İnsan Trombositlerinde Doku Faktörü İfadesinin Akış Sitometrisi Analizi

Bu protokolde, tam kan akışı sitometrisi ile trombosit ilişkili doku faktörünü ölçmek, hücre içi bölmedeki proteini değerlendirmek, tutuklama koşulları ve hücre yüzeyinde hem dinlenme durumunda hem de aktivasyon üzerine adım adım bir eğitim öneriyoruz Bir DP ile, en yaygın trombosit agonist doku faktörlerinden biri, trombositlerin bir alt kümesi tarafından ifade edilir. Doku faktörü pozitif trombositler PRP trombositten zengin plazmada veya yıkanmış trombositlerde ölçülürse, bu alt küme numune hazırlama sırasında kaybolabilir. Bu değerlendirme duvarda yapıldığında bu risk oluşmaz.

Kan plakası ilişkili doku faktörü, pre-analitik ve metodolojik sorunlar nedeniyle yüzyılın başında yayınlanan ilk rapordan bu yana tartışmalıdır. Bu konulara ışık tutan bu protokol, aynı zamanda Uluslararası Tromboz ve Hemostaz Derneği ISDH tarafından desteklenen uluslararası bir proje yürütmek için kullanılmakta olup, trombosit ilişkili doku faktörü ölçümünü veya kan akımı sitometrisini birkaç mikrolitre kan üzerinde standardize etmek ve klinik ortama uygun trombosit ilişkili doku faktörü analizine olanak sağlamak için kullanılmaktadır. Ayrıca, numunenin sabitlenmesi ve daha sonra etiketlenmesi imkanı, bu analizi birçok hastane ve laboratuvar için uygun hale getirir.

Başlamak için, her antikor hacmi için bir test tüpü hazırlayın. Test etmek için, her test tüpüne bir damla negatif boncuk ve bir damla pozitif boncuk ekleyin. Test tüpüne ve girdaba her antikor seyreltmesinden 20 mikrolitre ekleyin.

Test tüplerini hemen karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Daha sonra her tüpe kalsiyum ve magnezyum pH 7.4 içermeyen bir mililitre PBS ekleyin ve girdap yapın, kanı ve antikoagülanı iyice karıştırmak için sodyum sitrat vakutainerini beş kez hafifçe ters çevirin. 50 mikrolitre kanı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Ardından 950 mikrolitre% 1 paraform aldehit ekleyin. Numuneyi yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 90 dakika inkübe edin. Şimdi numuneyi oda sıcaklığında bir mola ile beş dakika boyunca 1.500 G'de santrifüjleyin.

Süpernatan Reese'i çıkardıktan sonra, peleti kalsiyum ve magnezyum içermeyen bir mililitre PBS'de askıya alın. PH 7.4'te, her tüpe 100 mikrolitre sabit kan verin ve beş dakika boyunca 1.500 G'de santrifüjleyin. Oda sıcaklığında ara verdikten sonra, süpernatan resüsü çıkarın.

Numunelere nüfuz etmek için peleti 100 mikrolitre %0.1 Triton PBS'de askıya alın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Başlamak için, floresan eksi bir kontrol için bir tüp ve doku faktörü boyaması için bir tüp hazırlayın. Her tüpte 100 mikrolitre sabit ve perme tam kana antikor ekleyin.

Her tüpe pH 7.4'te kalsiyum ve magnezyum içermeyen 300 mikrolitre PBS ekleyin ve karıştırın. Daha sonra, akış sitometrisi analizi alfa CD 1 42 HTF, bir monoklonal antikor ve Alexa Fluer 6 33 keçi anti fare immünoglobulin G'yi kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS'de seyreltene kadar lekeli örnekleri karanlıkta saklayın. Ardından, üç numune tüpü hazırlayın ve PBS'yi kalsiyum ve magnezyum olmadan dağıtın.

PH 7.4'te, 7.5 mikrolitre seyreltilmiş alfa CD 1 42 htf bir monoklonal antikor dağıtın ve beş mikrolitre adenozin difosfat ekleyin. Kanı ve antikoagülanı iyice karıştırmak için sitrat boşluğunu beş kez hafifçe ters çevirin. Her tüpe beş mikrolitre tam kan dağıtın.

