Name: Nörogelişimsel Bozuklukla İlişkili Deubikitile Edici Enzimlerin İn Vitro Ubikitin Zincir Bölünme Testi ile Enzimatik Aktivitesinin Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Öğrenin, nörogelişimsel bozukluklarla ilişkili deubikitile edici enzimlerin aktivitesini in vitro ubikitin zincir bölünme testiyle nasıl ölçülür. Bu yöntem, gen varyantlarının enzimatik fonksiyon üzerindeki etkisini doğrudan değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Aşağıdaki protokol, yetkin hücrelerin farklı suşlarında eksprese edilen çeşitli afinite etiketleri kullanılarak rekombinant proteinler için uyarlanabilir. İfade edilen proteine bağlı olarak, kültürleme ve gece ekspresyon koşulları, OD600'ün ekspresyon indüksiyonu, ekspresyon süresi, ekspresyon sıcaklığı ve IPTG konsantrasyonunda optimizasyonunu gerektirebilir. Protokole genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Yetkili Rosetta 2 E. coli hücrelerinin rekombinant GST-USP27X ekspresyon plazmidi ile dönüşümü
NOT: Bakteri kültürünün sterilitesini korumak için, ortam kaplarının bir Bunsen brülör alevi altında açık olduğu adımları gerçekleştirin. Optimum oksijen transferine izin vermek için, 19 mm ila 50 mm yörüngeye ve 200 rpm29 hıza sahip tezgah üstü sıcaklık kontrollü bir çalkalayıcıda bakteri kültürü çalkalaması gerçekleştirin.
<ol>
	<li>Kullanmadan hemen önce 20 μL kimyasal olarak yetkin Rosetta 2 E. coli hücrelerini buz üzerinde çözdürün. 1-10 ng pGEX6P1-USP27X ekspresyon plazmidi ekleyin (N-terminal Glutatyon-S-transferaz (GST)30 etiketli USP27X için kodlayan ve Ampisilin direnci içeren) ve buz üzerinde 5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Kuru bir banyoda 42 ° C'de 30 saniye boyunca ısı şoku. 2 dakika buz üzerinde inkübe edin.</li>
	<li>80 μL oda sıcaklığında (RT) SOC ortamı ekleyin. 19 mm yörüngeli tezgah üstü sıcaklık kontrollü çalkalayıcıda 200 rpm dönüş ile 37 °C'de 60 dakika inkübe edin.</li>
	<li>25 μg/L Kloramfenikol ve 50 μg/L Ampisilin ile desteklenmiş bir LB agar plakası üzerinde 50 μL kültür plakası. Sıcaklık kontrollü bir inkübatörde kapağı aşağı bakacak şekilde 37 °C'de 20 saat inkübe edin.</li>
</ol>
2. Ekspresyon plazmidinden rekombinant proteinin gece boyunca bakteri ekspresyonu
NOTLAR: Bakteri kültürünün sterilitesini korumak için, ortam kaplarının bir Bunsen brülör alevi altında açık olduğu adımları gerçekleştirin. Optimum oksijen transferine izin vermek için, 19 mm ila 50 mm yörüngeye ve 200 rpm29 hıza sahip tezgah üstü sıcaklık kontrollü bir çalkalayıcıda bakteri kültürü çalkalaması gerçekleştirin. Bir spektrofotometre kullanarak OD600 kültürünü ölçün.
<ol>
	<li>2 L'lik şaşkın kültür şişesinde %0,4 gliserol içeren 1 L ultra saf suya 47,6 g TB Tozu ekleyerek 1 L Müthiş Et Suyu (TB) ortamı hazırlayın. Orta kısmı 30 dakika otoklavlayın ve RT'ye soğutun.</li>
	<li>Tek bir dönüştürülmüş bakteri kolonisi seçin ve 25 μg / L Kloramfenikol ve 50 μg / L Ampisilin ile desteklenmiş 10 mL steril LB ortamına ekleyin. 19 mm yörüngeli tezgah üstü sıcaklık kontrollü çalkalayıcıda 200 rpm dönüş ile 37 °C'de 20 saat inkübe edin.</li>
	<li>25 μg/L Kloramfenikol ve 50 μg/L Ampisilin (başlangıç kültürünün ekspresyon kültürüne oranı 1:100) ile takviye edilmiş 1 L TB ortamına 10 mL gece boyunca kültür ekleyin. Kültür OD 600 0,5-0,6 arasında olana kadar 19 mm yörüngeli tezgah üstü sıcaklık kontrollü çalkalayıcıda200 rpm dönüşle 37 °C'de inkübe edin.</li>
	<li>Ekspresyon indüklemek için kültüre 50 μM IPTG ekleyin, 16 ° C'ye soğutun ve 200 rpm dönüşle 16 ° C'de 20 saat inkübe edin.</li>
	<li>≥3.000 x g ve 4 ° C'de 20 dakika santrifüjleme yoluyla ekspresyon kültüründen pelet hücreleri. Peleti -80 °C'de en az 1 saat saklayın. NOT: Bu noktada, deneme duraklatılabilir ve daha sonra (tercihen aynı hafta) yeniden başlatılabilir. Pelet -80 °C'de uzun süre saklanabilir.</li>
</ol>
3. Yerçekimi-akış afinite sütunu ile protein saflaştırması
NOT: Her saflaştırma için uygun reçine, bağlama, yıkama, elüsyon ve depolama tamponları, saflaştırılan rekombinant proteine bağlı olacaktır. SDS-PAGE tamponundaki hücre peleti, süpernatant, akış, yıkama fraksiyonları ve elüsyon fraksiyonlarından numuneler toplayın. Saflaştırmanın başarısını değerlendirmek için numuneler için SDS-PAGE ve Coomassie boyama yapın. 4 °C'de saflaştırma yapın ve fraksiyonları buz üzerinde tutun. Protein etiketlerinin bölünmesi, ilgili proteaza özgü bölünme bölgesini hedeflemek için uygun proteaz kullanılarak kolon üzerinde veya dışında gerçekleştirilebilir.
<ol>
	<li>Boş yerçekimi akış sütununu imbik standına sabitleyin ve glutatyon agaroz reçinesi ile doldurun. 1 L ekspresyon kültüründen toplanan bir hücre peletini saflaştırmak için 2-3 mL reçine kullanın.</li>
