Geçici Fokal İskemi ile Kombine Akut Hipergliseminin Neden Olduğu Hemorajik Dönüşümün Bir Fare Modeli

Bu araştırmada, akut hiperglisemisi olan C57BL/6 farelerinde orta serebral arter oklüzyonu reperfüzyonu kullanarak insan radikal dönüşümünün yüksek oranda tekrarlanabilir bir hayvan modeli oluşturmak için kapsamlı ve ayrıntılı bir protokol sağlamayı amaçlıyoruz.

Diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, protokolümüz iyi tekrarlanabilirlik, yüksek stabilite ve düşük hayvan ölüm oranı gösterir, bu da onu hemorajik dönüşümün klinik öncesi araştırmalarında yaygın kullanım için uygun hale getirir.

Gelecekte, hemorajik dönüşümün nörolojik üzerindeki etkisini araştırmak ve altta yatan mekanizmayı keşfetmek odak noktamız olacaktır.

[Öğretim Görevlisi] Başlamak için cerrahi platformu ve çevresindeki çalışma alanını %75 etanol ile silin. Isıtma anahtarını açın ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın. Anestezi uygulanmış fareyi sırtüstü pozisyonda cerrahi platforma hareket ettirin ve uzuvlarını yapışkan bant kullanarak sabitleyin. Daha sonra, cerrahi işlemden 15 dakika önce, farelere intraperitoneal olarak% 30 glikoz veya normal salin uygulayın. Bir neşter kullanarak, boynun orta hattı boyunca 1,5 santimetre açıklıkla yatay bir kesi yapın. Sol ortak karotis arteri tanımlamak ve ayırmak için ters üçgen alanı içinde künt diseksiyon yapın. Oftalmik forseps kullanarak, ortak karotis artere bitişik vagus sinirini ve kan damarlarını çevreleyen mukozal dokuyu inceleyin. 5-0 poliglikolik asit emilebilir sütür ile, sütürü gergin tutarak ana karotis arter üzerinde bir zil sesi açın. Ardından, ortak karotis arter boyunca yukarı doğru ayırın. Şimdi, dış ve iç karotis arteri tamamen ortaya çıkarmak için çatallanmayı ayırın. 5-0 poliglikolik asit emilebilir bir sütürü, bifurkasyondan distal olarak dış karotid arterin etrafına sarın ve sıkıca bağlayın. Daha sonra, iki hafif mikro serrafine arteriyel arter klempi kullanarak, kan akışını engellemek için hem ortak karotis arteri hem de iç karotis arteri geçici olarak klempleyin. Daha sonra, dış karotis arter segmentini düzeltmek için dış karotis arter distal ve ortak karotis arter üzerine dikiş bağını gerin. Şimdi, dış karotis arter üzerindeki iki dikiş bağı arasında küçük bir kesi yapmak için mikro makas kullanın. Dış karotis artere 30 milimetre uzunluğunda silikon kaplı monofilament bir sütür yerleştirin. Monofilament sütürün geri çekilmesini önlemek için bifurkasyonun yakınındaki dış karotid artere ikinci bir 5-0 poliglikolik asit emilebilir sütür ilmek atın ve hafifçe bağlayın. Ardından, kalıcı ligasyonun distalindeki dış karotis arteri tamamen kesin ve arter forseps klempini iç karotis arterden çıkarın. Daha sonra, sütürü ortak karotis arterin çatallanmasına geri çekin. Dış karotis arter kütüğünü dikkatlice geri çekin ve döndürün. Sütür yönünü ayarlayın ve orta serebral arteri bloke etmek için ortak karotis arter bifurkasyonundan 9 ila 10 milimetre uzakta internal karotis artere yerleştirin. Daha sonra, ikinci poliglikolik asit emilebilir sütürü dış karotis arterin etrafına sıkın ve arter klempini ortak karotis arterden çıkarın. Fareyi yeniden uyuşturduktan sonra, bir mikroklips arter klempi kullanarak, ortak