Numuneleri yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Numune fiksasyonu için, her tüpe 300 mikrolitre% 1 PFA ekleyin ve oda sıcaklığında ara vererek beş dakika boyunca 1.500 G'de santrifüjleyin. Süpernatan çıkarıldıktan sonra, peleti kalsiyum ve magnezyum içermeyen 90 mikrolitre PBS'de tekrar süspanse edin.

pH 7.4'te, hafifçe pipetleyerek her tüpe beş mikrolitre seyreltilmiş Alexa Fluer 6, 33 immünoglobulin G ve beş mikrolitre alfa CD 41 PE dağıtın. Numuneleri karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Daha sonra her tüpe pH 7.4'te kalsiyum ve magnezyum içermeyen 300 mikrolitre PBS ekleyin ve karıştırın.

Başlamak için, tüm olayları gösteren logaritmik bir ölçekte bir ileri dağılım alanı ve yan saçılma alanı nokta grafiği oluşturun, tüm olayları gösteren logaritmik bir ölçekte bir CD 61 A ve yan saçılma alanı nokta grafiği oluşturun. Trombosit popülasyonunu görselleştirmek için, eşiği yan saçılma yüksekliğinde yaklaşık 2000 ve CP B altı 90 H'de 1000 olarak ayarlayın. Günlük kalite kontrolüne göre PE Y 5 8 5 ve CP B başına altı 90 kazancı ayarlayın ve akış hızını düşük olarak ayarlayın. Şimdi 10 ışının üçünün kuvveti ile 10 ışının beşin kuvveti arasında CD 61 pozitif olarak adlandırılan bir bölge çizin.

Trombosit popülasyonunu tanımlamak için FMO'yu çoğaltın ve TFIC olarak yeniden adlandırın. Örnekleri alın ve CD 61 pozitif kapısı içinde 10.000 olaydan oluşan bir veri dosyası kaydedin. Tüm olayları görüntüleyen logaritmik bir ölçekte bir ileri dağılım alanı ve yan dağılım alanı nokta grafiği oluşturun.

Tüm olayları gösteren logaritmik bir ölçekte bir CD 41 A ve yan saçılma alanı nokta grafiği oluşturun. Ardından Alexa kat 6 33 kazancını ve PE wifi 5 8 5 kazancını günlük kalite kontrolüne göre ayarlayın. Trombosit popülasyonunu görselleştirmek H.To eşiği yan saçılma yüksekliğinde yaklaşık 1000'e ve PEY 5 85'te 2.500'e ayarlayın, akış hızını düşük olarak ayarlayın.

Şimdi trombosit popülasyonunu tanımlamak için 10 ışının dördün kuvveti ile 10'un beşin kuvvetine yükseltilmiş CD 41 pozitif olarak adlandırılan bir bölge çizin. Daha sonra her numune için bir tüp oluşturun ve TF Uyarılmamış ve TF Uyarılmış olarak adlandırın. Örnekleri alın ve CD 41 pozitif yürüyüş santrifüjü içinde 10.000 olaydan oluşan bir veri dosyası kaydedin.

0.129 molar sodyum sitrat vakutainer 100 G'de oda sıcaklığında ara vermeden 10 dakika. Ardından vakutainer'ı santrifüjden çıkarın. Elde edilen trombositten zengin plazmayı toplayın, 10 mililitrelik bir polipropilen tüpe aktarın ve toplanan hacmi bir kan hücresi sayacı kullanarak trombositten zengin plazmada iki kez trombositleri sayın.

Alfa CD 61 antikor boyaması ile tanımlanan trombosit popülasyonu, dolaşımdaki trombositlerin yaklaşık %26.8'inin hücre içi doku faktörü akışı içerdiğini gösterdi Sitometri analizi, doku faktörünün istirahat trombositlerinin yaklaşık %2.8'i tarafından eksprese edildiğini ve adenozin difosfat ile aktivasyon üzerine %24.5'e yükseldiğini gösterdi. Daha büyük boyutlu trombositlerin, daha büyük trombosit alt kümesini temsil eden yeşil noktalarla daha yüksek doku faktörü seviyelerini ifade ettiği gösterilmiştir. Flow sitometri analizi, 100 g santrifüjleme kullanılarak hazırlanan trombositten zengin plazmanın, daha yüksek doku faktörü pozitifliğine sahip daha büyük boyutlu trombositleri tutan tam kana benzer bir popülasyonu koruduğunu göstermiştir.

Daha yüksek santrifüjleme kuvveti, PRP popülasyonunda azalmış öne doğru saçılma ile gösterildiği gibi daha büyük doku faktörü pozitif trombositlerin kaybına yol açmıştır.