	<li>Sütunu bir reçine yatağı hacmi% 20 etanol ile yıkayın. Bir reçine yatağı hacmi MS500 tamponu (20 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.5 mM TCEP) ile sütunu 3 kez yıkayın. Hücre peletini hazırlarken kurumayı önlemek için reçinenin tamponla kaplı kalması için sütunu durdurun.</li>
	<li>Hücre peletini 4 °C'de çözdürün. Çözülmüş pelete 30 mL MS500 tamponu (20 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.5 mM TCEP, 60 mg lizozim ve bir proteaz inhibitör tableti) ekleyin. Nazik uçtan uca döndürme ile 4 ° C'de 30 dakika boyunca kireçlenin.</li>
	<li>Parçalanmış hücreleri, 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde veya bir pipet ucundan dağıtıldığında lizat serbestçe akana kadar buz üzerinde metal bir beherde sonikleştirin. Süpernatanı temizlemek için 4 °C'de 30 dakika ve ≥20.000 x g'da santrifüjleyin. NOT: Sonikatör ayarlarını ampirik olarak belirleyin. Sonikatörü, viskoz lizatı serbest akışlı ve şeffaf bir sıvıya indirgemek için toplam 120 s yeterli olacak şekilde ayarlayın.</li>
	<li>Süpernatanı bir behere boşaltın ve temizlenmiş lizatı kolona yükleyin. Akışı toplarken yerçekimi akışıyla kolondan lizat geçirin. Toplanan akışın bulunduğu sütunu yükleyin ve sütundan geçirin.</li>
	<li>Kolonu en az iki reçine yatağı hacmi MS500 yıkama tamponu (20 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.5 mM TCEP) ile 5 kez yıkayın. Yıkama akışını 5 mL'lik fraksiyonlar halinde toplayın. Protein varlığını görsel olarak kontrol etmek için her fraksiyondan 1 μL'yi 100 μL Bradford reaktifine ekleyin. Son yıkamada bağlanmamış protein artık mevcut olmayana kadar yıkayın ve gerekirse ek yıkama adımları ekleyin.</li>
	<li>MS500 elüsyon tamponunu (10 mM glutatyon ve 10 mM NaOH ile desteklenmiş MS500 tamponu) kolon boyunca çalıştırarak ve 5 mL elüsyon fraksiyonları toplayarak proteini geri kazanın. 100 μL Bradford reaktifine 1 μL elüat ekleyerek protein varlığını kontrol edin. Bradford reaktifi artık proteinlerin mevcut olduğunu göstermediğinde fraksiyonları toplamayı bırakın.</li>
	<li>Çökeltme ve santrifüjleme ile tampon değişimi gerçekleştirin. Elüata 2 hacim 4 M amonyum sülfat ekleyerek, bulanıklaşana kadar hafifçe ters çevirerek ve ardından 4 ° C'de 30 dakika ve ≥ 20.000 x g ve tekrar 5 dakika daha santrifüjleyerek proteini çökeltin. Her santrifüjlemeden sonra protein peletini bozmadan süpernatanı çıkarın.</li>
	<li>% 25 gliserol ile desteklenmiş proteini MS500'de yeniden çözün ve saklayın. Protein peletlerini veya proteini -80 °C'de depolama tamponunda saklayın.</li>
</ol>
4. İn vitro ubikitin zincir bölünme testi
NOT: Önceki raporlarda31 açıklanan veya ampirik olarak belirlenen DUB özgüllüğüne dayalı olarak ubikitin zincir uzunluğunu ve bağlantı tiplerini seçin. Gerekirse, bu protokol, tanımlanmış uzunluk ve bağlantı tipine sahip ticari olarak temin edilebilen ubikitin zincirlerinden oluşan bir panel üzerinde ilgilenilen vahşi tip DUB'un aktivitesini test etmek için kullanılabilir. Test27 için başlangıç noktaları olarak 375-750 ng'lik bir di-ubikitin zincir miktarı ve 1-2 μM'lik bir DUB konsantrasyonu kullanılabilir.
<ol>
	<li>10x DUB aktivasyon tamponu hazırlayın (500 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl ve 100 mM TCEP).</li>
	<li>Her DUB için her zaman noktası için, 1x DUB aktivasyon tamponunda (DUB karışımı) 10 μL toplam 2 μM saflaştırılmış GST-USP27X hazırlayın. Ana karışımları hazırlayın ve bunları zaman noktalarına bölün.</li>
	<li>DUB karışımını RT'de 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Deubikitilasyon reaksiyonunun başlamasını önlemek için ubikitin zincirleri eklemeden önce 0 zamanına kadar 7 μL SDS-PAGE yükleme tamponu ekleyin.</li>
	<li>Her DUB için her bir zaman noktasına, 10 μL 1x DUB aktivasyon tamponunda seyreltilmiş 375 ng K-63 di-ubikitin zinciri ekleyin. Toplam hacim reaksiyon başına 20 μL'dir.</li>
	<li>Tüpleri 30 °C'de inkübe edin ve her zaman noktasını 7 μL SDS-PAGE yükleme tamponu ile durdurun.</li>
	<li>Seçilen zaman noktalarında mono-ubikuitin varlığındaki değişikliği analiz etmek için ubikuitin ve USP27X için% 4 -% 12 gradyan jel ve immünoblot 7,32 ile SDS-PAGE gerçekleştirin.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67367/67367fig01v2.jpg"> 
Şekil 1: Çalışma tasarımının şeması. (A) Yetkin E. coli hücrelerinin rekombinant protein ekspresyonu plazmidi ile dönüşümü. (B) Rekombinant deubikitilaz proteininin gece boyunca bakteriyel ekspresyonu. (C) Bir yerçekimi akış afinite sütunu kullanılarak rekombinant deubikitlazın protein saflaştırılması. (D) Deubikitile edici aktiviteyi değerlendirmek için in vitro ubikitin zincir bölünme testi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/67367fig01largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>Nörogelişimsel Bozukluklarda DUB Varyantlarının Bölünme Testi Kullanılarak Değerlendirilmesi

