Name: Kadın Drosophila melanogaster Germline Kök Hücre Nişlerinin Genişletilmiş Canlı Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-20T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Keşfedin Drosophila melanogaster yumurtalık nişindeki germline kök hücrelerinin asimetrik bölünmesinin canlı görüntülenmesi yöntemini. GFP füzyonu ile spektrozom dinamikleri ve hücre döngüsü gözlemlenir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El yazması hakkındaki yararlı yorumları için Acaimo González Reyes ve María Olmedo López'e teşekkür ederiz. Bu çalışma PID2021-125480NB-I00 (H. S-G), Junta de Andalucía'dan (JGM) "Ayudas a la contratación de personal Investigador Doctor", VI ve VII PPIT-Seville Üniversitesi'nden (PR) "Ayuda a proyectos de investigación precompetitivos" ve VI PPIT-Seville Üniversitesi'nden (PRR) "Contrato de Acceso de I+D+i" tarafından desteklenmiştir. Orijinal yayından (doi:10.1242/DEV.199716) uyarlanan görüntüleri paylaşma haklarını nazikçe sağladığı için Company of Biologists Ltd'ye teşekkürlerimizi sunarız.

NOT: Adım 1.4 en az 2 gün önceden yapılmalıdır. Adım 2.1 ve 2.2 1 gün önceden yapılabilir.
1. Deney öncesi düzenek I
<ol>
	<li>100 μL streptomisin / penisilin antibiyotik karışımı (10.000 U / mL penisilin ve 10 mg / mL streptomisin) hazırlayın ve kullanana kadar -20 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Otoklavlanmış saf su kullanarak aşağıdaki solüsyonlardan 15 mL hazırlayın, 4 ° C'de saklayın ve bir ay içinde kullanın: Sodyum bikarbonat (NaHCO3) 0.1 M pH 8.0 ve% 0.1 Tween 20.</li>
	<li>Kontaminasyonu önlemek için aşağıdaki kültür ortamını ve çözeltiyi laminer bir akış başlığında hazırlayın. Sterilize edilmiş filtre uçları ve tüpleri kullanın.
	<ol>
		<li>2 mL seyreltilmemiş fetal sığır serumu (FBS) hazırlayın ve aseptik koşullarda kullanılana kadar -20 ° C'de saklayın.</li>
		<li>%15 FBS ve %0.6 streptomisin/penisilin antibiyotik karışımı ile desteklenmiş Schneider Drosophila besiyerini hazırlayın. 7 mL alikot hazırlayın ve 4 °C'de saklayın. İki MatTek plakası için bir alikot yeterlidir (bkz. bölüm 2).
		<ol>
			<li>Ringer çözeltisini hazırlayın (128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 35.5 mM Sükroz, otoklavlanmış saf suda 5 mM Hepe; pH 6.9). 1 mL alikot hazırlayın ve kullanana kadar -20 °C'de saklayın.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GFP'ye (poli Ubiquitin-mGFP6: :p ar-1 hattı) kaynaşmış Par-1 proteinini yapısal ve her yerde ifade eden 1-2 günlük sinekleri, maya tozu ile desteklenmiş sinek yemi içeren yeni bir tüpe toplayın. Diseksiyondan önce bir inkübatörde 25 ° C'de 2 gün boyunca kültürleyin. 
	NOT: Bu adım, ilgilenilen herhangi bir floresan etiketli muhabir ile yapılabilir.</li>
</ol>
2. Cam alt plaka kaplama ve hazırlama
<ol>
	<li>35 mm'lik poli-D-lizin kaplı bir plakanın (cam alt tabak, bkz. Malzeme Tablosu) lamel ortasına 3 μL'lik bir damla belirli bir Cell-Tak yapıştırıcısı (bundan böyle hücre ve doku yapıştırıcısı olarak anılacaktır) yerleştirin. Steril uçlar kullanın. 
	NOT: Hücre ve doku yapıştırıcısı 4 °C'de saklanmalıdır. İki genetik koşulla (tipik olarak, kontrol ve mutant koşullar) yapılan deneylerde, aynı cam alt plakaya iki ayrı, iyi ayrılmış yapıştırıcı damlası yerleştirin. Bu, her iki genetik arka planın da aynı koşullarda görüntülenmesini sağlayacaktır.</li>
	<li>Hemen ardından, üreticinin önerdiği şekilde 3 μL'lik yapışkan damlaya eşit hacimde (bu protokol kurulumunda 3 μL) 0,1 M NaHCO3 pH 8,0'ı dikkatlice ekleyin ve pipetleyerek karıştırın.</li>
	<li>Tam buharlaşma için, plakayı oda sıcaklığında (RT) 20 dakika inkübe edin ve ardından ertesi gün kullanılmak üzere gece boyunca 4 °C'de tutun. Alternatif olarak, hazırlanan plakayı 37 °C'de 25 dakika boyunca tamamen buharlaşana kadar inkübe edin ve doğrudan bir sonraki adıma geçin. Her iki durumda da plakayı kapağıyla birlikte koruyun. Steril uçlar kullanın.</li>
	<li>Hazırlanan cam tabanlı tabağı kullanmadan önce 15-20 dakika tezgahın üzerine koyarak RT'ye ulaşmasını sağlayın.</li>
	<li>Hazırlanan plakayı 3 kez dikkatlice yıkayın. Yapışkan tabakaya/tabakalara dokunmaktan ve onları rahatsız etmekten kaçının. Her yıkamada, 6 μL otoklavlanmış saf su ekleyin ve ardından NaHCO3 çözeltisinin kalıntılarını ortadan kaldırmak için üç yıkamanın her biri için temiz bir uç kullanarak suyu çıkarın.</li>