karotis arteri klempleyin. Silikon kaplı uç iç karotis arterden görünür hale gelene kadar monofilamenti iç karotis arterden kısmen geri çekin. Ardından, silikon kaplı ucun üzerindeki iç karotis artere başka bir mikroklip arter kelepçesi yerleştirin. Monofilamenti tamamen geri çekin ve dış karotis arter kütüğünü sıkıca kaldırın. Son olarak, mikroklip arter klempini sırasıyla iç karotis arterden ve ortak karotis arterden çıkarın. Başlamak için, kuyruk damarını tamamen hiperemik hale getirmek için farenin kuyruğunu alkole batırılmış bir pamuk topuyla silin. Cerrahi makas kullanarak kuyruk ucunu bir ila iki milimetre kesin. Kesiden kan akışını kolaylaştırmak için kuyruğun kökü boyunca uca kadar hafifçe sıkın. Ardından, test kağıdının numune emme tankını kan damlasının kenarına yerleştirin. Kan şekeri ölçüm cihazı okumasını okuyun ve sonucu kaydedin. Serebral kan akışı ölçümü için, lazer doppler akış ölçer prob ucunu sabit bir akı okunana kadar sol parietal kafatasının yüzeyine dik tutun ve bu değeri kaydedin. Ötenazi yapılmış MCAO faresinin beynini çıkardıktan sonra, beyin dokusunu bir kemirgen beyin matrisine yerleştirin ve iki milimetrelik koronal dilimler halinde kesin. Dilimleri 24 oyuklu bir plakaya aktarın ve 2 santigrat derecede %2,3,5-Trifeniltetrazolyum Klorür çözeltisi ile 37 dakika inkübe edin. Daha sonra, doku bölümlerini 24 oyuklu plakadan kavisli forseps ile kırpın ve cam tarama plakasına yerleştirin. Sabit beyin dilimini üç dakika boyunca hematoksilen çözeltisi ile boyayın. Dilimi beş saniye boyunca %5 hidroklorik asit alkole batırarak ayırt edin. Ardından, gradyan etanol çözeltileri ve ksilen kullanarak dilimi kurutun ve hyalinize edin. Bölümü nötr reçinelerle monte edin. MCAO'dan 23 saat sonra, fareye %2 Evans Blue solüsyonu enjekte edin ve beyni alın. Dokuyu homojenize ettikten ve santrifüjledikten sonra, süpernatan sıvıyı başka bir santrifüj tüpüne aktarın ve etanol ile dört kat seyreltin. Bir spektrofotometre kullanarak süpernatan sıvının emilimini 620 nanometrede ölçün. MCAO'dan 24 saat sonra kuyruk damarına FITC-dekstran enjekte edin ve 10 dakika boyunca kanda dolaşmasına izin verin. Beyin dokusunu sabitledikten sonra, beyin dokusunu en uygun kesme sıcaklığı bileşiği kullanarak gömün ve 30 mikrometre kalınlığında bölümler halinde kesin. Kesitleri, slaydın yüzeyine yapıştıklarından emin olarak bir aşılama halkası kullanarak bir mikroskop lamına aktarın. Beyin dokusu bölümlerini 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol içeren bir montaj ortamı kullanarak monte edin. Glukoz enjekte edilen farelerde MCAO sonrası kan şekeri seviyeleri, salin gruplarına kıyasla önemli ölçüde artmıştır. Serum fizyolojik veya glukoz grubu ile sham beyin dilimlerinde gözle görülür bir enfarktüs gözlenmedi. Glukoz grubu olan MCAO, salin grubu olan MCAO'ya kıyasla önemli ölçüde daha büyük bir serebral enfarktüs hacmi gösterdi. MCAO'nun iskemik hemisferinde glukoz grubu ile diğer gruplarda bulunmayan multipl punktat kanamalar gözlendi. MCAO'da glukoz grubu ile korteks ve striatumun enfarktüs bölgelerinde önemli kan hücresi infiltrasyonu kaydedildi. Evans Blue geçirgenliği ve FITC-dekstran sızıntısı, glukoz grubundaki MCAO'da salin grubuna göre belirgin şekilde daha yüksekti.