Murin Kardiyovasküler Yeniden Şekillenmesinin Multimodal Çalışması: Dört Boyutlu Ultrason ve Kütle Spektrometresi Görüntüleme

Laboratuvarımız, çeşitli hastalıklarda ve fizyolojik durumlarda kardiyovasküler biyomekaniği incelemek için klinik öncesi ultrason görüntülemeyi kullanır. Ayrıca, kardiyovasküler ve beyin dokusundaki lipitlerin uzamsal dağılımını incelemek için kütle spektrometresi görüntülemesi kullanıyoruz. Dokunun neresinde fonksiyonel ve moleküler değişiklikler olduğunu görmeye çalışıyoruz.

Histoloji ve immünohistokimya gibi yaygın moleküler görüntüleme teknikleri moleküler veriler verebilse de, şu anda mevcut olan lekeler ve antikorlarla sınırlıdır. Öte yandan, kütle spektrometresi görüntüleme, dokunun uzamsal bütünlüğünü hala koruyan multiomik çalışmalar için hedeflenmemiş bir yaklaşımdır. Tekniğimizle, multiomikleri lipitleri, glikanları ve peptitleri içerecek şekilde genişletebilir ve bunları ultrason gibi fonksiyonel görüntüleme teknikleriyle birleştirebiliriz.

Bu tekniklerle, araştırmacılar artık fonksiyonel görüntülemeyi moleküler görüntüleme teknikleriyle birleştirebilirler. Laboratuvarımızda, kardiyovasküler hastalıklar için iki ana odak alanımız var ve bunlardan biri kalp krizi veya kanser tedavileri ile kardiyak yeniden şekillenmeye bakıyor, yani kardiyotoksisite. Ve ikinci büyük kardiyovasküler hedefimiz yaşlanmaya ve yaşlanmanın damar sistemini nasıl etkilediğine bakmak.

Kardiyak dört boyutlu ultrason yapmak için, fareyi görüntüleme plakası üzerinde sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Ardından, dönüştürücüyü yarı kilitli bir konumda tutucuya yerleştirin. Dönüştürücüdeki yükseltilmiş noktayı ekrandaki mavi nokta ile hizalayın ve farenin sağ tarafına doğru konumlandırın.

Dönüştürücüyü, farenin sagital düzlemi boyunca, yükseltilmiş çentik kaudal olarak işaret edecek şekilde hizalamak için çevirin. Bir dönüştürücü ile akustik bağlantı için göğüs boşluğunun ventral yüzeyine bol miktarda ultrason jeli uygulayın. Dönüştürücüyü ultrason jeline temas edene kadar indirin.

İnce ayar için plakanın tabanındaki XY düğmeleri ile hassas ayarlamalar yapın. Ardından, ekrandaki peristernal uzun eksen görünümünün, doğru görüntüleme için yatay olarak hizalanmış apeks, sol ventrikül çıkış yolu ve aortu içerdiğinden emin olun. Görüntüyü geçerli seriye kaydetmek için ekranın alt köşesindeki Resmin Adı'nı seçin.

Peristernal kısa eksen görünümü elde etmek için dönüştürücüyü saat yönünde 90 derece döndürün. Sol ventrikülün görüntüde net bir şekilde tanımlandığından ve papiller kasların görünür olduğundan emin olun. Dört boyutlu bir görüntü ayarlamak için ekranın sol üst köşesindeki küp simgesini seçin.

Dönüştürücüyü sıfırladıktan sonra, başlangıç konumunu apeksin hemen altına ve durma konumunu aort arkına ayarlayın. Adım boyutunu 0,08 ila 0,13 milimetre ve kare hızını 200 ila 300 hertz olarak ayarlayın. Taramayı başlatmadan önce hayati belirtilerin ve EKG sinyalinin sabit kaldığından emin olun.

Taramayı ve işlemeyi tamamladıktan sonra, EKV/4D verilerini kaydet ve Solunum Kapısını son işlem için açın. Sağ alt köşedeki Ad Resmi'ni seçin ve ada fare kimliğini ekleyin. Kardiyak döngü boyunca her bir görünüm düzlemini görselleştirmek için Daha Fazla Denetim'i seçin ve Dört Boyutlu Olarak Yükle'yi seçin.

Kalbin her bir düzlem görünümünü gözden geçirin ve kalbin merkezinin kalp döngüsü boyunca sabit kaldığını onaylayın. Başlamak için, fare dokularının hızlı donması için alüminyum folyo tekneler hazırlayın. Forseps kullanarak, ötenazi yapılmış farenin derisini çadır haline getirin ve vasküler erişim için boynun üzerinden veya kardiyak erişim için sternumun hemen altından makasla çadırlı cildi kesin.