	<li>Toz parçacıklarını önlemek için kapağı kapalı olarak 5-10 dakika diseksiyon yaparken temiz ve hazırlanmış plakayı RT'ye yerleştirerek suyun tamamen buharlaşmasına izin verin.</li>
</ol>
3. Drosophila over diseksiyonu ve yumurtalık izolasyonu ve montajı
NOT: Yumurtalık diseksiyonu, numune dokusunun yapıştırıcıya yapışmasını engelleyebilecek proteinlerin varlığını önlemek için FBS olmadan Ringer solüsyonunda (Schneider ortamı yerine) gerçekleştirilir.
<ol>
	<li>Başlamadan önce üç kuyulu bir diseksiyon kabını, forsepsleri ve diseksiyon iğnelerini %70 etanol ile temizleyin.</li>
	<li>Üç kuyucuğun her birine yeterli hacimde (~ 200 μL) Ringer çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Maya ile beslenen 5 dişinin yumurtalıklarını, standart prosedürleri izleyerek iki çift forseps yardımıyla ilk kuyucukta 200 μL Ringer solüsyonunda diseksiyon yapın10,11. Drosophila dişisini forsepslerden biriyle göğüs ve karın bölgesinin kesiştiği noktada tutun. Ardından, kütikülü arka karın bölgesinden nazikçe yırtın ve iki yumurtalık açığa çıkana kadar karın kütikülünü çekin.</li>
	<li>Diseksiyondan kaynaklanan diğer doku kalıntıları veya döküntülerle kontaminasyonu azaltmak için diseke edilen yumurtalıkları ikinci kuyuya aktarın.</li>
	<li>Işık yayan diyot (LED) aydınlatmalı ve ince uçlu forsepsli bir stereomikroskop (zoom 8X-13.5X) yardımıyla 15-20 yumurtalığın kas kılıfını çıkarın. Yumurtalığın tüm vücudunu sabitlemek için bir çift forseps kullanın ve ikincisini geç evre bir yumurta odasını düzgün bir şekilde tutmak için kullanın ve kas kırılıp geride kalana kadar hafifçe gerin. 
	NOT: Yumurtalıkların bu kısmı ile teması azaltarak germariaya zarar vermekten kaçınmak önemlidir. 8-9. aşamalardan daha eski yumurta odalarını çıkarın.</li>
	<li>Forseps kullanarak 15-20 kas kılıfı içermeyen yumurtalıkları birer birer 200 μL Ringer ortamı içeren üçüncü kuyucuğa aktarın.</li>
	<li>20-200 μL'lik bir ucu pipetleme ile %0,1 Tween 20 ile önceden ıslatın. Bu, yumurtalıkların ucun plastik duvarlarına yapışmasını önler.</li>
	<li>Önceden ıslatılmış bir uç kullanarak kas kılıfı içermeyen yumurtalıkları içeren 6 μL Ringer solüsyonunu hazırlanan yapışkan plakaya aktarın (RT'de tutulur). 
	NOT: Yumurtalık birikiminden sonra germaria dekolmanı önlemek için uç ile yapışkan tabaka arasındaki tüm temastan kaçının (sonraki adım). Germariaların yaklaşık% 30'u beklendiği gibi yapışmaz.</li>
	<li>Aktarılan yumurtalıkların yapışkan yüzeye yapışmasını sağlamak için, bir diseksiyon iğnesi veya forseps kullanarak yapışkan yüzeye temas edene kadar Ringer'ın damlasının dibine dikkatlice bastırın. 
	NOT: Yumurtalıklar yerleştikten sonra yeniden düzenlemeye çalışmayın.</li>
	<li>MatTek plakasını %15 FBS ve %0.6 streptomisin/penisilin antibiyotik karışımı ile desteklenmiş 3 mL Schneider besiyeri ile dikkatlice doldurun (adım 1.3). Yumurtalıkların ayrılmasını önlemek için, plakanın dış kenarı etrafına bir seferde 1 mL yavaşça ekleyin.</li>
	<li>Kas kılıfsız yumurtalıkları içeren plakayı düz bir yüzey üzerinde mikroskop istasyonuna taşıyın.</li>
</ol>
4. Konfokal mikroskop kullanarak canlı görüntüleme
<ol>
	<li>Plakayı, dönen diskli bir mikroskobun veya konfokal bir mikroskobun (benzer ekipman kullanılabilir) 63x objektifine yerleştirin ve numuneyi odaklayın. Her germaryum için orta z düzlemini seçin.</li>
	<li>Aşağıdaki deneysel parametreleri yapılandırın: yakalama türü: 3D hızlandırılmış, 70/100 lazer gücünü ayarlayın, uyarma dalga boyu: 488 nm, z yığını aralığı: 30 μm ve Z yığınları arasındaki mesafe: 1,2 μm, süre: 17 saat, zaman noktaları arasındaki aralık: her 10 dakikada bir.</li>
	<li>Varsa, çok konumlu bir seçenek kullanarak, numunelerin XY koordinatlarını yeniden tanımlayın ve z-yığınları bu konumda ortalanacağından, her germaryumun ortasında bir Z-düzlemi seçin. Satın alma işlemini başlatın. 
	NOT: Bir germanyumun normal genişliği 30 μm olduğundan, her Z yığını ~ 25-27 bölüm olacaktır. Konfokal'a bağlı olarak, 10 dakikalık aralıklarla en az 25 germaria görüntülenebilir. Normalde, 40x/1.30 NA veya 63x/1.40 NA yağa daldırma, planapo düzeltmeli objektifler kullanılır.</li>
	<li>Imaris veya ImageJ (Fiji) yazılımını kullanarak spektrozom morfolojisindeki belirli değişiklikleri görselleştirmek için görüntüleri zaman ve Z ekseninde analiz edin12,13. Gözlemlerindeki belirli zamanlar görüntülenir (Şekil 1B'). Filmleri monte etmek için her zaman noktasında en iyi Z düzlemini manuel olarak seçin.</li>
</ol>

