Nöral Kök Hücre Motilite değerlendirilmesi Agaroz Jel tabanlı mikroakışkan Cihaz Kullanımı

Merhaba, ben Kevin kazandı. Cornell Üniversitesi'ndeki Biyoakışkanlar Laboratuvarı'nda mühendislik yüksek lisans öğrencisiyim. Ve bugün, EGF epidermal büyüme faktörünün Maureen nöro kök hücreleri üzerindeki etkisini incelemek için agros bazlı bir mikroakışkan cihaz kullanmaktan bahsedeceğim.

Cihaz temel olarak her biri 150 mikron genişliğinde üç mikroakışkan kanaldan oluşur. EGF, yan kanallardan birine pompalanır ve tampon diğer yan kanala pompalanır. Temel olarak, merkez kanal boyunca statik doğrusal kimyasal gradyan kurar.

EGF difüzyonu agro jel boyunca kolayca yayıldığından, nöron kök hücreleri merkez kanala ekilir ve göçlerinin ilerlemesi bir mikroskop aracılığıyla izlenir. Bu nedenle, cihazlar temel olarak boruya bağlanmak için tüm giriş ve çıkışlara sahip pleksiglas üst tabakadan oluşur. Ve bunun altında, içinde dört desen cihazı bulunan bir agro jel membran var.

Bu, genel cihaz boyunca sabit kalınlığa sahip olduğumuzu garanti eden PDMS ara parçası ile çevrilidir. PDMS ve jel, vb ile kaplanmış bir cam slayt üzerinde birleştirilir. Bu, hücrelerin cam slayta yapışmasına yardımcı olur.

Ek olarak, tüm cihazı monte etmek için paslanmaz çelik plaka kullanılır ve cihazı vidalarla birlikte sandviçleriz. Yabani tip hücre hattı, yabani tip EGF reseptörünü aşırı eksprese etmek için bir retrovirüs vektörü ile transfekte edilmiştir ve delta hücre hattı, EGF reseptörünün mutasyona uğramış bir versiyonu ile transfekte edilmiştir, bu da EGF ligandı olmadan yapısal olarak aktif olmasını sağlar. Tamam, bu yüzden mikro akışkan cihazımızın montaj sürecini açıklayarak başlayacağım.

Bu yüzden ilk olarak PDMS ara parçasını ustalarımızdaki silikon mikro kanalların kabartma özelliklerinin etrafına yerleştirdim. Bu yüzden şimdi 0.3 gram agros tartacağım. Şimdi 10 milyon CO2 bağımsız medyayı gündeme getireceğim ve bunu agros'a ekleyeceğim.

Ve aros tozunu CO2'den bağımsız ortamla karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyeceğim. Şimdi mikrodalga için hazırız. Şimdi görebileceğiniz gibi, agros artık sıvılaştırıldı, ancak hala birkaç granül kaldı.

Granülü çözmek ve hava kabarcıklarından kurtulmak için bunu döndürmeye çalışacağım. Bu yüzden erimiş agroları silikon ustanın kabartma özelliklerine döküyorum ve şimdi steril bir cam sürgü alıp PDMS ara parçasının üzerine yerleştireceğim. Ve agro jeldeki hava kabarcıklarının çoğunu dışarı atmaya çalışmak için bir açıyla koydum.

Ve baskı uyguladım ve agros kabuğu katılaşana kadar baskı uygulamaya devam edeceğim. Yani bir ila iki dakika sonra katılaştı. Şimdi slayttan fazla agroları kaldıracağım.

Bir sonraki adım, cam sürgüyü yavaşça kaydırmaktır ve bu cam sürgü monte edilerek atılabilir. Şimdi desen arosunu daha önce fibronektin ile kapladığım bir cam slayta nazikçe aktarmaya çalışacağım. Temel olarak bu plastik steril tabakayı, PDMM MS ara parçası ile desen agrosunu kaldırmama yardımcı olması için kullanıyorum ve desen agroslarını kanallarla birlikte slayta doğru aktaracağım.

Artık bu cam kızağın üzerinde sıkıca olduğuna göre, plastik manifoldun kanallara erişebilmesi için tek tek rezervuarlara delikler açacağım. Bunu küçük bir metal delgeç kullanarak yapacağım. Şimdi cihazda delik açmayı bitirdik.

Mikro kanalların kurumasını önlemek için 500 mikrolitre CO2 bağımsız ortam ekleyeceğim ve şimdi bir ila iki dakika bekleteceğim. Tamam, bir ila iki dakika sonra, fazla ortamı boşaltmaya çalışacağım ve şimdi desen agrosuna giren delikleri pleksiglas manifoldun giriş ve çıkış delikleriyle hizalayacağım. Ve delikler hizalandıktan sonra, güzel bir conta oluşturmak için sıkıca bastırıyorum.

Şimdi pleksiglas manifoldu paslanmaz çelik bağlantıların üzerine yerleştiriyorum ve şimdi cihazı vidalar kullanarak nazikçe sandviçleyeceğim. Vidaları aşırı sıkmamaya çok dikkat ediyorum çünkü bu kanalları sıkıştıracak ve iç kısımda bir desen Agros jelinin yuvalanmasını önlemek için vidaları saat yönünde yerleştiriyorum. Bir mil medya çizeceğim ve bu şırıngayı cihazı test etmek için kullanacağım.

Ve gördüğünüz gibi, her bir mikrokanala sıvı enjekte ediyorum ve her çıkıştan çıkacak sıvıyı arıyorum. Şu anda monte edilmiş cihazı mikroskobun çevre odasına yerleştirdim. Bu, 37 santigrat derecede tutulur, bu nedenle bu, cihazı ısıtacak ve hücreleri tohumlamamız gerektiğinde hazır hale getirecektir.

Ve gördüğünüz gibi, ikisini de, şemsiye pompası borusunu kurulumdan geçirdim. Ve şu anda Deneylerimize hazırlanmak için boruyu PBS ile yıkıyorum. Şimdi boruyu kuracağız.

Şemsiye pompası hortumunu, içlerine delikler açılmış kapaklardan geçireceğim. Ve her borunun a, borunun hem girişini hem de çıkışını tanımlayabilmem için üzerinde belirli sayıda çentik vardır. Böylece üzerinde dört çentik bulunan boru, mil başına 10 nanogram alacaktır.

EGF çözümü şimdi boruyu cihaza bağlayacaktır. Bu yüzden her cihaza kaç çentik olduğuna göre takacağım. Yani ele aldığı çözüme karşılık geliyor.

Ve şimdi çıkış borusunu takıyorum. Ortamın gerçekten çıkış borusundan aktığından ve kanalda tıkanıklık olmadığından emin olmak için şeffaf bir tigon borusu kullanıyoruz. Ve şimdi şemsiye pompalarını başlatacağım.

Şimdi hücreleri merkez kanala tohumlama prosedürüne başlayacağım. Sensör kanalındaki fazla medyayı çıkararak başlayacağım. Şimdi hücreleri göreceğim.

Hücreler zaten CO2'den bağımsız ortamda süspansiyon halindedir. Ve ben satıyordum, orta kanalın girişinde 60 yaşındaydım ve çıkışta 20 mikrolitre oturuyordum. Ve umarım hücreler yerçekimi güdümlü akışla oturacaktır.

Ve bu işlemi diğer iki hassas kanal için de tekrarlayacağım ve şimdi hücre yerleşiminin başarılı olup olmadığını görmek için bunu mikroskop altında gözlemleyeceğiz. Böylece şimdi hücreler cam slayta yapıştılar ve birkaç dakika içinde yayılmaya başlayacaklar ve benzersiz morfolojilerine ulaşacaklar. Bu yüzden bugün gerçek cihazın montajını, reaktiflerin hazırlanmasını ve cihaz içindeki hücre göçünü görüntülemek için kullandığım mikroskop tekniklerini ele aldık.

Sonuç olarak, bu cihazın özellikle klinik ortamda çok daha geniş bir feragat etme hakkına sahip olacağını umuyoruz. Bu yüzden birini yatay olarak şekillendirin. C 17.2 hücrelerinin yörüngelerini ve dikey olarak artan EGF konsantrasyonlarını gösterir.

Aynı EGF konsantrasyonu ile deneylerimizde kullandığımız C 17.2 hücrelerinin çeşitli suşlarının yörüngelerini gösterir. Ebeveyn hücre verileri, mil EGF konsantrasyon gradyanında 10 nanogramda motilitede bir zirve olduğunu gösterir, bu da reseptörlerin daha yüksek bir EGF konsantrasyonunda ligand ile doymuş hale geldiğini gösterir. Ve vahşi tip veriler, mil konsantrasyonunda veya EGF'de yüz nanogramda motilitede bir artış olduğunu göstermektedir.

Bu, reseptörlerin daha yüksek EGF konsantrasyonlarında doymuş hale gelmediğini gösterir. Bu, EGF reseptörünü aşırı eksprese etmek için tasarlandıkları için mantıklıdır. Son olarak, delta hücre hattı verileri, hücrelerin motilitesinin kabaca EGF konsantrasyonundan bağımsız olduğunu gösterir.

Mutasyona uğramış EGF reseptörleri, EGF'nin varlığından bağımsız olarak aktive edilmek üzere tasarlandığından bu da beklenen bir durumdur.