize edilmediğinde daha tanınırdır (Şekil 3A ve Şekil 4C). Substrat kolonize olduğunda, mikrobiyota ve/veya mantar hifleri, belirli bitki yapılarının kolayca fark edilemeyeceği şekilde yüzeyini kaplar (Şekil 3A). Mikrobiyota, mantar hiflerini veya substratı, bunların her biri görünüşte farklı mekansal organizasyonda kolonize edebilir. Şekil 3'te, bu tür uzamsal desenler şematik olarak gösterilmiş ve tanımlandıkları ilgili SEM görüntülerinde kutulanmıştır; bu, SEM sonuçları ile yorumlanması arasındaki bağlantıyı kolaylaştırabilir.
Hifal kolonize edici mikrobiyota daha az sıklıkta görülür ve bulunduğunda izole edilmiş veya hifal yüzeye yapışık küçük gruplar halinde meydana gelen çubuk veya kokoid hücrelerden oluşur. "Dantel kumaş" yapısına benzeyen biyofilm ekzopolisakkaridik matriks (EPS), küçük kümeler halinde hifleri çevreleyebilir (Şekil 3A). Oldukça yaygın olanı, farklı attine karınca türlerinin bahçelerinde bulunan substrat kolonize eden mikrobiyotadır. Kolonizasyon modelleri, bir dereceye kadar substrat bozulma aşamaları tarafından tanımlanmış gibi görünmektedir. Bu nedenle, henüz bozulmamış substratları kolonize ederken, mikrobiyota ya tek tek hücreler halinde ortaya çıkabilir ya da küçük gruplar halinde toplanabilir. Mikrobiyota, mikroskobik bozulma belirtileri gösterdiğinde (yani, bitki kütiküler/epidermal tabakaları ve diğer bitki yapıları fark edilemediğinde ve oluklar ve girintiler bol olduğunda) substratı katmanlayabilir.
Bu "mikrobiyal matlarda", EPS matrisi olmadığında hücrelerin morfolojisi daha tanınır. Mikrobiyal hücrelerin EPS matrisine gömülü olduğu durumlarda, morfolojileri kolayca ayırt edilemez. Mekansal organizasyonlarına göre, biyofilmleri "yayılmış" veya "3 boyutlu" olarak nitelendirdik. Biyofilm yayıldığında, mikrobiyal hücreler ve EPS matrisi aralıklı olarak substrat yüzeyini kaplar ve 1-3 hücre kalınlığında düz bir tabaka oluşturur (Şekil 3B). Biyofilm 3 boyutlu olduğunda, mikrobiyal hücreler ve EPS matrisi birikerek birkaç hücre kalınlığına sahip kümeler oluşturur. Bozulmuş substratların oluşturduğu bahçe bölgeleri (eski bahçe ve atıklar gibi) mikrobiyotayı kalın topluluklar oluşturdukları oluk ve girintilerde barındırır (Şekil 3C). Özellikle, atık örneklerindeki yoğun şekilde bozulmuş substratlar, tüm bölgeler arasında morfolojik olarak en çeşitli olan bol miktarda mikrobiyota barındırır. Mayalar, biyofilm yoluyla prokaryotlarla fiziksel olarak etkileşime girerek bu topluluğa daha fazla karmaşıklık katar. Atta sexdens ve Acromyrmex sp. atık örneklerinde, EPS matrislerinin, çubuk şekilli ve kokoid prokaryotların yanı sıra fusiform ve küresel mayaları çevreleyen göze çarpan bir fibriller ağ örgüsü oluşturduğu gözlenmiştir (Şekil 3C).
İç içe geçmiş bir hif ağından kaynaklanan bahçenin süngerimsi yapısı, numuneyi daha eşit bir şekilde kaplamak için ek püskürtme gerektirir. Bu tür adımlar, görüntüyü bozan ve çözünürlüğünü engelleyen elektron saçılmasını önler (Şekil 4A). Numune hazırlama adımları, mikrobiyotanın mekansal dağılımını ve organizasyonunu ortaya çıkararak bahçe yapısının çoğunu korumuştur. Bununla birlikte, mantar hifleri ve EPS matrisi gibi yapıların dehidrasyona karşı çok hassas olduğunu ve özellikle SEM için korunmasının çok zor olduğunu tekrarlamakta fayda var. Hif yapısı nispeten iyi korunmuştur, ancak bazı bahçe örneklerinde görselleştirilen biyofilmin EPS matrisinin bazı yapısal bileşenlerinden yoksun olabileceğini düşünmek mantıklıdır. Bazı örneklerde mikrobiyotayı saran polisakkaritlerin en dış düzgün tabakası korunmuş olsa da (Şekil 3A, B), bazılarının mikrobiyota morfolojik özellikleri korunmuş ancak EPS matrisi yoktu. Bununla birlikte, EPS matrisinin gerçekten eksik olup olmadığı veya numune hazırlama sırasında çıkarılıp çıkarılmadığı açık değildir.