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

<ol><li>Li, L., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+niche%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem cell niche: structure and function.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 605-631 (2005).</li>
<li>Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+physiological+control+of+germline+stem+cell+lineages+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Local and physiological control of germline stem cell lineages in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 213 (1), e234(2019).</li>
<li>Eliazer, S., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+niche%3A+studies+from+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Finding a niche: studies from the Drosophila ovary.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45(2011).</li>
<li>Rojas-Ríos, P., Guerrero, I., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme-mediated+delivery+of+Hedgehog+regulates+the+expression+of+bone+morphogenetic+proteins+to+maintain+germline+stem+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoneme-mediated delivery of Hedgehog regulates the expression of bone morphogenetic proteins to maintain germline stem cells in Drosophila.</a> PLoS Biol. 10 (4), e1001298(2012).</li>
<li>Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+plasticity+of+stem+cell+niches%3A+a+general+property+behind+tissue+homeostasis+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the plasticity of stem cell niches: a general property behind tissue homeostasis and repair.</a> Stem Cells. 32 (4), 852-859 (2014).</li>
<li>Deng, W., Lin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrosomes+and+fusomes+anchor+mitotic+spindles+during+asymmetric+germ+cell+divisions+and+facilitate+the+formation+of+a+polarized+microtubule+array+for+oocyte+specification+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Spectrosomes and fusomes anchor mitotic spindles during asymmetric germ cell divisions and facilitate the formation of a polarized microtubule array for oocyte specification in Drosophila.</a> Dev Biol. 189 (1), 79-94 (1997).</li>
<li>Huynh, J. R., Shulman, J. M., Benton, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-1+is+required+for+the+maintenance+of+oocyte+fate+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PAR-1 is required for the maintenance of oocyte fate in Drosophila.</a> Development. 128 (7), 1201-1210 (2001).</li>
<li>Villa-Fombuena, G., Lobo-Pecellín, M., Marín-Menguiano, M., Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+Drosophila+ovarian+niche+shows+spectrosome+and+centrosome+dynamics+during+asymmetric+germline+stem+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the Drosophila ovarian niche shows spectrosome and centrosome dynamics during asymmetric germline stem cell division.</a> Development (Cambridge). 148 (18), dev199716(2021).</li>
<li>De Cuevas, M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+Drosophila+fusome+and+its+implications+for+oocyte+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the Drosophila fusome and its implications for oocyte specification.</a> Development. 125 (15), 2781-2789 (1998).</li>
<li>Wong Li, C., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Drosophila ovaries.</a> J Vis Exp. (1), 52(2006).</li>
<li>Merkle, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection%2C+fixation%2C+and+standard+staining+of+adult+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissection, fixation, and standard staining of adult Drosophila ovaries.</a> Methods Mol Biol. 2626, 49-68 (2023).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+correction+ImageJ+plugin+for+compensating+the+photobleaching+of+time-lapse+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences.</a> F1000Res. 9, 95(2020).</li>
<li>Duan, T., Cupp, R., Geyer, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+female+germline+stem+cells+undergo+mitosis+without+nuclear+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila female germline stem cells undergo mitosis without nuclear breakdown.</a> Curr Biol. 31 (7), 1602-1610 (2021).</li>
<li>Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+imaginal+disc+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila imaginal disc development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (32), 14217-14222 (2010).</li>
<li>Dye, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods Mol Biol. 2540, 275-285 (2022).</li>
<li>Sohr, A., Du, L., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+Drosophila+wing+imaginal+disc+culture+and+furin+inhibitor+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ex vivo Drosophila wing imaginal disc culture and furin inhibitor assay.</a> Bio Protoc. 9 (16), e3336(2019).</li>
<li>Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+reveals+hub+cell+assembly+and+compaction+dynamics+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+testis+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche.</a> Dev Biol. 446 (1), 25-34 (2019).</li>
<li>Gärthner, S. M. K., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+Drosophila+pupal+testis+and+single+male+germ-line+cysts%3A+dissection%2C+imaging%2C+and+pharmacological+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment.</a> J Vis Exp. 91, e51868(2014).</li>
<li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Dev Cell. 50 (3), 296-310 (2019).</li>
<li>Jackson, J. A., Imran Alsous, J., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+nurse+cell+behavior+in+late+stages+of+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging of nurse cell behavior in late stages of Drosophila oogenesis.</a> Methods Mol Biol. 2626, 191-206 (2023).</li>
<li>Díaz de la Loza, M. C., Díaz-Torres, A., Zurita, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+levels+regulate+tissue+migration+and+anterior-posterior+polarity+during+egg+morphogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Laminin levels regulate tissue migration and anterior-posterior polarity during egg morphogenesis in Drosophila.</a> Cell Rep. 20 (1), 121-133 (2017).</li>
<li>Christophorou, N., Rubin, T., Bonnet, I., Piolot, T., Arnaud, M., Huynh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-driven+nuclear+rotations+promote+meiotic+chromosome+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule-driven nuclear rotations promote meiotic chromosome dynamics.</a> Nat Cell Biol. 17 (11), 1388-1398 (2015).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cardiac excitation-contraction coupling.</a> Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li>
<li>Zielke, N., Korzelius, J., van Straaten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fly-FUCCI%3A+a+versatile+tool+for+studying+cell+proliferation+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Fly-FUCCI: a versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues.</a> Cell Rep. 7 (2), 588-598 (2014).</li>
<li>Hinnant, T. D., Alvarez, A. A., Ables, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+remodeling+of+the+cell+cycle+accompanies+differentiation+in+the+Drosophila+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal remodeling of the cell cycle accompanies differentiation in the Drosophila germline.</a> Dev Biol. 429 (1), 118-131 (2017).</li>
<li>Hsu, H. J., LaFever, L., Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+controls+normal+and+tumorous+germline+stem+cells+via+insulin-dependent+and+-independent+mechanisms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Diet controls normal and tumorous germline stem cells via insulin-dependent and -independent mechanisms in Drosophila.</a> Dev Biol. 313 (2), 700-712 (2008).</li>
<li>Andersen, D., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+ovarian+muscle+contraction+and+oocyte+growth+on+egg+chamber+elongation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila.</a> Development (Cambridge). 143 (8), 1375-1382 (2016).</li>
