iChip Teknolojisi Kullanılarak Toprak Mikroorganizmalarının İzolasyonu

Tarımsal patojenlerle mücadele etmek için yeni kimya türleri keşfetmeye çalışıyoruz. İChip teknolojisini kullanarak, yeni kimyaya yol açacağını umduğumuz yeni organizmaları izole ettik. Bu organizmaların ve/veya doğal ürünlerinin tarımsal patojenlere karşı test edilmesi, potansiyel olarak yeni biyopestisit adayı organizmaların ve/veya bileşiklerin bulunmasına yol açmaktadır.

iChip yöntemi, geleneksel koşullar altında kültürlenemeyen mikroorganizmaları, evcilleştirme ve doğal ortamlarıyla temas süresi sağlayarak izole etmemizi sağlar. Modifiye edilmiş iChip yapımız basit, ucuzdur ve mikrobiyal kontaminasyon riskini azaltır, bu da onu çeşitli araştırma hedefleri için kolayca erişilebilir hale getirir. İChip sonuçlarımız, yeni mikroplar tarafından patojenlerin baskılanmasını hangi mekanizmaların yönlendirdiği gibi soruları ortaya çıkarıyor?

Bu biyoaktif bileşikler gerçek dünya denemelerinde güvenilir bir şekilde performans gösterebilir mi? Çevresel faktörler etkinliklerini nasıl etkiler? Bu soruların ele alınması, sürdürülebilir biyopestisit gelişimine, bitki hastalık yönetiminin dönüştürülmesine ve sentetik mantar ilaçlarına olan bağımlılığın azaltılmasına rehberlik edecektir.

Laboratuvar, yeni bakterileri örtü kırpma yoluyla üretilen hastalık baskılayıcı topraklardan izole etmek, yeni mikropları ve biyoaktif bileşikleri tanımlamak için iChip teknolojisini uygulayacak. Bunlar, tarımsal hastalıkları yönetmek için sentetik mantar ilaçlarına yenilikçi, sürdürülebilir alternatifler geliştirmek için kontrollü bitki hastalığı çalışmalarında test edilecektir. 5 milimetrelik bir agar zımba aleti kullanarak modifiye edilmiş bir iChip oluşturmak için, kuyuların tabanlarını 96 oyuklu bir plakadan çıkarın.

0,05 mikrometre polikarbonat membranları dikdörtgenler halinde kesin ve boyutların 96 oyuklu bir plakanın alt alanıyla eşleştiğinden emin olun. Polikarbonat membranı 96 oyuklu plakanın dibine yapıştırmak için bir silikon dolgu macunu uygulayın. Yapıştırıcının kuyuları kapattığından, ancak kuyuların açıklıklarını tamamen kapatmadığından emin olun.

Plakaların 24 saat kurumasını bekleyin. A'dan D'ye etiketlenmiş 15 mililitrelik santrifüj tüplerinin her birine ve E'den H'ye etiketlenmiş 50 mililitrelik tüplerin her birine 4,5 mililitre steril su ekleyin. Daha sonra tüpe 10 mililitre su ekleyin ve karışımı 10 dakika boyunca girdaplayın.

Toprak süspansiyonunun 10 dakika oturmasına izin verin. Daha sonra, 0,5 mililitre toprak süpernatanı A tüpüne pipetleyin ve iyice karıştırın. Şimdi, 0,5 mililitre hücre süspansiyonunu tüp A'dan tüp B'ye aktarın ve iyice karıştırın.

Kalan tüm santrifüj tüpleri için tekrarlayın ve sekiz tüp boyunca bir dizi on kat seyreltme işlemini tamamlayın. Başlamak için, iChips'i tamamen% 95 etanole batırın. 15 dakika sonra, plakaları etanolden çıkarın ve laminer akış başlığındaki steril bir kağıt havlu üzerine yerleştirin.

Laminer akış başlığındaki ultraviyole sterilizatörü 15 dakika boyunca açarken etanolün buharlaşmasına izin verin. Kontrol görevi görmesi için 360 mikrolitre steril süksinat minimal tuzları veya SMS ortamını plakanın ilk sütununa pipetleyin. Tüp E'deki hücre süspansiyonuna 45 mililitre SMS ekleyin. Hücre süspansiyonunu agar ile birleştirmek için iyice karıştırın.

360 mikrolitre agar hücresi karışımını 96 oyuklu plakanın kalan tüm kuyucuklarına pipetleyin. Ortam ayarlandıktan sonra, plakanın üst kısmını bir PCR plakası kapağıyla kapatın. Konsantrasyonlarda on kat farkla toplam dört plaka hazırlamak için plakaları F, G ve H tüplerini kullanarak doldurun.

Plakaları, zar tarafı aşağı bakacak şekilde yaklaşık 1 inç toprak içeren bir kaba yerleştirin. Kapalı kabın içindeki plakaları karanlıkta 25 santigrat derecede inkübe edin. Altı hafta sonra, iChips'i mikrobiyal büyüme açısından inceleyin.

Tüm kir parçacıklarını gidermek için modifiye edilmiş iChip'i steril suyla üç kez durulayın. Plakanın üstünü ve yanlarını% 95 etanol ile silin, yarı geçirgen zarın bulunduğu taraftan kaçının. Steril bir bıçak kullanarak, bir koloni içeren bir kuyunun etrafındaki plaka kapağını kesin ve kareyi steril cımbızla çıkarın.

Steril bir çizgi aleti kullanarak, koloniyi delin ve dört kadran yöntemiyle SMS agar plakasına çizgi sürün. Plakaları bir hafta boyunca veya koloni büyümesi gözlenene kadar 25 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçka işleminden sonra, kültürlerin izolasyonunu doğrulamak için kolonileri inceleyin.