Bir yandan, biyofilm pürüzsüz tabakasının çıkarılması, kesin biyofilm yapısının anlaşılmasını bozar. Öte yandan, ana araştırma odak noktamız olan katmanın altında bulunan hücrelerin morfolojisini, mekansal organizasyonunu ve fiziksel etkileşimlerini ortaya koymaktadır. Önceki çalışmalar, birincil fiksatif olarak osmiyum tetroksit (OsO4) buharı kullanılarak hem mantar hiflerinin hem de biyofilm matrisinin korunduğunu bildirmiştir 44,50,51,52,53,54. Daha sonra, biyofilmlerin pürüzsüz yönünü görünüşte koruyan OsO4 buharı ile taze bahçe örneklerini sabitleyen karşılaştırmalı bir deney yaptık (Şekil 4B). Bununla birlikte, bu yöntem, hiflerin ve mikrobiyotanın geniş ölçüde düzleşmesine neden oldu. Bu düzleşme, daha önce 29,33,32,45 olarak tanımlanan bahçenin genel mekansal yönlerinin kaybolmasına neden olmuş ve böylece bahçe yapısal desenleri üzerine daha fazla çalışmayı sınırlamıştır. OsO4 ile sabitleme, hem mikrobiyal morfolojiyi ve dağılımı ayırt etmeyi hem de hücre yapılarını teknik eserlerden ayırt etmeyi zorlaştırdı, böylece veri yorumlamayı zorlaştırdı.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67334/67334fig03v2.jpg"> 
Şekil 3: Mikrobiyota mimari desenleri. Mikrobiyota, mantar hiflerini ve substratı farklı mekansal organizasyonda kolonize eder. Bu tür uzamsal desenler şematik olarak gösterildi ve tanımlandıkları ilgili SEM görüntülerinde kutulandı (şekilde beyaz karelerle sınırlandırılmıştır): (A) Hifal kolonize edici mikrobiyota, bazı örneklerde tespit edilebilen biyofilm ekzopolisakkaridik matris ile izole edilmiş veya küçük hücre gruplarından oluşur. (B) Substrat kolonize eden mikrobiyota substrat boyunca yayılır ve EPS matrisi, morfolojileri kolayca ayırt edilemeyecek şekilde hücreleri kaplar. (C) Mono veya çok morfolojik biyofilmler oluşturan, bazı durumlarda EPS matrisini kanıtlayan, 3 boyutlu gruplar oluşturan substrat kolonize mikrobiyota. İllüstrasyonlar Mariana Barcoto'ya aittir. Kısaltma: EPS = ekzopolisakkaridik matris. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67334/67334fig03largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67334/67334fig04v2.jpg"> 
Şekil 4: Sonuçsuz görüntüleme. Etkisiz sonuçlar veren ve/veya mimari desenlerin yorumlanmasını engelleyen düşük kaliteli görüntüler. (A) Elektron saçılması görüntüyü bozar, çözünürlüğünü ve sonuç olarak morfoloji tanımlamasını engeller. Bu, yalnızca bir kez püskürtülerek kaplanmış numunelerde sıklıkla gözlendi ve ek kaplama ile azaltıldı. (B) Taze bahçe numunelerinin birincil fiksatif olarak osmiyum tetroksit (OsO4) buharı ile sabitlenmesi 44,50,51,52,53,54 görünüşe göre biyofilmlerin pürüzsüz yönünü korumuştur. Bununla birlikte, geniş hif ve mikrobiyota düzleşmesine neden olarak bahçe mimari desenlerine zarar verdi. (C) Karnovsky'nin fiksatifi kullanılarak yapılan numune hazırlama, OsO4 kullanan preparatlarla karşılaştırıldığında, hif yapısının, mikrobiyota dağılımının ve bahçelerin mekansal modellerinin çoğunu koruyarak daha yüksek kaliteli görüntüler verdi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67334/67334fig04largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Attine Karıncalarının Bahçelerinin Mikrobiyotası: Elektron Mikroskobunu Tarayarak Mikrobiyal Bir Manzarayı Görselleştirmek