<li>Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mononuclear+muscle+cells+in+Drosophila+ovaries+revealed+by+GFP+protein+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps.</a> Dev Biol. 314 (2), 360-372 (2008).</li>
<li>Ables, E. T., Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+E+controls+Drosophila+female+germline+stem+cell+maintenance+independently+of+its+role+in+proliferation+by+modulating+responsiveness+to+niche+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Cyclin E controls Drosophila female germline stem cell maintenance independently of its role in proliferation by modulating responsiveness to niche signals.</a> Development (Cambridge). 140, 4267-4276 (2013).</li>
<li>Lin, H., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cell+division+and+egg+chamber+development+in+transplanted+Drosophila+germaria%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline stem cell division and egg chamber development in transplanted Drosophila germaria.</a> Dev Biol. 159 (1), 140-152 (1993).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Burada, Drosophila melanogaster GSC nişini 16 saate kadar uzun bir süre boyunca izlemek için bir protokol sunuyoruz. Drosophila biyolojik süreçlerini ex vivo olarak filme almak için protokollerin çoğu daha kısa zaman pencerelerine odaklanır ve hayali kanat diskleri 15,16,17, embriyo gonadları 18,19 veya yumurtalıklar 20,21,22,23 için birden fazla örnek bulunabilir . Elbette, görüntü elde etme süresi, incelenen gelişim sürecine bağlıdır. Geçici olaylar, hücre tipine ve fizyolojik koşullara24 bağlı olarak milisaniyelerden saniyelere kadar değişebilen bir aralıkta meydana gelebilirken, hücre bölünmesi gibi diğer süreçlerin gözlemlenebilir olması için saatlerce veya günlerce çekim yapılması gerekebilir. Özellikle, Drosophila dişi GSC'lerin hücre döngüsünün tamamlanması yaklaşık 12-14 saat sürer25. Villa-Fombuena ve ark. (2021)8, spektrozom morfolojisindeki değişikliklerin incelenmesiyle belirlendiği üzere, tam döngünün süresinin tahmini 15,5 saatti. Bu görüntüleme yönteminin kromatin belirteçleri ve/veya Fly-FUCCI teknolojisi26 ile kombinasyonu, bir GSC'nin tipik olarak her 15.5 saatte bir bölündüğünü ve hücre döngüsü fazlarının ortalama sürelerinin şu şekilde olduğunu gösterdi: M (Yuvarlak şekil, 22 dakika), G1 (Yuvarlak G1, Fiş ve Çubuk şekilleri, 3.45 saat), S (Kaynaştırma şekli, 43 dakika) ve G2 (Kaynaştırma, Ünlem işareti ve Yuvarlak şekiller, 10,5 saat). Hücre döngüsü fazlarının sürelerine ilişkin ham veriler Villa-Fombuena ve ark.8'de gösterilmiştir. Bu gözlemler, GSC hücre döngüsünü ve duman morfolojisini25,27,28 analiz etmek için sabit görüntüleme kullanan önceki çalışmalarla tutarlıydı. Ayrıca, bu in vivo yöntem, duman bu olaylarda önemli bir rol oynadığından, aşağı akış oosit seçiminde anormal GSC bölünmesinin ve/veya spektrozom dinamiğinin aşağı akış sonuçlarının deşifre edilmesine yardımcı olabilir. Ayrıca, bu protokol, yerleşik veya yeni mutantlarda GSC bölünme oranını analiz etmek için uygulanabilir.
Uzun saatler boyunca görüntülerin sürekli olarak elde edilmesi, esas olarak doku bütünlüğünün ve işlevselliğinin korunması ve numunenin floresansının korunması olmak üzere dikkate alınması gereken bir dizi kritik konuyu ifade eder. Niş hücrelerin uygun çevresel koşullarının korunması, arızayı, stresleri, hücre döngüsünün durmasını veya hücre ölümünü önlemek için gereklidir. Bu çalışmadaki koşullarda, GSC'ler, çekim sırasında 12 saat veya daha uzun bir süre sonra bile doku sağlığını belirtmek için kritik bir adım olan mitoza girebilir. Bu nedenle, kültürlenmiş germaria'nın görüntüleme süresinin çoğunda bütünlüğünü ve işlevselliğini koruduğunu tahmin ediyoruz. Benzer şekilde, hücre döngüsü boyunca GFP:Par-1 malzemesinin yeni üretimi nedeniyle (bakınız Villa-Fombuena ve diğerleri 2021)8 ve görüntü alımını yalnızca 10 dakikada bire indirdiğimiz için, filmlerin sonuna daha yakın zaman noktaları bile analizlerine izin verecek kadar yeterli sinyali korur. Her durumda, numune ağartma, ağartma düzeltmesi13 gibi eklentiler tarafından potansiyel olarak düzeltilebilir.
Uygun bir ortamı ex vivo taklit etmek için, böcek dokuları, özel takviye ile çekim sırasında belirli bir saat boyunca Schneider'in ortamı kullanılarak muhafaza edilebilir. Daha da önemlisi, bu protokol FBS dışında büyüme faktörleri veya sinek özü kullanmaz. Önceki bir çalışma, birçok GSC'nin normalde G2'de tutuklandığını ve yüksek İnsülin seviyeleri25 ile M fazına girdiğini göstermiştir. Bu nedenle, GSC hücre döngüsünün bu anormal uyarılmasını önlemek için kültür koşullarına insülin eklemiyoruz. Diseksiyon ortamına FBS eklenmesi, yumurtalık transferi sırasında yumurta odacıklarının pipet ucuna veya cam kaba yapışma olasılığını da azaltabilir21. Son olarak, bakteri ve/veya mantar çoğalmasını önlemek için uzun süreli filmler için antibiyotik kullanımı uygundur. Kültür kaplarında mikroorganizmaların aşırı büyümesi, dokunun homeostazını değiştirebilir ve bu nedenle hücre bölünmesini etkileyebilir. Bu protokolde, ortam bir antibiyotik karışımı içerir (tipik olarak %1 (100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin) takviye edilir. Benzer şekilde, uzun inkübasyonlar antibiyotiklerin etkinliğini etkileyebilir ve antibiyotik bozulmasını önlemek için ortamın değiştirilmesi düşünülebilir.
Drosophila germaria, bu dokuya özgü peristaltik, dönme ve büzülme hareketlerini önlemek için çıkarılması gereken boru şeklinde bir kas kılıfı ile çevrilidir29,30. Bu nedenle, bu kas kılıfının çıkarılması, raportör sinyallerinin gözlemlenmesini iyileştirir, sinyal ağartmasını ve fotohasarı en aza indirmek için konfokal ayar konfigürasyonlarının kullanılmasına izin verir ve yüksek zaman çözünürlüklü görüntüler sağlar. Olumsuz tarafı, kas kılıfının dokunun homeostazına katkısı hala bilinmemektedir. Bu nedenle, çıkarılması bir şekilde GSC nişinin normal işleyişini etkileyebilir. Sistemin bir diğer dezavantajı, germaria'nın filme alma sırasında yapıştırıcıdan ayrılabilmesi ve çevredeki ortamda sürüklenebilmesidir. Bu nedenle, görüntüler zaman noktaları içinde ve hatta verilen z serisinin elde edilmesi sırasında değişebilir. Bu durumda, ImageJ'de örnek hareketini düzeltmek için kayıt yöntemleri12 gibi farklı eklentiler kullanılabilir.
Özetle, canlı germaria'nın genişletilmiş filmlerini elde etmek için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, GSC hücre döngüsünün ayrıntılı bir tanımına ve spektrozom dinamiklerinin GSC hücre döngüsünün farklı fazları ile nasıl ilişkili olduğuna izin vermiş olsa da, protokolümüzün doğasında bulunan bazı sınırlamaların farkındayız. Her şeyden önce, görüntü elde etme, çevresel koşulların in vivo koşulları tam olarak özetlemediği yapay bir ortamda gerçekleşir. Bununla birlikte, farklı hücre döngüsü fazları sırasında spektrozom morfolojisi ile ilgili olarak, sabit doku31 kullanan diğer yazarlar tarafından bildirilenlerden benzer sonuçlar elde ettiğimiz için, bu protokolün in vivo koşulları büyük ölçüde özetlediğine inanıyoruz. İkincisi, doku bütünlüğü ve işlevselliği 16 saat uzunluğundaki kültürlerden etkilenmemiş gibi görünse de, bunu dikkatli bir şekilde değerlendirmedik. İdeal olarak, filme alınmış germaria bir kadın karnına geri nakledilebilir ve kontrol germaria'nın32 yaptığı gibi yeni yumurta odaları üretip üretemeyeceği değerlendirilebilir. Bu çalışmada kullanılan canlı görüntüleme yöntemi, GSC asimetrik bölünmesinin analizinde, özellikle genel olarak Drosophila yumurtalık biyolojisi için değerli bir araçtır. Ek olarak, bu yaklaşım, doğrudan kültür ortamında desteklenebildikleri için kimyasal bileşiklerin, büyüme faktörlerinin veya besinlerin farmakolojik çalışmaları için özellikle uygundur. Üstelik deney ve kontrol numunelerini aynı plakaya yerleştirerek deneylerdeki teknik farklılıkları en aza indirebiliyoruz.

