Kalsiyum iyon kanallarının aktivasyonunu incelemek için tek hücreli kalsiyum görüntüleme

Sıcaklık hissi, yaş hissi ve ağrı hissi ile ilgili kanallarımızı inceledik. Kanallarımızdaki küçük moleküllerin aktivitelerini taramak ve mekanizmalarının incelenmesi ile ilgileniyoruz. İki TRPV1 aktive edici agonisti taradık ve etki mekanizmaları hakkında detaylı bir çalışma yürüttük.

Bu teknoloji, birden fazla hücredeki kalsiyum değişikliklerinin gerçek zamanlı, kantitatif ve aynı anda izlenmesini sağlayarak araştırma uygulamaları için basit ve hızlı bir yaklaşım haline getirir. Kalsiyumla ilgili iyon kanallarının modernizasyonu yoluyla çeşitli hastalıklar için geleneksel Çin tıbbı tedavi mekanizmasını keşfetmeyi amaçlıyoruz. Başlamak için, sekiz milimetre çapında steril cam slaytlar hazırlayın ve bunları 24 oyuklu bir plakaya yerleştirin.

Her kuyucuğa 500 mikrolitre Poli-D-lizin tamponu ekleyin. Kaplamaya izin vermek için slaytları 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Daha sonra bir pipet kullanarak, kaplama çözeltisini her bir oyuktan atın.

Slaytları Dulbecco'nun PBS'si ile bir kez yıkayın ve yıkanmış slaytları daha sonra kullanmak üzere bir kenara koyun. Hücreleri, oyuk başına 5 hücrenin gücüne yaklaşık 1.5 çarpı 10 yoğunlukta hazırlanan 24 oyuklu plakaya tohumlayın ve hücreler yapışana kadar plakayı inkübatöre yerleştirin. Daha sonra, Fura-2 / stok çözeltisini ve Pluronic F-127'yi 1.3 milimolar kalsiyum iyonu içeren Hank'in tamponu ile karıştırın.

Işıktan korumak için Fura-2/çalışma solüsyonunu alüminyum folyo kullanarak kaplayın. Hücrelerin ön işlemden geçirilmesi için, cam slaytları hücrelerle birlikte Hank'in tamponunu içeren yeni bir 24 oyuklu plakaya aktarın. Bir pipet kullanarak, tamponu her bir kuyucuktan atın ve her oyuğa 500 mikrolitre Fura-2 / çalışma tamponu ekleyin.

Prob yüklemesine izin vermek için plakayı karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra Fura-2 / çalışma tamponunu her bir kuyucuktan çıkarın ve fazla Fura-2 /'yi çıkarmak için hücreleri Hank'in tamponu ile üç kez yıkayın. Başlamak için, tek hücreli kalsiyum görüntüleme için ön işleme tabi tutulmuş hücreleri elde edin ve floresan mikroskobunun tüm bileşenlerini başlatın.

Mevcut seçeneklerden floresan görüntüleme yazılımını açın. Gerekli protokolü seçin ve Tamam'a tıklayın. Ardından, yeni bir deney kurulumu başlatmak için ana menüden Yeni Deney'i seçin.

Şimdi, perfüzyon odasını mikroskop sahnesine monte edin ve Fura-2 / ile muamele edilen hücre slaytlarını Hank'in tampon çözeltisini içeren odaya dikkatlice yerleştirin. Optimum görüntüleme için odağı beyaz ışık altında ayarlayın. Deney kontrol panelinde Odak'ı seçin.

380 nanometre gibi odaklama için istediğiniz dalga boyunu seçin ve odak ayarlamalarını başlatmak için Odaklamayı Başlat'a tıklayın. Hedefi yakınlaştırmak için Kaba Odak'ı ve ardından hassas ayarlamalar için Odak Bul'u kullanarak hücreler üzerindeki odağı ayarlayın. Hedef proteinin ekspresyonunu FITC veya TRITC dalga boyları ile gözlemleyin.

Ardından Odaklamayı Durdur'a tıklayın ve odak panelini kapatın. Görev çubuğunda Deneyi Yapılandır'a tıklayın ve yapılandırma ayarlarında görüntüleme için istediğiniz katları seçin. Şimdi görüntüleme alanlarını tanımlamak için menü çubuğundaki Bölge düğmesine tıklayın ve görüntüleme için İstenen Aydınlatma türünü seçin.

Görüntüleri Al'a tıklayın, ardından görüntüleri yakalamak için Tamam'a basın. 380 nanometrenin altındaki kontrollerle boş okumayı göz önünde bulundurarak, floresan altında hedef proteini ifade eden istenen hücreleri tanımlayın. Seçilen bir bölgeyi geri almak için daireye sağ tıklayın ve Bölgeyi Sil'i seçin.

Referanslar menüsünü açın, Referansları Çıkar kutusunu işaretleyin ve ardından arka plan çıkarma işlemini uygulamak için Tamam'ı tıklayın. Deneme verilerini kaydetmek için Deneme kontrol panelinde, Günlük Verileri'ne tıklayın. Kontrol panelinin Time Lapse (Hızlandırılmış Çalışma) bölümünde, Data Acquisition Interval (Veri Toplama Aralığı) değerini bir saniye olarak ayarlayın.

Ardından, veri toplamaya başlamak için Deney kontrol panelinde Sıfır Saat ve Al'a tıklayın. Şimdi hücrelere gereksinimlere göre tedaviler uygulayın. Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, işlemi durdurmak için Duraklat'a tıklayın.

Elde edilen verileri kaydedin ve analize devam edin. Denemeyi sonlandırmak için Dosya'ya tıklayın ve Denemeyi Kapat'ı seçin. Son olarak, yazılımı kapatın ve kaydedilen tüm verileri bilgisayardan aktarın.

Fura-2 probu ile yüklenen birincil keratinositler, 380 nanometre dalga boyunda görünür hücre morfolojisi gösterdi. Keratinositlerin termal tepkisi, ısıtma sırasında hücre içi kalsiyum iyonu konsantrasyonunda bir artış gösterdi ve soğutma sırasında da benzer bir tepki gözlendi. Termal tepki, genin termal kalsiyum sinyallemesindeki rolünü gösteren STIM1 geninden yoksun olan keratinositlerde ortadan kaldırıldı.

STIM1 / Orai1'i aşırı eksprese eden HEK293T hücreler, yeşil ve kırmızı floresan belirteçleri tarafından kanıtlandığı gibi başarılı gen ekspresyonunu doğrulayarak, soğuma üzerine kayda değer bir termal tepki gösterdi. STIM1-Orai1'i eksprese eden hücrelerde mağaza tarafından işletilen kalsiyum giriş tepkisi, hücre dışı kalsiyum konsantrasyonundaki sıralı değişiklikler ve bolluk yoluyla Siklopiazonik Asit baskısı ile etkili bir şekilde indüklendi. Bir TRPV1 agonisti olan kapsaisin'in doğrudan pipetlenmesi, TRPV1 plazmidini eksprese eden hücrelerde hücre dışı kalsiyum akışını tetikledi.