Name: Isı Stresi Altında Polizom Profilleri Kullanılarak Translasyon Verimliliği Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Öğrenin, Arabidopsis thaliana'da ısı stresi altında translasyon verimliliğini polizom profilleme yöntemiyle nasıl analiz edeceğinizi. Bu protokol, translatomik araştırmalar için standartlaştırılmış teknikler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Isı Stresli Arabidopsis'te Translasyonel Düzenlemenin Analizi

<ol><li>Picard, F., Loubière, P., Girbal, L., Cocaign-Bousquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+translation+regulation+in+the+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">The significance of translation regulation in the stress response.</a> BMC genomics. 14, 1-11 (2013).</li>
<li>Yuan, S., Zhou, G., Xu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+machinery%3A+the+basis+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet+Genom%22%5BJournal%5D)">Translation machinery: the basis of translational control.</a> J Genet Genom. 51 (4), 367-378 (2024).</li>
<li>Dever, T. E., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elongation%2C+termination%2C+and+recycling+phases+of+translation+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The elongation, termination, and recycling phases of translation in eukaryotes.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (7), a013706(2012).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Dennis, M. D., Browning, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phosphorylation+of+plant+translation+initiation+factors+by+Arabidopsis+thaliana+CK2+holoenzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential phosphorylation of plant translation initiation factors by Arabidopsis thaliana CK2 holoenzymes.</a> J Biol Chem. 284 (31), 20602-20614 (2009).</li>
<li>Dennis, M. D., Person, M. D., Browning, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+plant+translation+initiation+factors+by+CK2+enhances+the+in+vitro+interaction+of+multifactor+complex+components%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of plant translation initiation factors by CK2 enhances the in vitro interaction of multifactor complex components.</a> J Biol Chem. 284 (31), 20615-20628 (2009).</li>
<li>Chen, G. H., Liu, M. J., Xiong, Y., Sheen, J., Wu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TOR+and+RPS6+transmit+light+signals+to+enhance+protein+translation+in+deetiolating+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">TOR and RPS6 transmit light signals to enhance protein translation in deetiolating Arabidopsis seedlings.</a> Proc Natl Acad Sci. 115 (50), 12823-12828 (2018).</li>
<li>Chang, H. H., Huang, L. C., Browning, K. S., Huq, E., Cheng, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phosphorylation+of+carboxyl-terminal+eIF2%CE%B1+by+SPA+kinases+contributes+to+enhanced+translation+efficiency+during+photomorphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">The phosphorylation of carboxyl-terminal eIF2α by SPA kinases contributes to enhanced translation efficiency during photomorphogenesis.</a> Nat Comm. 15 (1), 3467(2024).</li>
<li>Liu, M. J., Wu, S. H., Chen, H. M., Wu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+translational+control+contributes+to+the+regulation+of+Arabidopsis+photomorphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Sys+Biol%22%5BJournal%5D)">Widespread translational control contributes to the regulation of Arabidopsis photomorphogenesis.</a> Mol Sys Biol. 8 (1), 566(2012).</li>
<li>Des Marais, D. L., Juenger, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropy%2C+plasticity%2C+and+the+evolution+of+plant+abiotic+stress+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+New+York+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Pleiotropy, plasticity, and the evolution of plant abiotic stress tolerance.</a> Ann New York Acad Sci. 1206 (1), 56-79 (2010).</li>
<li>Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+signalling+in+plant+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species signalling in plant stress responses.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (10), 663-679 (2022).</li>
<li>Shulaev, V., Cortes, D., Miller, G., Mittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+for+plant+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Physio+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Metabolomics for plant stress response.</a> Physio Plantarum. 132 (2), 199-208 (2008).</li>
<li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+heat+stress+and+drought+stress+in+pearl+millet+based+on+Pacbio+full-length+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of heat stress and drought stress in pearl millet based on Pacbio full-length transcriptome sequencing.</a> BMC Plant Biology. 20, 1-15 (2020).</li>
<li>Wasternack, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+jasmonates+in+plant+stress+responses+and+development-applied+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Action of jasmonates in plant stress responses and development-applied aspects.</a> Biotechnol Adv. 32, 31-39 (2014).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+translational+induction+during+NLR-mediated+immunity+in+plants+is+dynamically+regulated+by+CDC123%2C+an+ATP-sensitive+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Global translational induction during NLR-mediated immunity in plants is dynamically regulated by CDC123, an ATP-sensitive protein.</a> Cell Host Microbe. 31 (3), 334-342 (2023).</li>
<li>Cho, H. Y., Chou, M. Y., Ho, H. Y., Chen, W. C., Shih, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+modulates+translation+dynamics+in+Arabidopsis+under+submergence+via+GCN2+and+EIN2%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Ethylene modulates translation dynamics in Arabidopsis under submergence via GCN2 and EIN2.</a> Sci Adv. 8 (22), eabm7863(2022).</li>
<li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+TaHSFA6e+modulates+heat+shock+protein-mediated+translational+regulation+in+response+to+heat+stress+in+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of TaHSFA6e modulates heat shock protein-mediated translational regulation in response to heat stress in wheat.</a> New Phytol. 239 (6), 2235-2247 (2023).</li>
<li>Maruri-López, I., Figueroa, N. E., Hernández-Sánchez, I. E., Chodasiewicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+stress+granules%3A+trends+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Plant stress granules: trends and beyond.</a> Front Plant Sci. 12, 722643(2021).</li>
<li>Hamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granule+formation+is+induced+by+a+threshold+temperature+rather+than+a+temperature+difference+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Stress granule formation is induced by a threshold temperature rather than a temperature difference in Arabidopsis.</a> J Cell Sci. 131 (16), jcs216051(2018).</li>
<li>Jang, G. J., Jang, J. C., Wu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+functions+of+stress+granules+and+processing+bodies+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Dynamics and functions of stress granules and processing bodies in plants.</a> Plants. 9 (9), 1122(2020).</li>
<li>Ostberg, S., Schewe, J., Childers, K., Frieler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+crop+yields+and+their+variability+at+different+levels+of+global+warming%5BTitle%5D)+AND+%22Earth+Sys+Dyn%22%5BJournal%5D)">Changes in crop yields and their variability at different levels of global warming.</a> Earth Sys Dyn. 9 (2), 479-496 (2018).</li>
<li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+TaHSFA6e+modulates+heat+shock+protein-mediated+translational+regulation+in+response+to+heat+stress+in+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of TaHSFA6e modulates heat shock protein-mediated translational regulation in response to heat stress in wheat.</a> New Phytol. 239 (6), 2235-2247 (2023).</li>
<li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> J Vis Exp. (87), e51164(2014).</li>
<li>Hsieh, E. J., Cheng, M. C., Lin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+an+abiotic+stress-inducible+transcription+factor+AtERF53+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of an abiotic stress-inducible transcription factor AtERF53 in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Mol Biol. 82, 223-237 (2013).</li>
<li>Cheng, M. C., Liao, P. M., Kuo, W. W., Lin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+ETHYLENE+RESPONSE+FACTOR1+regulates+abiotic+stress-responsive+gene+expression+by+binding+to+different+cis-acting+elements+in+response+to+different+stress+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis ETHYLENE RESPONSE FACTOR1 regulates abiotic stress-responsive gene expression by binding to different cis-acting elements in response to different stress signals.</a> Plant Physiol. 162 (3), 1566-1582 (2013).</li>
<li>Van den Broeck, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+network+to+phenotype%3A+the+dynamic+wiring+of+an+Arabidopsis+transcriptional+network+induced+by+osmotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Sys+Biol%22%5BJournal%5D)">From network to phenotype: the dynamic wiring of an Arabidopsis transcriptional network induced by osmotic stress.</a> Mol Sys Biol. 13 (12), 961(2017).</li>
<li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((detection+and+identification+of+newly+synthesized+proteomes+with+bioorthogonal+non-canonical+amino-acid+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">detection and identification of newly synthesized proteomes with bioorthogonal non-canonical amino-acid tagging.</a> Nat Protoc. 2 (3), 532-540 (2007).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+de+novo+protein+synthesis+in+starvation-induced+autophagy+using+bioorthogonal+noncanonical+amino+acid+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Acad+Press%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of de novo protein synthesis in starvation-induced autophagy using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging.</a> Acad Press. 588, 41-59 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL eppendorf tüpü</td><td>Labcon</td><td>3012-870-000-9</td><td>RNA ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>13.2 mL santrifüj tüpü</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td>ultrasantrifüjleme</td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Honeywell</td><td>32712</td><td>Polizom profili</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Honeywell</td><td>32211</td><td>RNA ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>Sikloheksimid (CHX)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-C7698</td><td>Polizom profili</td></tr><tr><td>Dietil pirokarbonat (DEPC)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>RNA ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32221</td><td>RNA ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>GeneChip Ökaryotik Poli-A RNA Kontrol Kiti</td><td>İnvitrojen</td><td>900433</td><td>Normalizasyon</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Honeywell</td><td>15523</td><td>Normalizasyon</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-H3149</td><td>Polizom profili</td></tr><tr><td>HiScript III RT SuperMix qPCR kiti için</td><td>Vazyme</td><td>R323-01</td><td>Normalizasyon</td></tr><tr><td>KCl</td><td>JTbaker</td><td>&nbsp; 3040-01</td><td>Polizom profili</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-M8266</td><td>Polizom profili</td></tr><tr><td>MS bazal ortam</td><td>Fito</td><td>M524</td><td>Bitki kültürü</td></tr><tr><td>Tepe Tablosu Şırınga Pompası</td><td>Brandel</td><td>SYN4007LS</td><td>Polizom profili</td></tr><tr><td>Polioksietilen-10-Tridesil-Eter (PTE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2393</td><td>Polizom profili</td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega</td><td>N251B</td><td>Polizom profili</td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat (DOC)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-D6750</td><td>Polizom profili</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5391</td><td>Polizom profili</td></tr><tr><td>SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>BP170-8882</td><td>Normalizasyon</td></tr><tr><td>TRI reaktifi</td><td>MRC</td><td>TR118</td><td>RNA ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>J.T.Baker</td><td>&nbsp; 4109-06</td><td>Polizom profili</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-100K</td><td>ultrasantrifüj</td></tr><tr><td>UV/VISDETECTOR</td><td>Brandel</td><td>UA-6</td><td>Polizom profili</td></tr></tbody></table>

isı stresi altında polizom profilleri kullanılarak translasyon verimliliği testi

Translation Efficiency Test Using Polysome Profiles Under Heat Stress

Arabidopsis'in vahşi türü olan Col-0, MS ortamında 16 h: 8 h ışık fotoperiyodu altında büyütüldü. Kontrol için, ısı stresi işlemi yapılmadan 5 günlük fideler kullanıldı. Isı stresi grubu, önceden ısıtılmış bir su banyosunda 40 °C'de 1 saat ısıl işleme tabi tutulurken, geri kazanım grubu, ısıl işlemden hemen sonra 2 saat boyunca 22 °C'ye yerleştirildi. Farklı ısıl işlem koşulları ve geri kazanım koşulları kullanarak, translasyon verimliliklerini ölçmek için sonraki adımları kullanabiliriz.
RNA ekstraksiyonundan önce, önce sükroz gradyanı hazırlanmalıdır. Polizomal olmayan ve polisomal RNA'yı yoğunluk farklarına göre ayırmak için .5, $.4, 6.3, H.1 ve ` sükroz konsantrasyonlarına sahip bir gradyan çözeltisi hazırladık. Daha sonra gradyan çözeltilerini alttan başlayarak yüksek konsantrasyondan düşük konsantrasyona doğru yükledik (Şekil 1A). Daha sonra, bu gradyanı üst katmanda düşük yoğunluklu polisomal olmayan RNA'yı ayırmak için kullanabiliriz, daha yüksek yoğunluklu polisomal RNA ise daha yüksek sükroz konsantrasyonlarına sahip alt katmanda dağıtılacaktır. Polizomal olmayan ve polisomal RNA, tedavi edilmiş veya tedavi edilmemiş Col-0'dan ekstrakte edildi. Çözeltideki partiküllerin polizom profilleme analizinin sonuçlarını etkilemesini önlemek için, RNA içeren çözelti, partikül içermeyen bir ekstraksiyon çözeltisi elde etmek için bir hücre süzgecinden süzülmelidir. Filtrelenmiş süpernatant, önceden hazırlanmış bir sükroz gradyanına yüklendi ve dengelendi. Sükroz gradyan yüklü numunelerin ultrasantrifüjlenmesinden sonra, polisomal olmayan ve polisomal RNA, sükroz gradyanı içindeki yoğunluğa göre dağıtıldı. Daha sonra, bir yoğunluk gradyan fraksiyonlayıcı kullanılarak polizom profillemesi gerçekleştirildi (Şekil 1B). Yoğunluk gradyan fraksiyonlayıcı, başlangıçta deiyonize su ile kalibre edilmiş yazılım kullanılarak kontrol edilir. Kalibrasyonun ardından numuneler, ultrasantrifüjleme sonrası fraksiyonlayıcıya yüklenir. Yazılım kontrol modunda çalışan mikro hacimli şırınga pompası, numuneyi iterek gradyan içine sakaroz gradyanından daha yüksek konsantrasyonlara sahip sakaroz solüsyonu enjekte eder. Bu, ölçümün yoğunluğun daha düşük olduğu sükroz gradyanının tepesinden başlamasına ve yoğunluğun daha yüksek olduğu yere doğru ilerlemesine izin verir. Daha sonra, OD254 ölçümü yoluyla polizom profil grafiği oluşturularak veri toplamaya başlamak için yazılım ayarları etkinleştirilir (Şekil 1B). Polizomal fraksiyonda daha yüksek bir sinyal yoğunluğu gözlemlediğimizde, numunenin daha yüksek translasyon verimliliği sergilediğini gösterir.
Farklı işlemler altında 5 günlük Col-0 fideleri için polizom profilleme grafikleri Şekil 2'de gösterilmektedir. Kontrol grubunun sonuçları, polisomal olmayan fraksiyon ile polizomal fraksiyon arasında net bir ayrım olduğunu göstermektedir (Şekil 2A). Bununla birlikte, 40 ° C'de 1 saatlik ısı stresinden sonra, polisomal fraksiyonun sinyal yoğunluğu önemli ölçüde azalmıştır (Şekil 2B). Isıl işlem görmüş fidelerin 22 °C'de 2 saat boyunca toparlanmasına izin verildiğinde, polisomal fraksiyonun sinyal yoğunluğu kontrol grubuna benzer bir seviyeye geri kazanılmıştır (Şekil 2C). Sonuçlarımız, 1 saatlik ısı stresi işleminin Arabidopsis fidelerinin çeviri verimliliğini önemli ölçüde azalttığını göstermiştir. Bununla birlikte, bitkilerin, translasyon verimliliğini ısı stresinden muzdarip olmayan fidelerinkiyle karşılaştırılabilir seviyelere geri yüklemek için 2 saatlik bir geri kazanıma ihtiyacı vardı.
Farklı tedavi koşulları altında Col-0 fidelerinin translasyon verimliliğini karşılaştıran daha fazla kanıt toplamak için, polisomal olmayan ve polisomal RNA fraksiyonlarını izole ettik ve ekstrakte ettik. Polizomal olmayan ve polisomal RNA fraksiyonlarının toplanması, polizom profil ölçümlerinin sonuçları tarafından yönlendirildi. Polizomal olmayan ve polisomal RNA ekstraksiyonu için, izole edilmiş polizomal olmayan ve polizomal RNA örneklerini çıkarmak için fenol / guanidinyum tiyosiyanat reaktifini kullanıyoruz. Kullandığımız RNA ekstraksiyon yöntemi ile aşağıdaki analizimiz için stabil ve yüksek kaliteli RNA elde edebiliriz (Tablo 1). Daha sonra, değişen ekstraksiyon kayıplarının neden olduğu hataları azaltmak için ekstrakte edilen RNA'yı GeneChip Ökaryotik Poli-A RNA Kontrol Kiti ile normalleştirin. Daha sonra, kite eklenen B. subtilis genlerinde bulunan DAP genlerinin ekspresyonunu ölçmek için gerçek zamanlı PCR kullanıldı. Polizomal olmayan ve polisomal RNA grupları arasındaki DAP gen ekspresyon seviyelerinin karşılaştırmalı analizi, oransal kayıp koşulları altında RNA içeriğini tahmin etmek için yapılmıştır (Şekil 3A). Aralarındaki translasyon verimliliğini netleştirmek için normalleştirilmiş polizomal RNA'nın toplam RNA'ya oranını hesapladık (Şekil 3B). Son olarak, polizomlardaki RNA oranı, normalleştirilmiş RNA içeriği kullanılarak hesaplandı (Şekil 3C). Col-0'ın farklı tedavileri altındaki polizomlardaki RNA oranının sonuçları, Şekil 2A'da gösterilen polizom profili sonuçlarıyla tutarlı bir model sergiledi. Her iki sonuç da ısı stresinin polisomal fraksiyondaki RNA oranını önemli ölçüde azalttığını ve bu etkinin 22 ° C'de 2 saatlik bir geri kazanımdan sonra tersine çevrilebileceğini göstermektedir (Tablo 1).
Bu yöntemden, RNA'yı ek fraksiyonlara ayırmak yerine, polizomal olmayan veya polizomal RNA fraksiyonunun tamamını yüksek kalitede elde edebiliriz23. Sonuçlarımız ayrıca, hem polizom profillerinin hem de polizomlardaki RNA yüzdesinin, farklı tedavi koşullarıyla Arabidopsis'teki translasyon verimliliğini etkili bir şekilde yansıtabileceğini göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67445/67445fig01.jpg"> Şekil 1: Polizom profil oluşturma iş akışı şeması. (A) 13 mL'lik bir santrifüj tüpünde sükroz gradyanının hazırlanmasının şematik gösterimi. (B) Akış şeması, polizom profillemenin deneysel sürecini göstermektedir. İlk olarak, translatom çıkarılır. Daha sonra, polizomal olmayan ve polizomal RNA, değişen yoğunluklardaki sakaroz gradyanlarında ultrasantrifüjleme kullanılarak yoğunluk farklılıklarına göre ayrılır. OD254 , aşağıdaki polizom profil oluşturma sonuç grafiğini elde etmek için bir yoğunluk gradyan fraksiyonlayıcı kullanılarak ölçülür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67445/67445fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67445/67445fig02.jpg"> Şekil 2: Farklı koşullar altında Col-0'ın polizom profili. (A, B, C) (A) ısıl işlem yapılmaması (kontrol), (B) 40 °C'de 1 saat ısıl işlem ve (C) ısıl işlemden sonra 1 saat boyunca 22 °C'de geri kazanım koşulları altında Col-0'ın polizom profilleme sonuçları. Polizomal olmayan ve polisomal RNA, .5-` sükroz gradyanı kullanılarak fraksiyone edildi. Polizomal olmayan (NP) ve polizomal (PL) RNA'nın pozisyonları profillerde belirtilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67445/67445fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67445/67445fig03.jpg"> Şekil 3: Polizomal olmayan ve polizomal RNA ekstraksiyonu iş akışı diyagramı. (A) Spike ile RNA normalizasyonunun bir örneği. (B) Polizomal olmayan ve polizomal RNA'nın ayrılmasının ve polisomal RNA yüzdesinin hesaplanmasının bir gösterimi. (C) Farklı koşullarla tedavi edilen Col-0'daki polisomal RNA yüzdesi. Hata çubukları SD ± ortalamayı gösterir (n=3 biyolojik tekrar). *p değeri &lt; 0.01, Öğrenci t testi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67445/67445fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td></td>
			<td>İçerik (ng)</td>
			<td>260/280</td>
			<td>260/230</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Kontrol</td>
			<td>RNANP</td>
			<td>758.3</td>
			<td>2.19</td>
			<td>2.16</td>
		</tr><tr><td>RNAPL</td>
			<td>302.3</td>
			<td>2.21</td>
			<td>2.13</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Isı stresi</td>
			<td>RNANP</td>
			<td>821.5</td>
			<td>2.2</td>
			<td>2.15</td>
		</tr><tr><td>RNAPL</td>
			<td>174.3</td>
			<td>2.19</td>
			<td>2.21</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Kurtarma</td>
			<td>RNANP</td>
			<td>797.2</td>
			<td>2.17</td>
			<td>2.16</td>
		</tr><tr><td>RNAPL</td>
			<td>300.9</td>
			<td>2.19</td>
			<td>2.18</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Polizomal olmayan ve polisomal RNA içerikleri ve nitelikleri. Bu tablo, RNA içeriğinin ve niteliklerinin analiz edildiğini gösterdi. RNA içeriği, modifiye yöntemler kullanılarak ekstraksiyondan sonra normalize edildi.

Isı Stresi Altında Polizom Profilleri Kullanılarak Translasyon Verimliliği Testi

Translational control of different genes under heat stress is a critical step for plant adaptation to the environment. Assessing the translational ...

translation-efficiency-test-using-polysome-profiles-under-heat-stress

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, stres koşullarında tepki olarak ökaryotik hücrelerin mRNA çevirisi başlatılmasında değişiklikleri analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem olmayan çeviri ribozom ribozomlan çeviri sakaroz Yokuşta hız ayrılık dayanmaktadır.

Polizom profilleme Stres Durumlardaki Çeviri başlatılması Analizi

Ribozomlar protein sentezinde önemli bir rol oynamaktadır. Sükroz yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile Polyribosome (Polizom) fraksiyonlara ayırma, bir genom geniş bir ölçekte tek mRNA translasyon etkinliklerine doğrudan belirlenmesini sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem, şaperonlar ve sinyal molekülleri gibi ribozom-ve Polizomdan ilişkili faktörleri biyokimyasal analizi için kullanılabilir.

Bir genom Ölçeği Polizom Fraksiyonu ve Memeli Translatomes Analizi

Hücrelerin strese uyum sağlama yeteneği, hayatta kalmaları için çok önemlidir. mRNA translasyonunun düzenlenmesi, proteomun hızlı bir şekilde düzenlenmesini sağlayan böyle bir adaptasyon stratejisidir. Burada, stres koşulları altında seçici olarak çevrilen spesifik mRNA'ları tanımlamak için standartlaştırılmış bir polizom profilleme protokolü sunuyoruz.

Polizom Profil Yöntemi ile memeli hücrelerine selektif mRNA dönüşümüyle Değerlendirilmesi

Bu protokol, bağlı ribozom sayısına dayanarak bitki dokularından transkriptleri çıkarmak ve fraksiyonlamak için kolay bir yöntemi açıklar. Translasyon aktivitesinin küresel bir tahminine ve belirli mRNA'ların translasyon durumunun belirlenmesine izin verir.

Bitki Polizom Profiling için bir Kolay Yöntem

Polysome profil çıkarma tekniği genel amacı, protein sentezi sırasında translasyonel etkinlik bireysel mRNA'ların veya transcriptome mRNA'ların analizidir. Protein sentezi yönetmelik, çeviri harekete geçirmek ve baskı sağlık ve birden çok insan hastalıkları için önemli bir yöntemdir.

Polysome LEISHMANIA, insan hücreleri ve fare Testis profil oluşturma

Burada izole periosteum fare kalp üzerinde profil oluşturma polysome gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Biz kalp perfüzyon, profil oluşturma polysome ve polysome kesirler ile ilgili mRNA'ların, miRNAs ve polysome Proteom analizi için yöntemler açıklanmaktadır.

Dinamik proteomik ve miRNA analiz polizomlar izole fare kalp sonra Langendorff perfüzyon üzerinden

Canlı maya ve memeli hücrelerinde formaldehit çapraz bağlama ile çevirisel (protein biyosentez) kompleksleri hızla stabilize etmek için bir teknik sunuyoruz. Yaklaşım, geçici ara maddelerin ve dinamik RNA:protein etkileşimlerinin parçalanarak parçalanmasını sağlar. Çapraz bağlantılı kompleksler, derin sıralama tabanlı profil oluşturma yöntemleri, mikroskopi ve kütle spektrometresi gibi birden fazla aşağı akış uygulamasında kullanılabilir.

Ökaryotik Hücrelerden Çeviri Komplekslerinin Hızlı In Vivo Fiksasyonu ve İzolasyonu

Bu protokol, otomatik gradyan üreticileri veya gradyan fraksiyonasyon sistemleri kullanmadan bir çoklu profilin nasıl oluşturulacağını açıklar.

Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme

Isı Şoku Yöntemiyle E. coli içine Plazmid DNA Dönüşüm

Bu video, biofeedback kullanarak stres kişinin psikofizyolojik reaksiyon değerlendirilmesinde bir yöntem anlatacağım. Ayrıca, tedavi planlaması için genel kurallar sunacak.

Biofeedback Kullanımı Psikofizyolojik Stres Değerlendirme

Öğrenin, Arabidopsis thaliana'da ısı stresi altında translasyon verimliliğini polizom profilleme yöntemiyle nasıl analiz edeceğinizi. Bu protokol, translatomik araştırmalar için standartlaştırılmış teknikler sunar.

Isı Stresi Altında Polizom Profilleri Kullanılarak Translasyon Verimliliği Testi

Daha fazla video keşfet