Biyolojik süreçlerin canlı görüntülenmesi, doğrudan deneysel kanıt elde etmede etkilidir. Gelişmiş konfokal mikroskopi ve metodolojilerin optimizasyonunun kombinasyonu, çoklu biyolojik olayların yüksek hassasiyetle araştırılmasına izin verir. Doku manipülasyonu ve diseksiyonu, numune hazırlama ve koruma ve mikroskopi edinme ayarları gibi protokollerdeki adımların optimize edilmesi, elde edilen sonuçların güvenilirliğini ve sağlamlığını en üst düzeye çıkarmak için kritik öneme sahiptir. Burada, özellikle Drosophila melanogaster yumurtalıklarına odaklanan genişletilmiş görüntüleme için numuneleri izlemek için bir protokol sunuyoruz. Drosophila melanogaster yumurtalığı, çok çeşitli gelişimsel süreçlerin analizi için mükemmel bir model sistemdir. Diğerlerinin yanı sıra, meyve sineği Drosophila melanogaster'in bu üreme organı, çok iyi tanımlanmış bir yetişkin kök hücre nişi içerir. Bu GSC nişi, yetişkinlik döneminde dişi gametlerin gelişimini sürdürür. Drosophila yumurtalıkları, germaryumda yumurta odalarının geliştiği yaklaşık 18 yumurtalıktan oluşur. Her germaryumun ucunda, 2-4 GSC, esas olarak 8-10 hücreli bir terminal filament, 5-8 başlık hücreli bir rozet ve 2-3 ön eskort hücresi tarafından oluşturulan somatik bir hücresel niş içinde tutulur (Şekil 1A). Bu somatik niş, GSC'lere köklerini korumak, çoğalmayı kontrol etmek ve farklılaşmayı önlemek için gerekli sinyalleri ve fiziksel desteği sağlar1,2,3,4,5.
GSC'ler normalde asimetrik olarak bölünerek somatik niş ile teması sürdüren yeni bir kök hücre ve somatik başlık hücreleriyle doğrudan temasını kaybeden ve farklılaşan bir yavru hücre olan sistoblast (CB) oluşturur. GSC'ler ve CB'ler, ana işlevi mitoz6 sırasında mitotik iğin doğru oryantasyonu olan spektrozom olan oldukça dinamik ve sitoplazmik bir organel içerir. CB, eksik sitokinez ile 4 kez bölünür ve 16 hücreli kistler geliştirir, burada germ hattı hücrelerinden biri oositi belirtir ve diğer 15 hücre hemşire hücreleri haline gelir. CB spektrozomu, 16 hücreli birbirine bağlı germ hattı hücrelerini birbirine bağlayan fusome adı verilen dallı bir yapıya dönüşür. Spektrozom, serin-treonin kinaz Par-1 ve zar bileşeni Hu-li tai shao (Hts)7 gibi küçük veziküller ve iskelet proteinleri açısından zenginleştirilmiştir. GSC hücre döngüsü sırasında, spektrozom yeni materyalin eklenmesiyle büyür ve şeklini değiştirerek G1, S, G2 ve M fazlarının tanımlanmasına izin verir (Şekil 1B)8,9.
Yakın zamanda, canlı GSC'lerin 16 saate kadar görüntülenmesine izin veren Drosophila germarium'un ex vivo kültür yöntemini uyguladık. Bu hücreler ortalama olarak her 15,5 saatte bir bölündüğünden8, bu yöntem GSC hücre döngüsünün büyük bölümlerinin filme alınmasına izin verir. Bu nedenle, diğer araçlarla birlikte, kültürleme yöntemimiz, GSC hücre döngüsü sırasında spektrozom morfolojisinin tanımlanmasına ve farklı hücre döngüsü fazlarının in vivo8 (Şekil 1C) süresinin analizine izin vermiştir. Burada, metodolojiyi açıklayan adım adım rehberli bir video ile desteklenen bu genişletilmiş canlı görüntüleme yönteminin ayrıntılı bir protokolünü sunuyoruz (Şekil 2).