In macroscale ecosystems, such as rainforests or coral reefs, the spatial localization of organisms is the basis of our understanding of community ...

microbiota-attine-ants-gardens-visualizing-microbial-landscape

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video termit hindgut ikamet mikropların türünün DNA ayıklamak için teknik göstermektedir. Bağırsak mikrobiyal topluluk görüntülenmesi için yararlı bir ıslak montaj kaydırağı, hazırlık da gösterilmiştir ve türler açısından zengin bir bağırsak ortamı üzerinden bir tur verilir.

Termit Gut Mikroplar (Zootermopsis Angusticollis) DNA ayıklanıyor ve Gut Mikroplar görselleştirme

Jared Leadbetter termit-bağırsak mikrobiyal topluluk mikrop arasındaki karmaşık etkileşimler çalışmak için mükemmel bir sistem neden açıklar. Ana böcek ve lignoselüloz-aşağılayıcı bağırsak mikrop arasındaki simbiyotik bir ilişki mevcut yanı sıra, aşağılayıcı bitki biyokütle ve biyoyakıt üreten endüstriyel kullanımlar için bu mikropların olarak açıklanmıştır.

Röportaj - Termit Hindgut Mikrobiyal Topluluk incelenmesi

Jared Leadbetter termit hindgut yaşam ikamet çeşitliliği ile bir doğa yürüyüşü için bize 250 farklı tür içeren bir mikro dünyada başka yerde bulundu. Jared çok katmanlı ve bu sistem tarafından sergilenen simbiyoz termit ve gut sakinleri arasında bir ilişki sadece içerir, ama aynı zamanda bağırsaktaki mikropların kendi aralarında simbiyoz karmaşık bir web içerir ortaya koymaktadır.

Symbiosis Katmanları - Termit Hindgut Mikrobiyal Topluluk görselleştirme

Burada, dağınık şekilde ve geçici kene cesaret bir değiştirilmiş bütün-mount In situ hibridizasyon yaklaşım kullanarak uygun microbiota varlığı değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Kene bağırsaklar tarafından bütün-mount Situ hibridizasyon Microbiota görselleştirme

Bu kolaylaştırılmış protokol, karmaşık doku örneklerindeki bakterileri tespit etmek ve görüntülemek için, dokuyu sabitlemekten floresan in situ hibridizasyonlu mikropları boyamaya kadar bir iş akışını detaylandırıyor.

Floresan In Situ Hibridizasyon, Lectin Boyama ve Görüntüleme Yoluyla Gut Mikrobiyota-konak Etkileşimlerinin Görselleştirilmesi

Bu protokol, gerçek zamanlı olarak bireysel replisomes DNA replikasyonu görselleştirmek için basit bir tek-molekül floresan mikroskopi tekniği gösterir.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

Cryo elektron mikroskopları, Tarama (SEM) veya İletim (TEM), ya çok yüksek su içeriği ile 1 biyolojik örneklerin veya diğer malzemelerin karakterizasyonu için kullanılır. A SEM / Odaklı İyon Işın (FİB) örneklerinde ilgi özelliklerini belirlemek ve cryo-TEM transfer için ince, elektron-saydam tabakalara ayıklamak için kullanılır.

Odaklanmış iyon demeti Of Cryo-elektron Mikroskopi Numune Hazırlama By Means

Hematopoietik kök ve projenitör hücreler (HSPCs) ve kemik iliği niş arasındaki etkileşimin doğası tam olarak anlaşılamamıştır. Özel donanım modifikasyonları ve çok adımlı bir satın alma protokolü ex vivo görüntünün kemik iliği alanları içinde bağlantılı etiketli HSPCs, izleme etkileşimleri ve hareket için iki-foton ve konfokal mikroskopi kullanımına izin verir.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Fenestre karaciğer sinüzoidal endotel hücresi, çeşitli hastalıklardan, toksinlerden ve fizyolojik durumlardan oldukça etkilenen biyolojik olarak önemli bir filtre sistemidir. Bu değişiklikler karaciğer fonksiyonunu önemli ölçüde etkiler. Bu hücrelerdeki pencere boyutlarının ve sayısının ölçümünün standardizasyonu için yöntemler açıklanmaktadır.

Taramalı Elektron Mikroskobu Karaciğer Sinüs Endotel Hücreleri Analizi ve Bunların fenestrasyonlar için Standart Yöntemi

Burada, hücreden arındırılmış kalp dokularında hücre dışı matriks üst yapısını görselleştirmek için bir yöntem gösterilmiştir.

Macerated Tissue taramalı elektron mikroskobu Ekstraselüler Matrix Visualize&#39;a

Keşfedin attine karıncalarının mantar bahçelerindeki mikrobiyota yapısını tarama elektron mikroskobu ile. Bu yöntem, biyofilm aracılığıyla mikroorganizma-fungus etkileşimlerini detaylı incelemeyi sağlar.

Attine Karıncalarının Bahçelerinin Mikrobiyotası: Elektron Mikroskobunu Tarayarak Mikrobiyal Bir Manzarayı Görselleştirmek

Daha fazla video keşfet