THP-1 Hücrelerinde Elektroporasyon Tabanlı CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Nakavt ve Tek Hücreli Klon İzolasyonu

Araştırma faaliyetim, makrofajları AIDS pandemisinden sorumlu virüs olan HIV enfeksiyonuna dirençli hale getiren mekanizmaları anlamaya odaklanmaktadır. Özellikle, viral genomların yapı taşları olan NTP'leri parçalayan bazı HT-1 adı verilen enzimin aktivitesine odaklanıyoruz. Ancak bu enzimin açıklamaya çalıştığımız başka aktiviteleri de var.

THP1 hücrelerinin genetik mühendisliğini yapmak için bir protokol oluşturduk. Bu hücreler, insan makrofajlarının çalışması için iyi kurulmuş bir vekildir. Örneğin, HIV-1'in replikasyonu.

Bu hücrelerin protein içeriklerini manipüle etmek için transfekte edilmesi zordur. Bu nedenle, CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak genomlarını manipüle etmek için yöntemler oluşturuyoruz. SG RNA'larının tasarımından poliklonal ve monoklonal popülasyonların doğrulanmasına kadar.

Protokolümüz, Cas9 nükleaz enerji RNA'ları tarafından yapılan önceden monte edilmiş ribonükleoprotein kompleksleri ile elektropore edilecek olan THP1 hücrelerinde ilgilenilen bir genin yüksek verimli düzenlenmesini sağlamayı amaçlamaktadır. Bu yaklaşımda, Cas9 aktivitesi zamanla sınırlıdır. Bu, genellikle lenti vektörleri kullanıldığında ortaya çıkan hedef etkilerin oluşturulma olasılığını azaltır.

Ve bu durumda, gerçekten de Cas9 ifadesi süreyi uzatıyor ve bu nedenle hücre için zararlı olabilir. Başlamak için, 24 oyuklu bir kültür plakasının her bir kuyusunu antibiyotiksiz ve %20 ısıyla inaktive edilmiş ve filtrelenmiş FBS ile desteklenmiş 500 mikrolitre RPMI 1640 ortamı ile doldurun. Plakayı gece boyunca nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin.

Kuru tek kılavuzu veya sgRNA'ları 100 mikromolar nihai konsantrasyona yeniden sulandırmak için, bir nano mol sgRNA başına 10 mikrolitre TE tamponu ekleyin. Solüsyonu 30 saniye vorteksleyin ve tam rehidrasyonu sağlamak için gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, 30 mikromolar çalışma sgRNA çözeltisini hazırlamak için önce 100 mikromolar stok sgRNA çözeltisini bir pipetle kısaca homojenize edin, ardından sapı nükleaz içermeyen suda seyreltin.

Çözeltiyi 30 saniye vorteksleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Cas9 sgRNA ribonükleoproteinlerini birleştirmek için üç, 30 mikromolar sgRNA'nın çalışma solüsyonunun her birinden bir mikrolitre ve 0.5 mikrolitre 20 mikromolar Cas9 solüsyonunu 3.5 mikrolitre resüspansiyon tamponu R içinde seyreltin, bir ila dokuz molar oran ekleyin. Kısa bir süre girdap yapın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Düzenlenmemiş bir kontrol hazırlamak için, 6,5 mikrolitre yeniden süspansiyon tamponu R.Vortex'e kısaca 0,5 mikrolitre 20 mikromolar Cas9 çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin, elektroporasyon koşulu başına 12 mikrolitrelik bir nihai hacim elde etmek için numunelere beş mikrolitre yeniden süspansiyon tamponu R ekleyin. Hücre sayımından sonra THP-1 hücrelerini hazırlamak için, altı THP-1 hücresinin gücüne 0.2 çarpı 10'a eşdeğer bir hacim toplayın ve bunları 20 santigrat derecede beş dakika boyunca 336G'de santrifüjleyin, süpernatanı bir pipet kullanarak aspire edin ve peleti 500 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Tekrar santrifüjleyin ve hücre peletini 12 mikrolitre ribonükleoprotein çözeltisinde yeniden süspanse edin.

Elektroporasyon sistemini kurmak için, pipet istasyonunu bir biyogüvenlik kabininin altına yerleştirin ve kabinin içine bir elektroporasyon tüpü yerleştirin, elektroporasyon kitinden elektroporasyon tüpüne üç mililitre tampon E ekleyin. Elektroporasyon cihazını açın ve elektroporasyon parametrelerini, voltajı 1.500 volta ayarlamak için dokunmatik ekranı kullanın. Süre 10 milisaniyeye kadar.

Ve üçe kadar sayı. Elektroporasyon pipetini bir uçla donatın ve 10 mikrolitre ribonükleoprotein THP-1 solüsyonunu aspire edin. Pipeti elektroporasyon tüpüne yerleştirin ve elektroporasyon cihazı ekranında başlat düğmesine basın.

Tamamlandı mesajının görünmesini bekleyin ve pipeti tüpten çıkarın. THP-1 hücrelerini önceden ısıtılmış 24 oyuklu kültür plakasının bir kuyucuğuna aktarın ve numuneyi nazikçe homojenize edin. Plakayı nemlendirilmiş inkübatöre geri yerleştirin ve hücrelerin 72 saat boyunca rahatsız edilmeden dinlenmesine izin verin.

Elektroporasyon ve hücre sayımından sonra, altı THP-1 hücresinin gücüne 0,1 çarpı 10'a eşdeğer bir hacmi 1,5 mililitrelik bir tüpe çekin. Hücreleri 336G'de 20 santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin ve peleti 500 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse etmeden önce süpernatanı aspire edin. Yine, hücreleri santrifüjleyin, peleti bozmadan mümkün olduğunca fazla süpernatan aspire edin ve peleti dondurun.

Genomik DNA'nın ekstraksiyonu için, peleti 50 mikrolitre DNA ekstraksiyon çözeltisi ile yeniden süspanse edin. Homojenize edin ve tüm hacmi 0,2 mililitrelik bir PCR tüpüne aktarın. Tüpü girdaplayın ve üç saniyelik nabız için kısa bir süre santrifüjleyin.

Tüpü bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve 15 dakika boyunca 65 santigrat derecede, ardından 10 dakika boyunca 98 santigrat derecede ısıtın. Daha sonra, ekstrakte edilen DNA'yı 90 mikrolitre Ultra saf su ile seyreltin, girdap yapın ve üç saniye boyunca 5000G'de kısaca santrifüjleyin. PCR astarını ultra saf suda 10 mikromollük bir nihai konsantrasyona kadar seyreltin.

PCR karışımını 0.2 mililitrelik bir PCR tüpünde hazırlayın. PCR tüplerini termal döngüleyiciye yerleştirin ve programı belirtilen ayarlarla çalıştırın. Yeni bir 0.2 mililitrelik tüpte poliklonal düzenlenmiş popülasyonlar için.

19,5 mikrolitrelik bir son hacim için 17,5 mikrolitre PCR amplikonunu iki mikrolitre E tamponu ile karıştırın. Çözeltiyi girdaplayın ve kısa bir süre santrifüjleyin, alternatif olarak, tek hücreli klonları taramak için, PCR ürünlerini düzenlenmiş ve düzenlenmemiş kontrol hücrelerinden bire bir oranında karıştırın. Hetero dubleks oluşumu için tüpleri bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve verilen programı çalıştırın.

Hetero dubleks oluşumundan sonra, tüpe 0.5 mikrolitre T yedi endonükleaz, bir çözelti ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Numuneleri jel elektroforezi için hazırlamak için, beş mikrolitre T7 endonükleaz bir sindirim ürünü veya sindirilmemiş PCR ürününü beş mikrolitre su ve iki mikrolitre altı xDNA yükleme boyası ile karıştırın, numuneleri ve boyut merdivenini jele yükleyin ve jeli 80 voltta 45 dakika çalıştırın. EGFP lokusunun CRISPR Cas9 aracılı gen düzenlemesi, GFP pozitif hücrelerin keskin bir düşüşüne neden oldu ve elektroporasyondan sonraki yedinci günde %90'dan fazla azalmaya ulaştı.

Elektroporasyondan sonraki üçüncü günde, elektroporasyonun neden olduğu stres nedeniyle hücre sayıları yarıya indi, ancak tam RPMI ortamında yedinci günde tamamen iyileşti. T7 Endonükleaz, bir söz ve Agarose'un jel elektroforezi, düzenlenmiş hücrelerde yaklaşık 75 baz çifti fragmanının kaybını gösterdi ve EGFP hedef bölgesinin CRISPR düzenlemesini doğruladı.