<ol><li>Morris-Rosendahl, D. J., Crocq, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+disorders%3A+the+history+and+future+of+a+diagnostic+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Dialogues+Clin+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental disorders: the history and future of a diagnostic concept.</a> Dialogues Clin Neurosci. 22 (1), 65-72 (2020).</li>
<li>Ebstein, F., Küry, S., Papendorf, J. J., Krüger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+disorders+%28NDD%29+caused+by+genomic+alterations+of+the+ubiquitin-proteasome+system+%28UPS%29%3A+the+possible+contribution+of+immune+dysregulation+to+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental disorders (NDD) caused by genomic alterations of the ubiquitin-proteasome system (UPS): the possible contribution of immune dysregulation to disease pathogenesis.</a> Front Mol Neurosci. 14, 733012(2021).</li>
<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annu Rev Biochem. 67 (10), 425-479 (1998).</li>
<li>Pickart, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying ubiquitination.</a> Annu Rev Biochem. 70 (1), 503-533 (2001).</li>
<li>Komander, D., Clague, M. J., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+chains%3A+structure+and+function+of+the+deubiquitinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 550-563 (2009).</li>
<li>Yau, R., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increasing+complexity+of+the+ubiquitin+code%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The increasing complexity of the ubiquitin code.</a> Nat Cell Biol. 18 (6), 579-586 (2016).</li>
<li>Koch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP27X+variants+underlying+X-linked+intellectual+disability+disrupt+protein+function+via+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">USP27X variants underlying X-linked intellectual disability disrupt protein function via distinct mechanisms.</a> Life Sci Alliance. 7 (3), e202302258(2024).</li>
<li>Hao, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP7+acts+as+a+molecular+rheostat+to+promote+WASH-dependent+endosomal+protein+recycling+and+is+mutated+in+a+human+neurodevelopmental+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">USP7 acts as a molecular rheostat to promote WASH-dependent endosomal protein recycling and is mutated in a human neurodevelopmental disorder.</a> Mol Cell. 59 (6), 956-969 (2015).</li>
<li>Fountain, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+variants+in+USP7+cause+a+neurodevelopmental+disorder+with+speech+delays%2C+altered+behavior%2C+and+neurologic+anomalies%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Med%22%5BJournal%5D)">Pathogenic variants in USP7 cause a neurodevelopmental disorder with speech delays, altered behavior, and neurologic anomalies.</a> Genet Med. 21 (8), 1797-1807 (2019).</li>
<li>Santiago-Sim, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biallelic+variants+in+OTUD6B+cause+an+intellectual+disability+syndrome+associated+with+seizures+and+dysmorphic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Biallelic variants in OTUD6B cause an intellectual disability syndrome associated with seizures and dysmorphic features.</a> Am J Hum Genet. 100 (4), 676-688 (2017).</li>
<li>Beck, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage-specific+deubiquitylation+by+OTUD5+defines+an+embryonic+pathway+intolerant+to+genomic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Linkage-specific deubiquitylation by OTUD5 defines an embryonic pathway intolerant to genomic variation.</a> Sci Adv. 7 (4), eabe2116(2021).</li>
<li>Cho, J., Park, J., Kim, E. E., Song, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+systems+for+profiling+deubiquitinating+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Assay systems for profiling deubiquitinating activity.</a> Int J Mol Sci. 21 (16), 1-16 (2020).</li>
<li>Matsui, S., Sandberg, A. A., Negoro, S., Seon, B. K., Goldstein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isopeptidase%3A+A+novel+eukaryotic+enzyme+that+cleaves+isopeptide+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Isopeptidase: A novel eukaryotic enzyme that cleaves isopeptide bonds.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 79 (5), 1535-1539 (1982).</li>
<li>Rose, I. A., Warms, J. V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme+with+ubiquitin+carboxy-terminal+esterase+activity+from+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An enzyme with ubiquitin carboxy-terminal esterase activity from reticulocytes.</a> Biochemistry. 22 (18), 4234-4237 (1983).</li>
<li>Wilkinson, K. D., Cox, M. J., Mayer, A. N., Frey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+ubiquitin+ethyl+ester%2C+a+new+substrate+for+ubiquitin+carboxyl-terminal+hydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of ubiquitin ethyl ester, a new substrate for ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase.</a> Biochemistry. 25 (21), 6644-6649 (1986).</li>
<li>Pickart, C. M., Rose, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+carboxyl-terminal+hydrolase+acts+on+ubiquitin+carboxyl-terminal+amides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase acts on ubiquitin carboxyl-terminal amides.</a> J Biol Chem. 260 (13), 7903-7910 (1985).</li>
