Name: Click Kimyası ve Genleşme Mikroskobu ile Hücre İçi Sialilasyonun Görselleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Keşfedin: Metabolik etiketleme, tıklama kimyası ve genleşme mikroskobu kullanarak hücre içi sialilasyonu görselleştirme yöntemi. Bu protokol, süper çözünürlüklü ekipman gerektirmeden yüksek çözünürlüklü biyogörüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Hücre tohumlama
NOT: Sonraki adımları steril koşullar altında laminer akış başlığı altında gerçekleştirin. Bu yöntem, mevcut çalışmada kullanılan hücre dizilerinden herhangi birine (HeLa, MCF7, primer fibroblastlar) veya araştırmada yaygın olarak kullanılan çoğu yapışık hücre dizisi modelineuygulanabilir 20,24,25.
<ol>
	<li>% 5 CO2 atmosferi altında 37 ° C'de bir T75 şişesinde% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş DMEM yüksek glikoz ortamında hücreleri büyütün.</li>
	<li>Hücreler tam birleşmeye ulaştığında, hücre kültürü ortamını çıkarın ve hücreleri 4 mL PBS ile yıkayın. NOT: Bu adımda ve sonraki tüm yıkama adımlarında kullanılan PBS çözeltileri, kullanımdan önce 0.2 μm'lik bir PTFE membrandan süzülerek steril hale getirilmelidir.</li>
	<li>Hücreleri, şişenin dibinden serbest bırakmak için 0.5 g / L tripsin içeren 2 mL 1x tripsin-EDTA çözeltisinde 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>% 10 FBS içeren 8 mL DMEM yüksek glikoz ortamı ekleyin ve her bir hücrenin şişenin dibinden ayrıldığından emin olmak için iyice karıştırın.</li>
	<li>Hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 200 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Bu arada, 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bir lamel (çap 12 mm, kalınlık 130-160 μm) ekleyin. NOT: Lamel kalınlığı, sonraki görüntüleme adımlarında kullanılan mikroskobun gereksinimlerine uyacak şekilde ayarlanmalıdır.</li>
	<li>Santrifüjlemeden sonra süpernatanı çıkarın ve peleti 1 mL hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin.</li>
	<li>En az iki ölçümde hemositometri ile ortalama hücre / mL sayısını belirleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu, hücre kültürü ortamında mL başına 300.000 hücre konsantrasyonuna seyreltin ve her bir oyuğa 1 mL süspansiyon tohumu ekin.</li>
	<li>Sonraki adımlardan önce,% 5 CO2 atmosferi altında% 37 ° C'de% 10 FBS içeren% 10 FBS içeren DMEM yüksek glikoz ortamında 24 saat bekletin.</li>
</ol>
2. Klorokin tedavisi (isteğe bağlı)
NOT: Adım 2.1-2.8, örnek olarak klorokin kullanılarak, harici bir reaktif (inhibitör, efektör, ilaç) ile tedavi edilen hücrelerde protokolün nasıl kullanılacağını göstermektedir. Harici reaktiflerle tedavi edilmeyen hücreler için bu adımları atlayın.
<ol>
	<li>Yeterli hacimde 10 mM'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için doğru miktarda klorokin difosfat tuzu (CQ) tartın. NOT: Sonraki adımları steril koşullar altında laminer akış başlığı altında gerçekleştirin.</li>
	<li>Katı CQ'yu 10 mM'lik bir nihai konsantrasyon için istenen miktarda deiyonize suda çözündürün.</li>
	<li>Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreden süzün.</li>
	<li>10 mM'lik stok çözeltisinin 1 mL'sini 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerinde alın ve -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>Adım 1.9'da hazırlanan hücre örneğini 1 mL PBS ile yıkayın.</li>
	<li>100 μM CQ'luk bir nihai konsantrasyon için% 10 FBS içeren% 10 mL DMEM yüksek glikoz ortamına 100 μL 10 mM CQ ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri,% 5 CO2 atmosferi altında 37 ° C'de 100 μM CQ ile desteklenmiş bir ortamın 1 mL'sinde 8 saat inkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri 3x 1 mL PBS ile yıkayın.</li>
</ol>
3. Metabolik oligosakkarit mühendisliği
<ol>
	<li>% 10 FBS içeren DMEM yüksek glikoz ortamında 5 mM'lik bir ManNAz (veya negatif kontrol koşulu için ManNAc) stok çözeltisi hazırlayın. NOT: Bu stok çözeltisi, her bir kuyucuğun 1 mL şeker analog çözeltisi ile muamele edilebilmesi için yeterli hacimde olmalıdır. Sonraki adımları steril koşullar altında laminer akış başlığı altında gerçekleştirin.</li>
	<li>Çözeltiyi 0.2 μm'lik bir filtreden süzün ve gerekene kadar -20 ° C'de 1 mL alikotlarda saklayın.</li>
	<li>Adım 3.2'de hazırlanan 1 mL'lik bir stok çözeltisi alikotunu% 10 FBS içeren 9 mL DMEM yüksek glikoz ortamı ile seyrelterek 500 μM ManNAz veya ManNAc ile takviye edilmiş bir ortam hazırlayın.</li>
	<li>Adım 1.9'da (işlenmemiş hücreler üzerinde deneyler için) veya adım 2.8'de (CQ ile muamele edilen hücreler üzerinde yapılan deneyler için) hazırlanan hücreleri, 500 μM ManNAz (veya kontrol grubu için 500 μM ManNAc) ile takviye edilmiş 1 mL'lik ortamda% 5 CO2 atmosferi altında 37 ° C'de 24 saat boyunca inkübe edin.</li>
</ol>
4. Fiksasyon ve geçirgenlik
NOT: Tüm bu adımlar çeker ocak altında gerçekleştirilir.