<table><tbody><tr><td>9 oyuklu cam plaka</td><td>Corning&nbsp;</td><td>7220-85</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3881</td><td>CaCl2&middot; </alt>2H<alt>2</alt>O; Ringer çözeltisini hazırlamak</td></tr><tr><td>için Cell-Tak</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354240</td><td>Hücre ve Doku Yapıştırıcısı, hücreleri veya doku bölümlerini plastik, cam, metal, FEP Polimer ve biyolojik malzemeler dahil olmak üzere birçok yüzey türüne yapıştırmak için kullanılır.</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forseps&nbsp;</td><td>Finescience</td><td>11252-20</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Dumont #55 Forseps&nbsp;</td><td>Finescience</td><td>11255-20</td><td>Boyutlar 0,05 mm x 0,02 mm ve uzunluk 11 cm</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td>Nitelikli, ısı ile etkisizleştirilmiş, AB onaylı, Güney Amerika Menşei&nbsp;</td></tr><tr><td>Cam alt tabaklar</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td>35 mm Çanak, No. 1.5 Lamel, 10 mm Cam Çapı,&nbsp; Poli-D-Lizin Kaplı</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>Ringer çözeltisini hazırlamak için</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td>MgCl2; Ringer solüsyonunu hazırlamak için</td></tr><tr><td>İğne Tutucu</td><td>Roboz&nbsp;</td><td>RS-6061</td><td>Hafif, içi boş paslanmaz çelik sap; 4 3/4 "Uzunluğunda.</td></tr><tr><td>Nikon SMZ18 dürbün&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>https://www.microscope. healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>10.000 U/mL</td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td>KCl; Ringer'ın çözümünü hazırlamak için</td></tr><tr><td>Schneider's Drosophila Medium</td><td>Biowest&nbsp;</td><td>L0207</td><td>Böcek hücreleri için hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8875&nbsp;</td><td>NaHCO<alt>3</alt>; &ge; % 99,5, toz</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td>NaCl; Ringer solüsyonunu hazırlamak için</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td>&ge; %99,5 (GC); Ringer solüsyonunu hazırlamak için</td></tr><tr><td>Tungsten Diseksiyon İğnesi</td><td>Roboz&nbsp;</td><td>RS-6064</td><td>0,25 mm, Ultra İnce, 1 Mikron Uç (Pk 10)</td></tr><tr>Moleküler biyoloji için <td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>, viskoz sıvı</td></tr><tr><td>Maya tozu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51475</td><td>n/a</td></tr></tbody></table>

kadın drosophila melanogaster germline kök hücre nişlerinin genişletilmiş canlı görüntülenmesi

