Hepatosellüler Karsinomda Sistemik ve Lokal İmmün Yanıtların Kütle Sitometrisi Analizi
25 Nisan 2025
Bu protokol, hepatoselüler karsinomda (HCC) hem sistemik hem de lokal immün yanıtları değerlendirmek için kapsamlı bir kütle sitometrisi (uçuş süresine göre sitometri [CyTOF]) analiz yöntemini ana hatlarıyla belirtir. Yaklaşım, tümör mikro çevresi ve ilişkili bağışıklık mekanizmaları hakkında daha derin bir anlayış sunarak HCC'nin bağışıklık manzarası hakkında bilgi sağlamayı amaçlamaktadır.
Kitle sitometrisi, hepatosellüler karsinomda hem sistematik hem de lokal immün yanıtları analiz etmemizi sağlar. Bağışıklık hücrelerini tek hücre düzeyinde profilleyerek, benzersiz alt kümeleri ve tümör ilerlemesiyle bağlantılı fonksiyonel durumları tanımlayarak, bağışıklık kaçırma mekanizmaları ve kişiselleştirilmiş tedaviler için potansiyel terapötik hedefler hakkında içgörüler sunuyoruz. Protokolümüz, geleneksel akış sitometrisinde görülen spektral örtüşmeyi önleyerek, tek hücre düzeyinde aynı anda 14'ten fazla belirteci analiz etmek için kütle sitometrisi kullanır. Bu, gerçek hücre popülasyonlarının hassas bir şekilde tanımlanmasını içerir ve ayrıntılı bağışıklık profili oluşturma ve biyobelirteç keşfi için yüksek boyutlu veriler sağlar.
[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, donmuş periferik kan mononükleer hücresini ve hepatokarsinom hücre süspansiyonlarını çözün. Hücre geri kazanımından sonra, hücreleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Sisplatini 0.5 mikromolar nihai konsantrasyona ekleyin, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak için, tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın, ardından her tüpe bir mililitre hücre boyama tamponu ekleyin. Tekrar santrifüjledikten sonra, süpernatanı dikkatlice atın. FC reseptör blokajını gerçekleştirmek için, önce her numune için 50 mikrolitrelik bir blok karışımı hazırlayın, 48 mikrolitre hücre boyama tamponunu iki mikrolitre FC bloke etme solüsyonu ile birleştirin. Hücre peletini blok karışımında yeniden süspanse edin ve inkübe edin. Daha sonra, membran protein antikor karışımını hazırlamak için numune başına her antikorun 1.1 mikrolitresini etiketli bir tüpe ekleyin. Hücre boyama tamponu ile hacmi 55 mikrolitreye kadar çıkarın. Hazırlanan antikor karışımının 50 mikrolitresini her bir numune tüpüne aktarın ve toplam hacmi 100 mikrolitreye getirin. Ardından, oda sıcaklığında 15 dakika inkübe etmeden önce karıştırmak için numuneleri hafifçe döndürün. Her numune tüpüne bir mililitre hücre boyama tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 G'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Son yıkamadan sonra, hücreleri iyice yeniden süspanse etmek için kalan sıvıyı hücre peleti ile kısaca girdaplayın. Çekirdek protein boyaması için, yeniden süspanse edilmiş hücrelere 500 mikrolitre karışık fiksasyon çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmeden önce numuneleri nazikçe karıştırın. İnkübasyondan sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 G'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Daha sonra, hücreleri yıkamak için her tüpe 1000 mikrolitre geçirgenlik tamponu pipetleyin. Daha sonra tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1000 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra her tüpe 50 mikrolitre antikor karışımı ekleyin. İnkübe etmeden önce iyice karıştırmak için hücreleri nazikçe pipetleyin. Daha sonra, her tüpe 1000 mikrolitre geçirgenlik tamponu pipetleyin, tekrar santrifüjleyin, ardından süpernatanı atın. Hücreleri sabitlemek için, her numune tüpüne PBS'de hazırlanan bir mililitre %1.6 formaldehit ekleyin ve içeriği iyice karıştırmak için girdap yapın. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ettikten sonra numuneleri santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Nükleer interkalasyon boyama için, önce Cell-ID Intercalator Iridium'u sabitleme ve geçirgenlik tamponu ile seyreltin. Her numuneye bir mililitre interkalasyon solüsyonu pipetleyin. Yavaşça karıştırın ve girdaplayın. Numuneleri gece boyunca dört santigrat dereceye yerleştirin, ardından daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. Kuluçka tamamlandığında, tüpe 1000 mikrolitre hücre boyama tamponu pipetleyin. Tüpleri 800 G'de beş dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Son olarak, hücreleri 450 ila 900 mikrolitre deiyonize su içinde yeniden süspanse edin. Daha fazla analizden önce hücre sayımı için hücreleri tripan mavisi ile boyayın. Başlamak için kütle sitometresini açın ve programı başlatın. CyTOF sistemindeki örnekleri analiz edin ve periferik kan mononükleer hücrelerinin ve hepatokarsinom hücre örneklerinin kütle sitometrik verilerini elde edin. Cihazda veri işleme yazılımını başlatın ve FCS dosyasındaki CD45+ hücre popülasyonunu önceden işleyin. Ardından, sisplatin dışlaması gibi canlılık boyamasını kullanarak ölü hücreleri ortadan kaldırın. Bağışıklık hücrelerine odaklanmak için CD45 + popülasyonunu kapatın ve daha fazla analiz için kapılı popülasyonu dışa aktarın. Beş katsayısıyla verileri dönüştürün. Ardından, kümeleme yazılımını başlatın ve benzer işaretleyici ifade profillerine sahip hücreleri kümeler halinde gruplandırarak SPADE algoritmasına dayalı ana kümeleri tanımlayın. Boyutsallığın azaltılması ve farklı kümelerin tanımlanması için hiyerarşik stokastik komşu gömme veya HSNE uygulayın. Ardından, ana kümelerin yeniden kümelenmesini gerçekleştirmek için yazılımımızdaki CyTOF kit paketini kullanın. Varsayılan parametrelere sahip alt kümeleri tanımlamak için PhenoGraph programını kullanın. Periferik kan mononükleer hücre örneklerinde toplam 14 farklı hücre tipi tanımlanmıştır. 