Damar sistemini ortaya çıkarmak için cilt ve kas katmanlarını kesmeye devam edin. Kalbin çıkarılması için, kalbi açığa çıkarmak için kemiği kesin. Pamuklu çubuklarla künt diseksiyon kullanarak, kalbi veya damar sistemini yağ da dahil olmak üzere çevre dokulardan izole edin.

Karotis damarını dikkatlice sinirden ayırın. Ardından, cerrahi aletler kullanarak kalbi veya damar sistemini çıkarın. Karotis damarını, kalbi ve damar sistemini önceden etiketlenmiş bir alüminyum folyo tekneye yerleştirin.

Ardından, hızlı dondurma için tekneleri sıvı nitrojene yerleştirin. Başlamak için, bir kabı HPLC suyla doldurun ve beş ve bir mililitrelik şırıngalarla birlikte bir kenara koyun. Ardından, kriyostat sıcaklığını eksi 25 santigrat dereceye ayarlayın ve bıçağı yerleştirin.

Dokuyu monte etmeden önce soğuması için kriyostat odasının içine bir çift forseps yerleştirin. Beş mililitre HPLC suyunu bir şırıngaya çekin ve suyu kısmen dondurmak için kriyostata yerleştirin. Şırıngadaki su tamamen donmadan önce, metal aynanın üzerine dağıtın ve tamamen donmasına izin verin.

Şimdi, bir mililitrelik bir şırıngayı HPLC suyla doldurun ve kriyostatın içine yerleştirin. 30 ila 60 saniye sonra, aynanın ortasına küçük bir miktar kısmen katılaşmış su koyun. Forseps kullanarak, çıkarılan fare kalbini hızlı bir şekilde su damlasına yerleştirin ve çevredeki su tamamen donana kadar orada tutun.

Başlamak için, takılı fare kalbi ile sürgüyü dondurucudan çıkarın ve kuruması için bir kurutucuya koyun. HTX M3+Püskürtücüyü açın. Dizüstü bilgisayarda HTX uygulamasını açın ve Yöntemde, nozul sıcaklığını 75 santigrat dereceye, akış hızını dakikada 100 mikrolitreye ve basıncı 10 psi'ye ayarlayın.

Numune adını, polariteyi, matrisi, çözücüyü ve konsantrasyonu laboratuvar not defterine kaydedin. Ardından, istenen konsantrasyon için gereken matris miktarını hesaplayın. Daha sonra, pozitif mod matrisi için istenen miktarda 2, 5-dihidroksibenzoik asit tartın.

Matrisi 15 mililitrelik bir tüpte% 70 metanol içinde çözün. Matris çözeltisini 10 dakika boyunca sonikleştirin. Sonikasyon sırasında, slaydı desikatörden çıkarın.

Püskürtücü tepsisini açın. Ardından, slaydı sol alt köşeye yerleştirin ve kenarlarını bantlayın. Numune püskürtme bölgesini seçin ve tepsiyi kapatın.

Bir şırınga ve filtre kullanarak, matris çözeltisini şırınganın içine çekin. Matris solüsyonunu, Püskürtücünün sol tarafında bulunan siyah kapaklı şırıngadan şişeye süzün. Şişeyi Püskürtücü üzerinde belirlenen yerine geri yerleştirin ve D hattı borusunu şişeye güvenli bir şekilde yerleştirin.

Ardından, inert gazı açın ve Püskürtücü üzerindeki göstergenin 10 psi okuduğunu onaylayın. Başlat'a basın ve Püskürtücü ayarlanan sıcaklığa ulaştığında, püskürtmeye başlamak için yanıp sönen Başlat düğmesini seçin. Sprey tamamlandıktan sonra, numuneyi Püskürtücüden çıkarın ve MALDI sürgü tutucusuna yerleştirin.

MALDI slayt tutucusunu tarayın ve bir tarayıcı kullanarak kaydırın. Kütle spektrometresi görüntüleme ile kullanmak için görüntüyü bir flash sürücüye kaydedin. Püskürtücüde Yıkama seçeneğini seçin ve D hattını matris şişesinden atık kabına taşıyın.

Son olarak, Püskürtücü tepsisine metanol püskürtün ve silerek temizleyin. Azotu kapatın. Enfarktüslü miyokard dokusunun MALDI kütle spektrometresi görüntülemesi, muhtemelen C veya D'deki COHb'ye karşılık gelen ve miyokardiyal yeniden şekillenmeye dahil olduğunu düşündüren 577.52 yüklü moleküler iyon kütlesini tanımladı.

Dört boyutlu ultrason görüntüsü, enfarktüslü bölgeleri gösteren yeşil-sarı doku olarak görselleştirilen, yüzey alanı gergin büyüklüğü %20'den az olan miyokardiyal bölgeleri gösterdi. Miyokard enfarktüsü dokusunun uzun eksenli görünümünde, doku biyomekaniği ve moleküler kompozisyon arasındaki korelasyonu karmaşıklaştıran lipid delokalizasyonu görüldü.