<li>Hadari, T., Warms, J. V. B., Rose, I. A., Hershko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ubiquitin+C-terminal+isopeptidase+that+acts+on+polyubiquitin+chains%3A+Role+in+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A ubiquitin C-terminal isopeptidase that acts on polyubiquitin chains: Role in protein degradation.</a> J Biol Chem. 267 (2), 719-727 (1992).</li>
<li>Woo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+ubiquitin+C-terminal+hydrolases+from+chick+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiple ubiquitin C-terminal hydrolases from chick skeletal muscle.</a> J Biol Chem. 270 (32), 18766-18773 (1995).</li>
<li>Woo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+new+ubiquitin+C-terminal+hydrolase+%28UCH-1%29+with+isopeptidase+activity+from+chick+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a new ubiquitin C-terminal hydrolase (UCH-1) with isopeptidase activity from chick skeletal muscle.</a> J Biochem. 121 (4), 684-689 (1997).</li>
<li>Baek, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+a+novel+ubiquitin-specific+protease%2C+UBP41%2C+with+isopeptidase+activity+in+chick+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of a novel ubiquitin-specific protease, UBP41, with isopeptidase activity in chick skeletal muscle.</a> J Biol Chem. 272 (41), 25560-25565 (1997).</li>
<li>Wilkinson, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+the+polyubiquitin+degradation+signal%3A+Structure%2C+mechanism%2C+and+role+of+isopeptidase+T%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolism of the polyubiquitin degradation signal: Structure, mechanism, and role of isopeptidase T.</a> Biochemistry. 34 (44), 14535-14546 (1995).</li>
<li>Hu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+UBP-family+deubiquitinating+enzyme+in+isolation+and+in+complex+with+ubiquitin+aldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a UBP-family deubiquitinating enzyme in isolation and in complex with ubiquitin aldehyde.</a> Cell. 111 (7), 1041-1054 (2002).</li>
<li>Hu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanisms+of+the+proteasome-associated+deubiquitinating+enzyme+USP14%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanisms of the proteasome-associated deubiquitinating enzyme USP14.</a> EMBO J. 24 (21), 3747-3756 (2005).</li>
<li>Gorka, M., Magnussen, H. M., Kulathu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+biology+tools+to+study+deubiquitinases+and+UBL+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical biology tools to study deubiquitinases and UBL proteases.</a> Semin Cell Dev Biol. 132, 86-96 (2022).</li>
<li>Faesen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differential+modulation+of+USP+activity+by+internal+regulatory+domains%2C+interactors%2C+and+eight+ubiquitin+chain+types%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">The differential modulation of USP activity by internal regulatory domains, interactors, and eight ubiquitin chain types.</a> Chem Biol. 18 (12), 1550-1561 (2011).</li>
<li>Mevissen, T. E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OTU+deubiquitinases+reveal+mechanisms+of+linkage+specificity+and+enable+ubiquitin+chain+restriction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">OTU deubiquitinases reveal mechanisms of linkage specificity and enable ubiquitin chain restriction analysis.</a> Cell. 154 (1), 169-184 (2013).</li>
<li>Kwasna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+ZUFSP%2FZUP1%2C+a+distinct+deubiquitinase+class+important+for+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of ZUFSP/ZUP1, a distinct deubiquitinase class important for genome stability.</a> Mol Cell. 70 (1), 150-164.e6 (2018).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-exome+sequencing+of+405+unresolved+families+identifies+seven+novel+intellectual+disability+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">X-exome sequencing of 405 unresolved families identifies seven novel intellectual disability genes.</a> Mol Psychiatry. 21 (1), 133-148 (2016).</li>
<li>Hartmann, I. Shaker Orbit - Revolving in Space Around the Samples? Eppendorf Lab Academy. Eppendorf Lab Academy. , at 
 <a target="_blank" href="https://www.eppendorf.com/us-en/lab-academy/lab-solutions/others/shaker-orbit-revolving-in-space-around-the-samples">https://www.eppendorf.com/us-en/lab-academy/lab-solutions/others/shaker-orbit-revolving-in-space-around-the-samples</a> (2020).</li>
<li>Smith, D. B., Johnson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+purification+of+polypeptides+expressed+in+Escherichia+coli+as+fusions+with+glutathione+S-transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase.</a> Gene. 67 (1), 31-40 (1988).</li>
<li>Ritorto, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+DUB+activity+and+specificity+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Screening of DUB activity and specificity by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nat Commun. 5, 4763(2014).</li>
<li>Bustos, F., Bustos, F. Immunoblotting using precast gels. , protocols.io (2024).</li>
