Kadın Drosophila melanogaster Germline Kök Hücre Nişlerinin Genişletilmiş Canlı Görüntülenmesi

Burada, Drosophila yumurtalık nişindeki germ hattı kök hücrelerinin (GSC'ler) asimetrik bölünmesinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Spektrozom proteini Par-1'in yeşil floresan proteini (GFP) füzyonunu her yerde ifade eden bir transgenik çizgi kullanıyoruz.

Hücrelerin köklülüğünü kontrol eden yeni hücresel ve moleküler mekanizmaları keşfetmekle ilgileniyoruz. Temel amacımız, kök hücrelerin nişlerde farklılaşmayı nasıl önlediğini deşifre etmektir. Deneysel koşullar altında çalıştığımız için GSC'lerin fizyolojik bir davranış almasını sağlamak için doku bütünlüğünün korunması esastır.

Protokolümüz, GSC'lerin in vivo olarak bölünmesinin izlenmesini sağlayan sağlıklı ve işlevsel bir GSC nişini korur. Uzun ömürlü görüntülemenin kullanılması, GSC'lerin ve spektrozom dinamiklerinin tüm hücre döngüsünü incelememize olanak tanır. Spesifik olarak, hücre döngüsü boyunca spektrozom değişikliklerini başarılı bir şekilde karakterize ediyoruz, bu daha önce sabit görüntüler veya daha kısa görüntüleme periyotları ile elde edilmesi zor olan bir görevdi.

Dinamiklerini etkilemeden esas olarak deneylerin nasıl yapılacağını bilmek, niş hücrelerin nasıl iletişim kurduğunu keşfetmemizi sağlar. Kök hücrelerin biyolojisindeki metabolik enzimler olan mRNA'lar arasındaki doğrudan etkileşimin aracılık ettiği gen ekspresyonu ve hücresel metabolizmanın düzenleyici mekanizmalarını incelemek istiyoruz. Başlamak için, mililitre başına 10.000 birim konsantrasyonda streptomisin penisilin antibiyotik karışımının 100 mikrolitre alikotunu hazırlayın.

Prosedür için gerekli diğer tüm reaktifleri hazırlayın ve uygun şekilde saklayın. GFP'ye kaynaşmış par birini her yerde ifade eden ve yapısal olarak ifade edilen bir ila iki günlük sinekleri yeni bir tüpe toplayın. Diseksiyondan önce bir inkübatörde 25 santigrat derecede iki gün boyunca sinekleri kültürleyin.

35 milimetrelik poli-D-lizin kaplı bir plakanın kapak kaymasının ortasına üç mikrolitrelik özel Cell-Tak yapıştırıcı damlası yerleştirin. Hemen üç mikrolitrelik yapışkan damlaya pH'ı sekiz olan eşit hacimde 0.1 molar sodyum bikarbonat ekleyin. Çözeltiyi bir pipetle karıştırın.

Tam buharlaşma için, plakayı kapağı kapalı olarak oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Ardından plakayı gece boyunca dört santigrat derecede saklayın. Ertesi gün plakayı çözdürdükten sonra, yapışkan tabakaya dokunmadan ve rahatsız etmeden altı mikrolitre otoklav saf su ile dikkatlice üç kez yıkayın.

Suyun oda sıcaklığında beş ila 10 dakika tamamen buharlaşmasına izin verin. Başlamak için, sinekleri kültürleyin ve cam alt plakayı kaplama ile hazırlayın. Daha sonra üç kuyulu bir diseksiyon kabını, forsepsleri ve diseksiyon iğnelerini% 70 etanol ile temizleyin.

Diseksiyon çanağının üç oyuğunun her birine yaklaşık 200 mikrolitre zil çözeltisi ekleyin. Forseps kullanarak, Drosophila dişisini göğüs kafesi ve karnın kesiştiği noktada tutun. Kütikülü arka karın bölgesinden nazikçe yırtın ve yumurtalıkları ortaya çıkarmak için geri çekin.

Yumurtalıkları inceledikten sonra, doku kalıntıları veya diseksiyondan kaynaklanan kalıntıları azaltmak için bunları bir sonraki kuyuya aktarın. LED aydınlatmalı bir stereo mikroskop altında, tüm yumurtalığı sabitlemek için bir çift ince forseps ve geç aşama yumurta odasını tutmak için ikinci çift kullanın. Kas kılıfı kırılana ve geride kalana kadar hafifçe gerin.

Forseps kullanarak, 15 ila 20 kas kılıfı içermeyen yumurtalıkları birer birer 200 mikrolitre zil sesi içeren üçüncü kuyucuğa aktarın. Yumurtalıkların uç duvara yapışmasını önlemek için 200 mikrolitrelik bir ucu %0,1 Tween 20 ile önceden ıslatın. Önceden ıslatılmış ucu kullanarak kas kılıfı içermeyen yumurtalıkları içeren altı mikrolitre zil solüsyonunu oda sıcaklığında hazırlanan yapışkan plakaya aktarın.

Bir diseksiyon iğnesi veya forseps kullanarak, yapışkan yüzeyle teması sağlamak için yumurtalıkları zil damlasının altına dikkatlice bastırın. Daha sonra,% 15 FBS ve% 0.6 Streptomisin penisilin antibiyotik karışımı ile desteklenmiş üç mililitre Schneider ortamını MatTek plakasına ekleyin. Kas kılıfı içermeyen yumurtalıkları içeren plakayı düz bir yüzey üzerinde mikroskop istasyonuna taşıyın.

Plakayı, dönen bir disk mikroskobunun veya konfokal bir mikroskobun 63x objektifine yerleştirin. Numuneyi odaklayın ve her germanyum için orta Z düzlemini seçin. Deneysel parametreleri yapılandırmak için, yakalama türünü 3D zaman atlamalı olarak ayarlayın.

Lazer gücünü maksimumun %70'ine ayarlayın. Uyarma dalga boyunu 488 nanometreye ayarlayın. Z yığını aralığı 30 mikrometredir ve Z yığınları arasındaki mesafe 1,2 mikrometredir.

Zaman noktaları arasındaki aralığı her 10 dakikada bir ve süreyi 17 saat olarak ayarlayın. Varsa, örneklerin XY'sini yeniden tanımlamak için çoklu konum seçeneğini kullanın. Her germanyumun ortasındaki Z düzlemini seçin, böylece Z yığınları bu konumda ortalanacak ve alıma başlayacaktır.

Imaris veya Image J yazılımını kullanarak spektrozom morfolojisindeki değişiklikleri görselleştirmek için görüntüleri zamanında ve Z ekseni boyunca analiz edin. Filmleri oluşturmak için, her zaman noktasında en iyi Z düzlemini manuel olarak seçin. Yuvarlak G2 spektro bölgesinin güçlü GFP par one sinyali, G2 MG1 fazları sırasında önemli ölçüde azaltıldı.

Erken faz sırasında, GFP par one spektrozomu terk etti ve sitoplazmayı doldurdu, bu da germ hattı kök hücresinin mitoza girişini gösteriyor. Mitoz ve nükleer zarf reformasyonundan sonra, GFP par one sinyali, yuvarlak G1 Spektro döngüsünde kademeli olarak geri kazanıldı. GFP'nin yuvarlak G1 spektrozomuna eşit Denovo baskısı, tapa, çubuk ve kaynaştırma spektrozom morfolojilerinin oluşumuna yol açtı.