<ol>
	<li>Numuneleri 1 mL PBS ile yıkayın.</li>
	<li>500 μL %5 paraformaldehit ekleyerek hücreleri her bir lamel üzerine sabitleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika dinlendirin.</li>
	<li>3 kez 1 mL PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Kapaklı, yeterince büyük opak bir kutu (örneğin bir polistiren kutu) kullanarak özel bir nem odası hazırlayın. Kutunun altına ıslak bir parça kurutma kağıdı yerleştirin ve üzerine bir kat parafilm yerleştirin. NOT: Nemli oda, kapatıldığında numuneyi dış ışık kaynaklarından tamamen korumalıdır.</li>
	<li>Lamelleri, hücreler yukarı bakacak şekilde parafilm üzerine yerleştirin. NOT: Parafilmi, numunelerin adı veya referansı ile önceden etiketleyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS'de 200 μL% 0.5 (h / h) Triton X-100 kullanarak hücre geçirgenliği gerçekleştirin.</li>
	<li>3x'i 200 μL PBS ile yıkayın.</li>
</ol>
5. Floresan etiketleme
<ol>
	<li>Etiketli sialillenmiş glikanların CuAAC etiketlemesi NOT: CuAAC reaksiyon tamponu kullanımdan önce taze olarak hazırlanmalı ve reaktanlar belirtilen sırayla eklenmeli, en son sodyum askorbat eklenmelidir. Oksijenli sulu çözeltilerde, Cu(II)'nin askorbat ile indirgenmesiyle oluşan Cu(I) iyonları kademeli olarak Cu(II)'ye yeniden oksitlenecek ve zamanla askorbat konsantrasyonunda bir azalmaya yol açacaktır. Sonucun tekrarlanabilirliğini korumak için, tampon 4 °C'de birkaç günden fazla saklanmamalıdır ve tercihen aynı gün kullanılmalıdır.<ol>
		<li>Bölüm 3'te mühendisliği yapılan azid ile modifiye edilmiş sialillenmiş glikanları etiketlemek için, 5 μM AlexaFluor 488 alkin (AF488Alk), 150 μM CuSO4, 300 μM 2-(4-((bis((1-(tert-butil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)metil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)asetik asit (BTTAA), 0.1 MK2HPO4ve deiyonize suda 2.5 mM sodyum askorbat. Her lamel için 200 μL uygulamak için yeterli çözelti hazırlayın.</li>
		<li>Reaksiyonu başlatmak için her lamel üzerine 200 μL CuAAC tamponu ekleyin. Numunenin damla ile homojen bir şekilde kaplandığından emin olun ve ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 45 dakika reaksiyona girmesine izin verin.</li>
		<li>Reaksiyonu durdurmak ve fazla prob ve reaktifleri çıkarmak için 3x'i 200 μL PBS ile yıkayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Çekirdek boyama<ol>
		<li>Hoechst 33342 ile nükleer etiketleme için, PBS'de 1: 2000'de 10 mg / mL'lik bir stok çözeltisini seyreltin. NOT: Aynı etki için 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) gibi eşdeğer nükleer karşı boyalar kullanılabilir.</li>
		<li>Hücreleri bu solüsyondan 200 μL ile örtün ve ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 5-10 dakika inkübe edin.</li>
		<li>3x'i 200 μL PBS ile yıkayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>İmmünofloresan boyama<ol>
		<li>50 mL tampon için 0.1 g jelatin, 1 g BSA, 1 mL FBS ve 49 mL PBS içeren bir Sığır Serum Albümini (BSA) bloke edici tampon hazırlayın.</li>
		<li>Numuneleri 200 μL BSA bloke edici tampon içinde 4 ° C'de 1 saat inkübe edin. Numuneyi ışıktan koruyun.</li>
		<li>Saflaştırılmış bir fare anti-GM130 antikoru kullanılarak Golgi aygıtının immünofloresan boyaması için (epitop tanınan: Sıçan GM130 aa. 869-982 | RRID: AB_398142), hazırlanan BSA bloke edici tamponda birincil antikoru 1:100'de seyreltin. NOT: Bu adım, ilgili herhangi bir primer antikor kullanılarak diğer organelleri hedef alan immünofloresan boyamaya uyarlanabilir, bu durumda seyreltme faktörü üreticinin kılavuzuna göre uyarlanmalıdır.</li>
		<li>Antikor içeren solüsyondan 70 μL'yi lamellere ekleyin ve ışıktan koruyarak 4 °C'de 1 saat inkübe edin.</li>
		<li>3x'i 200 μL PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Floresan ikincil antikoru (Alexa Fluor 546 anti-fare IgG) BSA bloke edici tamponda 1:600'de seyreltin ve her lamel üzerine 100 μL ekleyin.</li>
		<li>Numuneleri ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.</li>
		<li>3x'i 200 μL PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Lamelleri 6 oyuklu bir plakaya aktarın. Numuneleri 2 mL PBS'de 4 °C'de birkaç gün ışıktan koruyarak saklayın. NOT: Genişletmeden önce ve sonra karşılaştırma amacıyla referans olarak ve genişletmeden sonra etiketleme modelinin bozulmadığından emin olmak için her zaman yalnızca görselleştirme preExM için bir kopya hazırlanması önerilir.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Numunelerin genişleme öncesi görüntülenmesi
NOT: Aşağıdaki adımlar, kullanılan biyogörüntüleme ekipmanına bağlıdır ve makinenin gereksinimlerine göre ayarlanması gerekebilir. Lütfen yerel laboratuvarın veya biyogörüntüleme platformunun kurallarına uyun. Buradaki 6.1-6.13 numaralı adımlar lazer taramalı konfokal mikroskopta gerçekleştirilir.
<ol>
	<li>Mikroskobu açın ve ışık kaynaklarının (lazerler) ısındığından emin olun. Biyogörüntüleme toplama yazılımını açın.</li>
	<li>Kanalları oluşturmak için floroforlara karşılık gelen lazer uyarma dalga boylarını seçin (örneğin, nükleer boyama için 405 nm, AF488Alk etiketli sialillenmiş glikanlar için 488 nm ve immünofloresan etiketleme için 546 nm). Lazerleri buna göre etkinleştirin.</li>
	<li>32 mm çapında bir lamel (130-170 μm kalınlık) mikroskoba uyarlanmış bir tutucuya yerleştirin ve sabitleyin.</li>
	<li>Adım 5.3.9'da hazırlanan numuneyi, hücreler aşağı bakacak şekilde 32 mm'lik lamel üzerine yerleştirin. Numunenin kurumasını önlemek için bir damla deiyonize su ekleyin.</li>
	<li>Uygun bir objektif lens seçin, burada 1,4 sayısal diyafram açıklığına veya eşdeğerine sahip 63x yağa daldırma objektifi. NOT: En yüksek sayısal diyafram açıklığı en iyi çözünürlüğü sağlar. Yağa daldırma objektifi kullanırken, objektif ile lamel arasına bir damla yağ eklemeyi unutmayın.</li>
	<li>Tutucuyu objektifin üzerindeki mikroskop tablasına yerleştirin.</li>
	<li>Numunedeki bir ilgi alanını bulmak için parlak alan veya düşük lazer yoğunluklu floresan modunu kullanın.</li>
	<li>Odağı ayarlayın.</li>
	<li>Yazılımdaki hücreleri canlı floresan modunda görselleştirin. Her kanal için lazer yoğunluğunu ayarlayın. Foto ağartmayı önlemek için düşük lazer gücüyle başlayın. Lazer gücünü yavaşça artırın ve floresansı aşırı pozlama olmadan net bir şekilde görselleştirmek için gerektiği gibi aşırı gürültü oluşturmadan sinyali yükseltmek için dedektör kazancını ve ofsetini ayarlayın. NOT: Parametreler, hem arka plan gürültüsünü en aza indirecek hem de sinyal doygunluğunu önleyecek şekilde ayarlanmalıdır. Negatif kontroller de dahil olmak üzere bir dizi deneyde tüm numunelerde tutarlı ayarların sürdürülmesi çok önemlidir.</li>
	<li>İstenen gözleme ulaşmak için iğne deliği boyutu (örn. 1 Havadar Birim), tarama hızı (örn. 8), yakınlaştırma faktörü (örn. 1), parlaklık değerleri aralığı (örn. 16 bit) ve ortalama sayı (örn. 2), mod (örn. çizgi) ve yöntem (örn. ortalama) gibi görüntü parametrelerini gerektiği gibi ayarlayın. NOT: Bu değerler sisteme ve örneğe bağlıdır ve alınmadan önce optimize edilmelidir. İğne deliği boyutu, sayısal diyafram açıklığına, büyütmeye ve dalga boyuna bağlıdır: azaltmak, sinyal-gürültü oranı pahasına çözünürlüğü iyileştirebilir. Foto ağartmayı önlemek için tarama hızının hızlı değerlere (piksel başına küçük bekleme süresine karşılık gelir) ayarlanması önerilir.</li>
	<li>Alımı gerçekleştirin ve verileri ileride başvurmak üzere uygun meta verilerle istenen biçimde kaydedin.</li>
	<li>Alım bittiğinde, bir cımbızla transferi kolaylaştırmak için az miktarda deiyonize su ekleyerek numuneyi 6 oyuklu plakaya geri koyun. NOT: Adım 6.12, yalnızca bu özel numunenin genişletilmesi gerekiyorsa gerçekleştirilir. Aksi takdirde, örneği atın ve aşağıdaki adımlar için diğer kopyaları kullanın.</li>
</ol>
7. Genişleme mikroskobu protokolü
NOT: Foto ağartmayı önlemek için numuneler ışıktan mümkün olduğunca korunur. Ankraj ve jelleşme aşamaları çeker ocak altında gerçekleştirilir.
<ol>
	<li>Ankraj<ol>
		<li>Numuneleri, oda sıcaklığında 1 saat boyunca mekanik bir çalkalayıcı üzerinde PBS'de 3.2 mg / mL konsantrasyonda N-akriloilsüksinimid (NAS) ile inkübe edin. Kuyucuk başına 500 μL çözelti eklemek için yeterli miktarda çözelti hazırlayın (stok çözeltisi: DMSO'da 16 mg / mL NAS). NOT: NAS, bir akriloil grubunu aşılamak için lizin kalıntıları ve proteinlerin N-terminalleri ile reaksiyona girer ve proteinlerin sonraki adımlarda hidrojele bağlanmasını sağlar.</li>
		<li>3 kez 1 mL PBS ile yıkayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jelleşme<ol>
		<li>Aşağıdaki gibi oluşan bir monomer çözeltisi hazırlayın: 50 mL 1x PBS (pH 7.4) içinde 5.843 g NaCl, 1.25 g akrilamid, 0.075 g bis-akrilamid ve 4.313 g sodyum akrilat ekleyin. Her lamel üzerine 70 μL uygulamak için yeterli çözelti hazırlayın. Jelleşmeden en az 24 saat önce 1 mL alikotları dondurun. DİKKAT: Monomerler toksiktir; Uygun koruma ekipmanı ile dikkatli bir şekilde kullanılmalı ve çeker ocak altında tartılmalıdır.</li>
		<li>Bir parafilm parçası üzerine, 70 μL'lik bir monomer çözeltisi damlatılır, ardından 1.4 μL% 10 (h / h) N, N, N, N', -tetrametiletilendiamin (TMEDA), ardından 1.4 μL% 10 (a / h) Amonyum persülfat (APS), damlaya karıştırılır. NOT: Çapraz bağlayıcı reaktifleri bu özel sırayla eklenmelidir, önce TMEDA, ardından APS.</li>
		<li>Hızlı bir şekilde, lameli hücreler aşağı bakacak şekilde çözeltinin üzerine dikkatlice yerleştirin.</li>
		<li>Çözeltinin nemli bir odada oda sıcaklığında 1 saat polimerize olmasına izin verin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sindirim<ol>
		<li>1x TAE tamponu,% 0.5 (h / h) Triton X-100, 0.8 M guanidin HCl ve 8 U / mL proteinaz K'den oluşan bir sindirim tamponu çözeltisi hazırlayın. NOT: Sindirim tamponu kullanımdan önce taze olarak hazırlanmalı ve 37 ° C'de 30 dakika önceden inkübe edilmelidir.</li>
		<li>Adım 7.2'de oluşan hidrojele 1 mL sindirim tamponu ekleyin. Sindirimin mekanik bir çalkalayıcı üzerinde 37 °C'de 3 saat devam etmesine izin verin.</li>
		<li>Sindirim tamponunu çıkarın ve jeli 3x 2 mL deiyonize su ile nazikçe yıkayın. NOT: Hidrojel hafifçe genişleyecek ve kendini kapak kızağından ayıracaktır.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Genleşme<ol>
		<li>Hidrojeli 3 mL deiyonize suda 2 saat genleşmeye bırakın. Suyu her 30 dakikada bir değiştirin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Numunelerin genişleme sonrası görüntülenmesi