<li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+purification+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Overview of the purification of recombinant proteins.</a> Curr Protoc Protein Sci. 80, 6.1.1-6.1.35 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Amersham Protran 0.45 NC 200 mm ve kez; 200 mm 25/PK</td><td>Cytiva</td><td>10600041</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum sülfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC205872500</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760 25</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ubiquitin (Fare monoklonal)</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 646302, RRID:AB_1659269</td><td>(WB: 1:1000)</td></tr><tr><td>Anti-GST (Koyun poliklonal)</td><td>MRC-PPU Reaktifleri ve Hizmetleri</td><td>Cat# S902A Üçüncü boşaltma</td> <td>(WB: 1:1000) https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/</td></tr> <tr><td>Şaşkın Kültür Şişeleri 2 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-042-5N</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reaktif</td><td>Millipore Sigma</td><td>B6916-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>C-105-25</td><td></td></tr><tr><td>Tam, Proteaz İnhibitör tabletleri</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td>5056489001</tr><tr><td>Econo-Column 1.5 > 5 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>7371507</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer F1.5&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-205</td><td></td></tr><tr><td>Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td>https://www.adobe.com/products/illustrator.html</td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>https://www.licor.com/bio/image-studio/ </td></tr><tr><td>Inkscape</td><td>Inkscape</td><td></td><td>https://inkscape.org/</td></tr> <tr><td>Canlandırıcı %4-12 NuPAGE 1mm 12 kuyulu jel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (İzopropil-BD-Tiyogalaktopiranosid)</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-109</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Eşek Anti-Keçi IgG İkincil Antikor</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>Cat# 926-32214</td><td>(WB: 1:10000)</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Eşek Anti-Fare IgG İkincil Antikor</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>Cat # 926-32212</td> <td>(WB: 1: 10000)</td></tr> <tr><td>Isotemp Dijital Kuru Banyo</td><td>Fisher Scientific</td><td>88860022</td><td></td></tr><tr><td>K63 Di-Ubiquitin</td><td>South Bay Bio LLC</td><td>SBB-UP0072</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-119</td><td></td></tr><tr><td>LB Et Suyu</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-118</td><td></td></tr><tr><td>Lizozim</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>L-040-100</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4000 Masaüstü Orbital Çalkalayıcı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SHKE4000-7</td><td></td></tr><tr><td>MES-SDS Koşu Tamponu</td><td>Boston Bioproducts Inc</td><td>BP-177</td><td></td></tr><tr><td>Mini Tüp Döndürücü</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-051</td><td></td></tr><tr><td>NuPage LDS Numune tamponu 4x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey&nbsp; Fc Görüntüleyici</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>43214</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Plus Merdiven</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26620</td><td></td></tr><tr><td>pGEX6P1 insan USP27X</td><td>MRC-PPU Reaktifleri ve Hizmetleri</td><td>DU21193</td><td>https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/</td></tr> <tr><td>pGEX6P1 insan USP27X F313V</td><td>Addgene</td><td>225715</td><td>Koch et at 2024'te (PMID: 38182161)</td></tr><tr><td>pGEX6P1 insan USP27X S404N</td><td>Addgene</td><td>225717</td><td>Koch et 2024'te (PMID: 38182161)</td></tr><tr><td>pGEX6P1 insan USP27X Y381H</td><td>Addgene</td><td>225716</td><td>Koch et 2024'te (PMID: 38182161)</td></tr><tr><td>Pierce Glutatyon Agaroz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16100</td><td></td></tr><tr><td>PMSF (Fenilmetilsülfonil florür)</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>P-470-10</td><td></td></tr><tr><td>Polisorbat 20 (Tween 20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC233360010</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta 2 Yetkin Hücreler</td><td>Millipore Sigma</td><td>71402-M</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>SOC orta</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-216</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier 250</td><td>Branson</td><td>100-132-135</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC 6 Plus Santrifüj</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (Tris-(karboksietil) fosfin hidroklorür)</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>TCEP10</td><td></td></tr><tr><td>Müthiş Et Suyu Tozu</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-225</td><td></td></tr><tr><td>Tris Baz</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-146</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini Hücre ve XCell II Blot Modülü&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>EI0002</td><td></td></tr></tbody></table>

nörogelişimsel bozuklukla İlişkili deubikitile edici enzimlerin İn vitro ubikitin zincir bölünme testi ile enzimatik aktivitesinin Ölçülmesi

Measuring Enzymatic Activity of Neurodevelopmental Disorder-Associated Deubiquitylating Enzymes via an In Vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay

XLID105 ile ilişkili varyantların USP27X katalitik aktivitesi üzerindeki etkisini belirlemek için, GST etiketli vahşi tip USP27X ve XLID105 ilişkili varyant F313V, Y381H ve S404N USP27X proteinleri bakterilerden saflaştırıldı. Bu varyantlar, USP27X'in USP katalitik alanı içinde bulunur (Şekil 2A). USP27X'in daha önce K63 ubikitin zincirlerini31 parçaladığı bildirildiğinden, vahşi tip USP27X ve XLID105 ilişkili varyant F313V, Y381H ve S404N USP27X proteinleri, K63'e bağlı di-ubikuitin zincirleri ile 1 saat inkübe edildi. Bu örnekler SDS-PAGE32 ile ayrıldı ve ubikitin ve USP27X proteinleri immünoblotlama yoluyla analiz edildi. Vahşi tip USP27X, mono-ubikuitin üreterek di-ubikitin bölünmesini indükler (Şekil 2B ve Ek Şekil 1). XLID105 ilişkili F313V, Y381H ve S404N USP27X varyant proteinleri bu zincirleri parçalamadı. F313V, Y381H ve S404N varyantları USP27X katalitik aktivitesini bozduğundan, USP27X fonksiyonel bozulma, XLID1057'nin altında yatan ana mekanizma gibi görünmektedir. Ek miktar tayini ve tamamlayıcı deneyler daha önce bildirilmiştir7.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67367/67367fig02v2.jpg"> 
Şekil 2: XLID105 varyantlarının USP27X deubiquitylating aktivitesi üzerindeki etkisi. (A) USP alanında (mor) değerlendirilen kalıntı sayılarını ve XLID105 varyantlarının konumunu gösteren insan USP27X protein yapısının diyagramı. (B) GST etiketli vahşi tip USP27X ve XLID105 varyantları (F313V, Y381H ve S404N), belirtilen süreler boyunca K63 di-ubikitin zincirleri ile inkübe edildi. İmmünoblot analizi anti-GST (USP27X) ve ubikitin antikorları kullanılarak yapıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/67367fig02largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: Şekil 2B'nin kırpılmamış lekeleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/R1%20Koch%202024%20Jove%20supplemental%20Figure.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Nörogelişimsel Bozuklukla İlişkili Deubikitile Edici Enzimlerin İn Vitro Ubikitin Zincir Bölünme Testi ile Enzimatik Aktivitesinin Ölçülmesi