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Canlı görüntüleme yöntemleri, dinamik hücresel süreçlerin ayrıntılı ve gerçek zamanlı olarak analiz edilmesini sağlar. Drosophila yumurtalık, zaman içinde hücre bölünmesi, gövde, farklılaşma, göç, apoptoz, otofaji, hücresel yapışma vb. gibi sayısız gelişimsel sürecin dinamiklerini keşfetmek için mükemmel bir modeli temsil eder. Son zamanlarda, dişi Drosophila GSC nişinin genişletilmiş bir ex vivo kültürünü ve canlı görüntülemesini uyguladık. Örnek olarak bir GFP::P ar-1 transgeni barındıran bir Drosophila hattı kullanan bu yöntem, GSC'lerin nişleri içindeki asimetrik bölünmesinin görselleştirilmesine ve hücre döngüsü boyunca spektrozom morfolojisindeki değişikliklerin tanımlanmasına izin verir. Burada, Drosophila germaria'nın ex vivo kültürü için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz ve bu da dişi GSC nişinin uzun süreli görselleştirilmesini sağlıyor. Daha da önemlisi, bu protokol, stok merkezlerinde ve / veya Drosophila araştırma topluluğunda bulunan çok sayıda floresan etiketli ilgili proteine sahip canlı görüntüleme GSC'lerine geniş ölçüde uygulanabilir.

Bu genişletilmiş canlı görüntüleme protokolü ile, belirgin biyolojik bozulmalar olmaksızın, dişi GSC'lerin niş içerisindeki asimetrik mitozunu kaydedebiliriz. Bunun için, GSC hücre döngüsü boyunca beş farklı spektrozom morfolojisini (Yuvarlak, Tıpa, Çubuk, Birleşen ve Ünlem işareti) ayırt eden, GFP::Par-1 proteinini yaygın olarak eksprese eden germaria'lar kullanıyoruz (Şekil 1B,C). Daha ayrıntılı bir açıklama ile, Yuvarlak-G2 spektrozomunun güçlü GFP:Par1 sinyalinin (Şekil 1C, panel a) G2-M-G1 evreleri boyunca önemli ölçüde azaldığını gözlemledik. Önemli bir nokta olarak, bu transgenik hattın kullanımı, GFP::Par-1'in çoğunun erken profaz sırasında spektrozomu terk edip sitoplazmayı doldurması nedeniyle GSC'lerin mitoza girişinin görselleştirilmesine de olanak tanır (Şekil 1C, panel b). Ek olarak, sitoplazmik GFP::Par-1, GFP sinyalinin tam bu anda nukleoplazmaya girmesiyle, nükleer zar geçirgenliği (NEP) adımının kesin olarak tespit edilmesini sağlar8,14 (Şekil 1C, panel b). Mitoz ve nükleer zarın yeniden oluşumundan sonra, GFP:Par1 sinyali Yuvarlak-G1 spektrozomunda kademeli olarak geri kazanılır (Şekil 1C, panel c). GFP:Par1 materyalinin Yuvarlak-G1 spektrozomuna de novo eklenmesi; Tıpa (Şekil 1C, panel d), Çubuk (Şekil 1C, panel e) ve Birleşen (Şekil 1C, panel f) spektrozom morfolojilerinin oluşumunu teşvik eder. Son olarak GFP:Par1 markörü, kontraktil aktomyozin halkasına ek olarak sitokinez sırasında oluşan mikrotübül açısından zengin proteinli bir yapı olan orta gövdenin (midbody) oluşumunun bir sonucu olarak Ünlem işareti spektrozomunun görselleştirilmesini sağlar (Şekil 1C, panel e).
<img alt="Germ hattı kök hücre farklılaşma evreleri; spektrosom morfolojisi; döngü evreleri diyagramı; mikroskopi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67389/67389fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Şekil 1"> 
Şekil 1: Canlı GSC'lerde spektrosom döngü dinamikleri.(A) Terminal filament hücreleri (TFC'ler, mavi), geçiş hücresi (TC, kırmızı), kapak hücreleri (CpC'ler, mor) ve refakatçi hücrelerden (EC'ler, gri) oluşan germ hattı kök hücre (GSC) nişinin şematik diyagramı. GSC'ler (sarı), spektrosom adı verilen karakteristik bir organel içerir (yeşil). GSC hücre döngüsü sırasında spektrosom, küresel bir şekilden uzamış bir şekle ve ardından tekrar küreye dönüşür. GSC, niş ile temasını kaybeden ve aynı zamanda küresel bir spektrosom içeren bir yavru hücre olan kistoblastı (CB, turuncu) üretmek için bölünür. CB, fusome ile birbirine bağlanmış 2-, 4-, 8- ve 16-hücreli kistler oluşturmak için eksik sitokinez ile art arda dört kez senkronize olarak bölünür. (B) Hücre döngüsü sırasında oluşan farklı spektrosom şekillerini temsil eden diyagram. (B') Spektrosom morfolojilerinin gözlemlenmesi için beklenen süre. (C) GSC nişindeki GFP::Par-1 sinyalini gösteren 17 saat uzunluğundaki bir filmin zaman noktalı görüntüleri. 0 dakikadaki (0') zaman, Çekirdek Zarı Geçirgenleştirme (NEP) işlemine karşılık gelir. Panel beş farklı spektrosom morfolojisini göstermektedir (beyaz ve yeşil ok başları): Yuvarlak (hem G2 hem G1; a ve c panelleri), Tıpa (d paneli), Çubuk (e paneli), Birleşen (f paneli) ve Ünlem işareti (e paneli, yeşil ok başı). Son spektrosom morfolojisi, 70. dakikada gösterilen ikinci GSC'ye (yeşil noktalı çizgi) aittir. GSC'ler sarı ve yeşil noktalı çizgilerle sınırlandırılmıştır. GSC bölünmesi sonrası oluşan CB'ler turuncu noktalı çizgilerle sınırlandırılmıştır. Ölçek çubuğu: 10 µm. A ve B panelleri Villa-Fombuena ve ark.8 tarafından izin alınarak uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67389/67389fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Drosophila ovariole izolasyon şeması; adımlar: MatTek hazırlığı, diseksiyon, görüntüleme; biyoloji yöntemi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67389/67389fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Şekil 2"> 
Şekil 2: Drosophila germaria'nın uzun süreli canlı görüntülemesi için Cell-Tak yapıştırıcının montaj yöntemi. (1) Yapıştırıcı ile cam tabanlı kabın hazırlanmasına yönelik adım adım süreç. (2) Ringer çözeltisinde Drosophila yumurtalık diseksiyonuna ve kaslardan arındırılmış tekil ovariole hazırlığına genel bakış. (3) Kas kılıfı olmaksızın ovariolelerin cam tabanlı kaba aktarılması. (4) Cam tabanlı kabın takviye edilmiş Schneider besiyeri ile doldurulması. (5) Ters konfokal mikroskop kullanılarak germaria'nın 10 sa ile 16 sa arasında görüntülenmesi. Bu şekil, Villa-Fombuena ve ark.8 izinle uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67389/67389fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Burada, Drosophila yumurtalık nişindeki germ hattı kök hücrelerinin (GSC'ler) asimetrik bölünmesinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Spektrozom proteini Par-1'in yeşil floresan proteini (GFP) füzyonunu her yerde ifade eden bir transgenik çizgi kullanıyoruz.

Kadın Drosophila melanogaster Germline Kök Hücre Nişlerinin Genişletilmiş Canlı Görüntülenmesi

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

extended-live-imaging-female-drosophila-melanogaster-germline-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Burada, glial hücreler göç GFP etiketli glial hücreler ile eşleştirilmiş canlı mikroskobik analizi ile gelişmekte olan Drosophila göz içine incelemek için bir protokol açıklar.

Drosophila Göz hayali Disk Glial Hücre Göç Canlı Görüntüleme

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Bireysel hazırlanması Drosophila</emCanlı Görüntüleme için> Yumurta Chambers

Bireyin GFP etiketli proteinlerin ya autofluorescent yapıların canlı görüntüleme için bir...

GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Oosit

Bu kağıdı doğrudan puparium aracılığıyla görüntü hücre davranışı hızlı bir tarama konfokal mikroskop kullanımını gösterir. Sağlam pupa davayı bırakarak, bu yöntem doğrudan çalışma zordur Drosophila bir gelişme aşamasında gözlem ve dinamik hücre süreçlerinin ölçülmesini sağlar.

Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Bu protokol, canlı Drosophila pupa göz nöroepitelini görüntülemek için etkili bir yöntem sunar. Bu yöntem, doku hareketini ve düzensiz topolojiyi telafi eder, birden fazla GFP etiketli bağlantı proteininin kullanılması yoluyla hücre sınırlarının görselleştirilmesini geliştirir ve kolayca monte edilebilen bir görüntüleme teçhizatı kullanır.

Canlı-görüntüleme Drosophila Pupa Göz

Bu protokol uzun vadeli ex vivo kültür ve Drosophila hayali diskin canlı görüntüleme için ayrıntılı bir yöntem tarif etmektedir. Göz diskin canlı görüntüleme 10 saat süre içinde fotoreseptör farklılaşma ve ommatidial dönüşünü gösterir. protokol basit ve pahalı kurulum gerektirmez.

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Hücre içi pH bir epitel kök hücre soydan canlı Drosophila yumurtalık dokusu içinde görüntüleme için bir protokol sağlar. Transgenik sinekler bir pH Biyoalgılayıcı, mCherry::pHluorin, görüntü kantitatif floresan Imaging'i kullanma Biyoalgılayıcı ifade oluşturmak, standart eğriler oluşturmak ve pH değerleri Floresans yoğunluk değerleri dönüştürmek için yöntemleri açıklanmaktadır.

Canlı Drosophila yumurtalık dokusu içinde folikül kök hücre soyundan Imaging hücre içi pH için yöntemleri

Burada, geç embriyonik Drosophila erkek gonadını canlı olarak görüntülemek için gerekli bir diseksiyon protokolü sunuyoruz. Bu protokol, normal koşullar altında veya transgenik veya farmakolojik manipülasyondan sonra dinamik hücresel süreçlerin gözlemlenmesine izin verecektir.

Geç Embriyonik Drosophila Gonad'ın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi

Burada, fizyolojik koşullar altında hücresel ve hücre altı dinamikleri gözlemlemek için Drosophila melanogaster üçüncü instar larvalarından canlı eksplant beyinlerini hazırlamak, parçalamak, monte etmek ve görüntülemek için bir iş akışını tartışıyoruz.

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Keşfedin Drosophila melanogaster yumurtalık nişindeki germline kök hücrelerinin asimetrik bölünmesinin canlı görüntülenmesi yöntemini. GFP füzyonu ile spektrozom dinamikleri ve hücre döngüsü gözlemlenir.

Kadın Drosophila melanogaster Germline Kök Hücre Nişlerinin Genişletilmiş Canlı Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet