Nörogelişimsel Bozuklukla İlişkili Deubikitile Edici Enzimlerin İn Vitro Ubikitin Zincir Bölünme Testi ile Enzimatik Aktivitesinin Ölçülmesi

Ubikitin sisteminin enzimlerindeki gen varyantlarıyla ilişkili nörogelişimsel bozuklukların moleküler temelini tanımlamakla ilgileniyoruz. Bu enzimler tarafından kontrol edilen sinyal yollarını incelemek ve gen varyantlarının protein biyolojisi üzerindeki etkisini belirlemek için en son teknikleri kullanıyoruz. Bu yöntemin avantajı, belirli bir DUB tarafından düzenlenen alt tabakalar hakkında önceden bilgi gerektirmeyen, substrattan bağımsız bir teknik olmasıdır.

Bu şekilde, nörogelişimsel bozuklukla ilişkili gen varyansının DUB katalitik aktivitesi üzerindeki etkisini doğrudan ölçebilir ve olası patojenik mekanizmaları önerebiliriz. Çoğu DUB'un hücresel işlevleri tam olarak anlaşılmadığından, laboratuvarımız bu enzimlerin aracılık ettiği sinyal yolaklarını ve genetik hastalıkla ilişkili gen varyantlarının bu süreçleri nasıl etkilediğini belirlemeye odaklanacaktır. Başlamak için, kullanmadan hemen önce 20 mikrolitre kimyasal olarak yetkin Rosetta 2 Escherichia coli hücresini buz üzerinde çözün.

Bir ila 10 nanogram pGEX6P1 USP27X ekspresyon plazmidi ekleyin ve buz üzerinde beş dakika inkübe edin. Kuru bir banyoda hücreleri 42 santigrat derecede 30 saniye boyunca ısı şoku verir. Daha sonra hücreleri iki dakika buz üzerinde inkübe edin.

Hücrelere 80 mikrolitre oda sıcaklığında SOC ortamı ekleyin. 60 milimetre yörüngeli tezgah üstü sıcaklık kontrollü çalkalayıcıda 200 RPM dönüşle 200 santigrat derecede 19 dakika inkübe edin. Daha sonra, kloramfenikol ve ampisilin ile desteklenmiş bir LB agar plakası üzerine 50 mikrolitre kültür plakası yerleştirin.

Sıcaklık kontrollü bir inkübatörde 37 santigrat derecede, kapak tarafı aşağı bakacak şekilde 20 saat inkübe edin. Tek bir dönüştürülmüş bakteri kolonisi seçin ve kloramfenikol ve ampisilin ile takviye edilmiş 10 mililitre steril LB ortamına ekleyin. Daha önce gösterildiği gibi 20 saat inkübe edin.

Daha sonra, kloramfenikol ve ampisilin ile takviye edilmiş bir litre TB ortamına 10 mililitre gece kültürü ekleyin. 600 nanometredeki optik yoğunluk 0,5 ila 0,6'ya ulaşana kadar inkübe edin. Daha sonra, ekspresyonu indüklemek için kültüre 50 mikromolar izopropil beta-d-1-tiyokalaktopiranosit ekleyin.

Numuneyi 16 santigrat dereceye soğuttuktan sonra, 200 RPM rotasyonla 16 santigrat derecede 20 saat inkübe edin. Daha sonra, hücreleri ekspresyon kültüründen peletlemek için hücreleri 3000 G veya daha yüksek bir sıcaklıkta 20 dakika santrifüjleyin. Son olarak, peleti eksi 80 santigrat derecede en az bir saat saklayın.

Başlamak için, boş yerçekimi akış sütununu bir imbik standında sabitleyin. Bir litre ekspresyon kültüründen toplanan bir hücre peletini saflaştırmak için sütunu iki ila üç mililitre gluthathione agaroz reçinesi ile doldurun. Sütunu bir reçine yatağı hacmi% 20 etanol ile yıkayın.

Kolonu yıkadıktan sonra, hücre peletini dört santigrat derecede çözün. Çözülmüş peletin içine 30 mililitre MS500 tamponu ekleyin ve nazik uçtan uca döndürme ile inkübe edin. Şimdi, parçalanmış hücreleri 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde, bir pipet ucundan dağıtıldığında lizat serbestçe akana kadar buz üzerinde sonikleştirin.

Süpernatanı temizlemek için dört santigrat derecede ve 20.000 G veya daha yüksek sıcaklıkta 30 dakika santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı bir behere boşaltın ve temizlenmiş lizatı kolona yükleyin. Akışı toplarken lizatı kolondan yerçekimi akışıyla geçirin.

Daha sonra, sütunu en az iki reçine yatağı hacmi MS500 yıkama tamponu ile yıkayın ve yıkama akışını beş mililitrelik fraksiyonlar halinde toplayın. Daha sonra, protein varlığını kontrol etmek için 100 mikrolitre Bradford reaktifine her fraksiyondan bir mikrolitre ekleyin. MS500 elüsiyon tamponunu kolondan geçirerek ve beş mililitre elüsyon fraksiyonu toplayarak proteini geri kazanın.

Proteini çökeltmek için, elüata iki hacim dört molar amonyum sülfat ekleyin ve tüpü bulanıklaşana kadar yavaşça ters çevirin. Dört santigrat derecede ve 20.000 G veya daha yüksek sıcaklıkta 30 dakika santrifüjleyin. Her santrifüjlemeden sonra protein peletini bozmadan süpernatanı çıkarın.

Daha sonra proteini saklamadan önce %25 gliserol ile desteklenmiş MS500 tamponunda yeniden çözün. Her bir deubikitilasyon enzimi için her bir zaman noktası için deubikitile edici enzim aktivasyon tamponunda 10 mikrolitre saflaştırılmış GST etiketli USP27X hazırlayın. Ubikitin zincirleri eklemeden önce, deubikitilasyon reaksiyonunun başlamasını önlemek için sıfır zaman örneğine yedi mikrolitre SDS-PAGE yükleme tamponu ekleyin.

Her bir deubikitile edici enzim için her bir zaman noktasına, 10 mikrolitre enzim aktivasyon tamponu içinde seyreltilmiş 375 nanogram K63 bağlantılı di-ubikuitin zinciri ekleyin. Tüpleri 30 santigrat derecede inkübe edin ve her zaman noktasını yedi mikrolitre SDS-PAGE yükleme tamponu ekleyerek durdurun. SDS-PAGE'yi %dört ila %12 gradyanlı bir jel kullanarak gerçekleştirin.

Yabani tip USP27X, bir saatlik inkübasyondan sonra K63'e bağlı di-ubikuitin zincirlerini mono-ubikuitine böldü. XLID-105 ile ilişkili varyans F313V, Y381H ve S404N, bir saatlik inkübasyondan sonra K63'e bağlı di-ubikitin zincirlerini parçalamadı.