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. ...

measuring-enzymatic-activity-neurodevelopmental-disorder-associated

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Ubikitinasyon üç enzimlerin kümesi tarafından yürütülen bir anahtar posttranslasyonel modifikasyonu. Bu değişiklik ilgili genler Mutasyonlar birçok farklı insan hastalıkları ile ilişkilidir. Burada, kültür hücrelerinde protein ubikuitinasyon tespit protokolleri...

Protein Ubikitinasyon Tespiti

Geçerli protokol işlevsel homolog deubiquitinating enzim aktivitesinin ölçülmesi için bir yöntem göstermektedir. Uzman problar kovalent enzim değiştirme ve saptama için izin verir. Bu yöntem, yeni tedavi hedefleri tespit etmek potansiyele sahiptir.

Hücre Kuşakları ve Doku Örneklerinde Deubiquitinating Enzim aktivitesinin ölçülmesi için bir yöntem

Ubiquitination hücresel süreçlerde önemli roller oynar ve sıkıca deubiquitination tarafından koordine edilen bir post-translational modifikasyon olduğunu. Her iki reaksiyon kusurları insan patolojileri altında yatan. Biz arıtılmış bileşenleri kullanarak in vitro mayası ve deubiquitination reaksiyonu yürütmek için protokoller sunuyoruz.

Nükliosomal Histones in vitro Ubiquitination ve Deubiquitination bulguları

Bu protokol, kemirgen beynin farklı hücresel bölmeler içinde Ubiquitin-proteasome sistemi (UPS) etkinliğini verimli bir şekilde ölçmek için tasarlanmıştır. Kullanıcılar, aynı hayvanlarda nükleer, sitoplazmik ve sinaptik fraksiyonlar içinde çalışan UPS 'i inceleyebilir, bu karmaşık analizleri gerçekleştirmek için gereken zaman ve hayvan sayısını azaltır.

Subcellular Ubiquitin ölçümü-kemirgen beyinde proteasom aktivitesi

Bu yöntem, ubiquitin zincir topolojislerindeki küresel değişikliklerin değerlendirilmesini açıklar. Değerlendirme, kütle spektrometresi tabanlı hedefli proteomik yaklaşımın uygulanmasıyla gerçekleştirilir.

Paralel Reaksiyon İzleme ile Ubiquitin Zincir Analizi

Bu çalışma, E3 ubiquitin ligase katalitik aktivitesinin analizi için ayrıntılı in vitro ubiquitylation tahlil protokolleri sunmaktadır. Rekombinant proteinler Escherichia coli kültürü gibi prokaryotik sistemler kullanılarak ifade edildi.

In Vitro E3 Ubiquitin Ligase fonksiyonunun analizi

Fonksiyon kaybı ve kazancı hem Angelman sendromu hem de otizm spektrum bozukluğu ile bağlantılı olan bir gen olan Ube3a'daki yanlış anlam varyantlarının fonksiyonel önemini değerlendirmek için basit ve ölçeklenebilir bir yöntem geliştirilmiştir.

Ube3a Varyantlarının İşlevsel Değerlendirmesi için Ölçeklenebilir, Hücre Tabanlı Bir Yöntem

Burada kullanılan deney, geleneksel Çin tıbbının küçük molekülleri ile protein hedefleri arasındaki etkileşimi tahmin etmek ve doğrulamak için prob teknolojileriyle birleştirilmiş bir moleküler yerleştirme yöntemini göstermektedir.

Moleküler Yerleştirme ve Deubikitinasyon Enzim Probu Teknolojisine Dayalı UCHL3 Aktivitesini İnhibe Etmek için Geleneksel Çin Tıbbı Bileşiklerinin Taranması

Enzim taraması için yüksek verimli bir test tanımlanmıştır. Bu çoğullanmış kullanıma hazır tahlil kiti, önceden seçilmiş Chrömer, Polymer, Hydrogel (CPH) substratları ve kompleks I, çözünmez Chromojenik Biyokütle (ICB) substratlarından oluşur. Hedef enzimler polisakkarit parçalayıcı endo-enzimler ve proteazlardır.

Yeni çözünmez Kromojenik altyapı deneyiyle kitleri kullanılarak karbonhidrat parçalayıcı Enzimlerin yüksek verimli tarama

Siklin bağımlı kinaz 1 (Cdk1) hücre döngüsünün G2 aşamasında aktif ve birçok hücresel yolları düzenler. Burada, bir vitro kinaz tahlil için bir protokol ile bu önemli kinaz hücresel hedefleri oluşturmak üzere Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tanımlaması sağlar Cdk1 mevcut.

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Öğrenin, nörogelişimsel bozukluklarla ilişkili deubikitile edici enzimlerin aktivitesini in vitro ubikitin zincir bölünme testiyle nasıl ölçülür. Bu yöntem, gen varyantlarının enzimatik fonksiyon üzerindeki etkisini doğrudan değerlendirir.

Nörogelişimsel Bozuklukla İlişkili Deubikitile Edici Enzimlerin İn Vitro Ubikitin Zincir Bölünme Testi ile Enzimatik Aktivitesinin Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal

Nörogelişimsel Bozuklukla İlişkili Deubikitile Edici Enzimlerin İn Vitro Ubikitin Zincir Bölünme Testi ile Enzimatik Aktivitesinin Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet