Farelerde Retinal Vasküler Perisitlerin İmmün Boyama ile 3D Görüntülenmesi

Bu araştırmanın kapsamı, ileri görüntüleme teknikleri kullanarak retina vaskülatüründeki parazitlerin morfolojisini ve mekansal dağılımını incelemektir. Parazitlerin morfolojik özelliklerini göstermek için ayrıntılı bir görünüm sağlamak için, çalışma, alanımızdaki araştırmaları ilerletmek için floresan ajanın retroorbital enjeksiyonu, immünofloresan boyama ve doku temizleme tedavisini birleştiren yeni bir yaklaşımı tanımladı.

Fare retina dokusunun ön temizleme durumu ile karşılaştırıldığında, floresan domates laktin ve PDGFR-beta ile etiketlenmiş kan damarlarının ve parazitlerin arka plan sinyalleri, doku temizliğinden sonra önemli ölçüde azalır, mekansal ilişkilerinin daha kesin bir şekilde gözlemlenmesini kolaylaştırır.

Sonuçlarımız, bu tekniklerin tüm retina mount retinasındaki retina vaskülatüründeki parazitleri göstermek için oldukça uyumlu olduğunu göstermektedir. Bu histolojik tekniklerin kombinasyonu, parazitlerin morfolojik özelliklerini üç boyutlu bir görünümden ayrıntılı olarak görselleştirmek için etkili bir yaklaşımdır.

[Öğretim Görevlisi] Başlamak için, anestezi uygulanmış fareyi başı sola bakacak şekilde sağ lateral yaslanacak şekilde yerleştirin. Farenin sol gözünü ortaya çıkarmak için periorbital alana iki parmağınızı hafifçe bastırın. 27 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, orbital venöz sinüsün içine yaklaşık iki ila üç milimetre hafifçe delin ve iğnenin eğiminin 45 derecelik bir açıyla öne baktığından emin olun. Orbital venöz sinüse 0.1 mililitre floresan domates laktini enjekte edin. Beş dakikalık retroorbital enjeksiyondan sonra, fareyi ötenazi yapın ve göğüs boşluğunu açmak için cerrahi makas kullanın. Sol ventrikül tepesinden sol kardiyak ventriküle iki milimetre 24 gauge bir iğne sokun. 20 mililitre% 0.9 fizyolojik salin, ardından 20 mililitre% 4 fizyolojik salin ile dakikada üç mililitre hızında perfüzyon yapın. 0.1 molar fosfat tamponuna 0.1 mililitre% 0.9 formaldehit enjekte edin. Daha sonra, kurban edilen fareyi yan yatırın ve gözleri kaplayan cildi makasla çıkarın. Gözleri makas ve forseps ile enüklee edin. Optik siniri ve çevresindeki dokuları kesin ve gözü kaldırın. Gözü, iki saat boyunca 0.1 molar fosfat tamponunda% 4 formaldehit içinde sabitlemek için 12 oyuklu bir plakaya aktarın. Fiksasyondan sonra, gözü, çözeltinin dibine batana kadar dört santigrat derecede 0.1 molar fosfat tamponunda %25 sükroz içinde kriyoproteksiyon yapın. Plastik bir papaz pipeti kullanarak, gözü 0.1 molar fosfat tamponu içeren bir Petri kabına aktarın. Korneanın kenarını keskin bir makasla delin, kornea ve irisin etrafını kesin ve atın. Forseps kullanarak lensi ve vitreus mizahını çıkarın. Ardından, fincan şeklindeki retinayı gözün merkezinden uzaklaştırmak için ince forseps kullanın. Retinayı temiz bir Petri kabında 0.1 molar fosfat tamponu ile durulayın. Fincan şeklindeki fare retinasını izole ettikten sonra, gece boyunca dört santigrat derecede 0.1 molar fosfat tamponunda% 2 Triton X-100 çözeltisi ile 20 saatlik bir inkübatörde inkübe edin. Ertesi gün, retinayı bloke edici solüsyona aktarın ve gece boyunca dört santigrat derecede çalkalayıcı üzerinde 72 RPM'de döndürün. Daha sonra retinayı, seyreltme tamponunda keçi anti-PDGFR beta'nın birincil antikorlarını içeren bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Çalkalayıcı üzerindeki tüpü iki gün boyunca dört santigrat derecede döndürün. İki gün sonra, retinayı oda sıcaklığında yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Retinayı yıkama tamponuna yerleştirin ve gece boyunca dört santigrat derecede çalkalayıcıya aktarın. Ertesi gün, retinayı, eşek anti-keçi 488'in mililitre başına bir miligram ikincil antikoru ve mililitre floresan nükleer leke DAPI'si başına 0.2 nanogram çözeltisi içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Çalkalayıcı üzerindeki tüpü dört santigrat derecede beş saat boyunca 72 RPM'de döndürün. Retinayı, oda sıcaklığında iki kez bir saat boyunca yıkama tamponu ile altı oyuklu bir plakada yıkayın. Retinayı, gece boyunca dört santigrat derecede çalkalayıcı üzerindeki yıkama tamponunda inkübe edin. Ertesi gün, retinayı doku temizleme reaktifine aktarın ve 37 santigrat derecede bir saat boyunca 60 RPM'de çalkalayıcı üzerinde hafifçe döndürün. Doku temizlendikten sonra, retinayı temiz bir Petri kabında 0.1 molar fosfat tamponu ile durulayın. Yaylı makas kullanarak, bir taç yaprağı şekli oluşturmak için retina yarıçapının yaklaşık 2 / 3'üne ulaşan dört radyal kesi yapın. Retinayı düzleştirin ve retinanın içi yukarı bakacak şekilde bir mikroskop lamına monte edin. Fazla fosfat tamponunu çıkarmak için küçük bir parça emici kağıt kullanın. Monte edilmiş retinayı bir ara parça ile daire içine alın. Boşluğu taze doku temizleme reaktifi ile doldurun ve üstüne bir kapak fişi yerleştirin. Panoramik doku dilimi tarayıcısını kullanarak etiketli retinanın montaj görünümlerini tarayın. Sırasıyla 0,40 ve 0,95 sayısal diyafram açıklığına sahip 2X ve 10X lens ile donatılmış bir görüntüleme sistemi kullanarak daha yüksek büyütmeli görüntüler çekin. Etiketli retinadan iki mikrometre karede 50Z yığın görüntüleri yakalayın. Projeksiyon ve topografi modunu kullanarak tüm görüntüleri tek bir odak içi görüntüye entegre etmek için Başlangıç Odak Düzlemini Ayarla, Bitiş Odak Düzlemini Ayarla, Adım Boyutunu Ayarla'yı sırayla tıklayın, Derinlik Deseni, Görüntü Yakalama ve Z Serisi'ni seçin. Ardından, 499 ve 519 nanometrede yeşil floresan, 591 ve 618 nanometrede kırmızı floresan ve 401 ve 421 nanometrede mavi floresan kullanarak görüntü yakalayın. Sırayla Yeni Yüzeyler Ekle'yi seçin, Ses Ayarları'nı seçin, Kaynak Kanalı'nı seçin, ekranı ayarlayın, yüzey açısını ayarlayın ve Z-Stack konfokal görüntüleri analiz yazılımına aktarmak için anlık görüntüyü ayarlayın ve görüntüleri üç boyutlu desende yeniden oluşturun. Doku temizleme tedavisinden sonra tüm mount retinanın doku şeffaflığı, doku temizleme yapılmayan retinaya göre artmıştır. Domates lektini ile işaretlenmiş retinal vaskülatür ve PDGFR-β ile işaretlenmiş retinal parazitler, doku temizliğinden önce ve sonra görülebildi, ancak doku temizliğini takiben arka plan gürültüsü azaldı. Vasküler ağaç boyunca retina parazitleri gözlendi ve retinanın merkezi bölgelerinden periferik bölgelerine kademeli bir dağılım gösterdi. Temizlenmiş retinadan alınan üç boyutlu Z-Stack görüntüleri, kılcal damarlarda daha güçlü PDGFR-β lekelenmesi ile değişen çaplarda retina damarlarının etrafına sıkıca sarılmış parazitleri gösterdi.