14 hücre tipinin her biri için işaretleyici ifade modelleri, farklı hücre popülasyonları için benzersiz ifade profillerini gösteren ısı haritasında detaylandırıldı. Bu hücre tiplerinin dağılımı, daha yüksek oranda CD4 T hücresine sahip numune D, B hücrelerinin önemli ölçüde zenginleşmesini gösteren numune A ve B ve CD141 + ve ağırlıklı olarak numune C'de bulunan geleneksel dendritik hücreler arasında değişmiştir. B hücreleri, plazmositoid dendritik hücreler, eozinofiller ve miyeloid dendritik hücreler. Doku hücresi tipleri için işaretleyici ekspresyon profilleri, her hücre popülasyonu için farklı modeller gösterir. Doku örnekleri, hepatoselüler karsinom ile ortak immünolojik özellikleri yansıtan tüm hastalarda tutarlı bir hücre tipi oranı gösterdi.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, hepatoselüler karsinomda (HKK) sistemik ve lokal bağışıklık tepkilerini değerlendirmek için bir kitle sitometresi (CyTOF) analiz yöntemini belirtir. Tek hücre düzeyinde bağışıklık hücrelerini profilleyerek, yaklaşım, bağışıklık manzarasını ve tümör progresyonu ile ilişkili mekanizmaların anlaşılmasını ilerletir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Hepatoselüler karsinomda bağışıklık tepkisi
- Tek hücreli bağışıklık profili oluşturma
- Kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri
Arka Plan
- Tümörlerde bağışıklık kaçışını anlamak
- Bağışıklık manzarası analizinin önemi
- Kanser araştırmalarında kitle sitometresinin uygulaması
Kullanılan Yöntemler
- Bağışıklık hücrelerini analiz etmek için kitle sitometresi
- Hepatoselüler karsinom örnekleri
- Aynı anda birden fazla markörü tanımlama
Ana Sonuçlar
- PBMC örneklerinde 14 farklı hücre tipinin keşfi
- Çeşitli bağışıklık hücreleri için benzersiz ifade profillerinin tanımlanması
- HKK hastalarında bağışıklık tepkilerinin karakterizasyonu
Sonuçlar
- Bu çalışma, HKK'de derinlemesine bağışıklık profilleme için kitle sitometresinin yararını gösterir.
- Bulgular, tümör-bağışıklık etkileşimlerinin anlaşılmasına yardımcı olur ve tedavi yaklaşımlarını bilgilendirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Mass cytometry enables high-dimensional, single-cell immune profiling in hepatocellular carcinoma (HCC), addressing the challenge of characterizing complex tumor-immune interactions. This approach enhances predictive confidence in identifying immune cell subsets and functional states relevant to disease progression and therapeutic targeting. Integrating systemic and local immune landscape data supports risk-adjusted portfolio decisions in immuno-oncology R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables detailed interrogation of immune cell heterogeneity and functional states in HCC.
- Supports identification of immune evasion mechanisms and potential therapeutic targets.
- Facilitates biological de-risking by clarifying immune pathway involvement in tumor progression.
- Improves predictive confidence for target selection and validation in immunotherapy pipelines.
Screening & Assay Development
- Provides validated, quantitative immune cell marker panels for downstream screening workflows.
- Enables reproducible, high-throughput analysis of immune cell populations across patient samples.
- Supports assay standardization and scalability for immune profiling in translational studies.
- Delivers robust data for evaluating compound effects on specific immune subsets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns immune profiling outputs with disease-relevant biomarkers for translational continuity.
- Enables comparison of systemic and tumor-local immune responses to inform preclinical models.
- Supports risk-adjusted advancement of immunotherapeutic candidates based on mechanistic insights.
- Facilitates identification of shared immunological features across patient cohorts for biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
This mass cytometry workflow bridges early discovery, target validation, and translational research by providing high-resolution immune landscape data in HCC.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on immune cell involvement and pathway activity in tumor progression.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible immune cell marker data for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides high-dimensional readouts and clustering outputs for robust comparison of immune profiles across samples.
- Translational Research: Aligns immune cell signatures with disease state and biomarker strategies for preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for immune profiling across oncology indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune-oncology research.
- Operational Value: Standardizes immune profiling workflows and enhances reproducibility across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in immunotherapy development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and candidates based on immune landscape data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mass cytometry operation and high-dimensional data analysis.
- Demands access to CyTOF instrumentation and advanced computational tools for clustering and visualization.
- Necessitates standardized protocols for sample preparation and marker panel validation.
- May require adaptation for different tumor types or immune contexts based on marker selection.
- Dependent on robust cross-team collaboration for data interpretation and integration.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:07
Preparation and Staining of Peripheral Blood Mononuclear Cells and the Hepatocarcinoma Cells for Flow Cytometry Analysis
5:22
Mass Cytometric Analysis of Stained Peripheral Blood Mononuclear Cells and the Hepatocarcinoma Cells
7:00
Results