<ol>
	<li>32 mm çapında bir lamel (130-170 μm kalınlık) yerleştirin ve bir tutucuya sabitleyin.</li>
	<li>Hidrojelden bir parça kesin ve hücreler jelin dibinde olacak şekilde kapak fişine yerleştirin. NOT: Eksize edilen parçalar, gözlem için yeterli yüzey alanı sağlayacak kadar büyük olmalı, ancak çok büyük olmamalıdır, çünkü bu, jelin kullanımını zorlaştırabilir ve kırılma riskini artırabilir (önerilen boyut: 5 ila 8 mm). Lamelin tüm yüzeyini kaplayacak kadar hidrojel parçası yerleştirin; Bu, parçaların yerinde sabitlenmesine yardımcı olacak ve görüntüleme sırasında herhangi bir kaymayı önleyecektir. Sürüklenme sorunları olması durumunda, lamellerin poli-D-lizin ile önceden kaplanması avantajlı olabilir6.</li>
	<li>Tutucuyu objektifin üzerindeki mikroskop tablasına yerleştirin.</li>
	<li>Görüntü alımını, 6. adımda açıklandığı gibi yağa daldırma objektifine sahip bir Lazer Taramalı Konfokal Mikroskopta gerçekleştirin.</li>
</ol>
9. ImageJ'de Genleşme Faktörü (EF) hesaplaması
<ol>
	<li>Görüntüleme verilerini ücretsiz ImageJ yazılımında veya eşdeğerinde açın.</li>
	<li>Birden fazla kanal görüntüsü üzerinde çalışıyorsanız, kanalları bölün ve Görüntü Seç | Renk | Kanalları ayırın.</li>
	<li>Çekirdek çapını ölçmek için, Görüntü Seç'e tıklayarak bir eşik belirleyerek çekirdeğe karşılık gelen sinyali vurgulayın | Ayarla | Eşik.... Varsayılan açılır menüden görüntüye en uygun yöntemi seçin (örneğin, Otsu) ve çekirdeğin şekli arka plandan net bir şekilde kesilene kadar eşiği ayarlayın. NOT: Bir ayar tüm görüntülere veya her örneğe uymayabileceğinden, eşik ayarının her görüntü için ayarlanması gerekir.</li>
	<li>Seç'e tıklayarak Feret çapını belirlemek için ölçümü ayarlayın Analiz Et | Ölçümleri ayarlayın.... Menüden Feret çapını seçin ve gerekirse ondalık sayıyı ayarlayın.</li>
	<li>Görüntünün analizine başlamak için Analiz Et | Parçacıkların boyutunu ayarlamak için parçacıkları analiz edin; Çekirdek için 5-sonsuz μm² | Sonuçları görüntüle | Yöneticiye ekle | Kenarları ve Kaplamayı hariç tut. Analizi başlatın.</li>
	<li>Analiz başladığında, birden çok pencere görünecektir. Pencere sonuçlarında, Feret sütunundaki her bir çekirdeğin maksimum Feret çapını arayın. Ham verileri bir elektronik tabloya kopyalayıp yapıştırın ve önceden genişletilmiş ve genişletilmiş örnekler için ortalama çekirdek boyutunu hesaplayın. NOT: Her bir çekirdeğe karşılık gelen ilgi bölgelerinin (ROI'ler) çekirdeğin tüm çevresini takip ettiğinden emin olun.</li>
	<li>Genişleme faktörünü (EF) aşağıdaki gibi hesaplayın: EF = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67479/67479eq01.jpg" style="margin: auto;"> NOT: EF faktörü, numunenin ne kadar genişletildiğini belirler.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>MOE ile hücre içi sialillenmiş glikanları görselleştirmek için genleşme mikroskobu

<ol><li>De Souza, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+at+the+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Light microscopy at the limit.</a> Nat Cell Biol. 11 (Suppl 1), S22(2009).</li>
<li>Tam, J., Merino, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29+in+comparison+with+stimulated+emission+depletion+%28STED%29+and+other+imaging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) in comparison with stimulated emission depletion (STED) and other imaging methods.</a> J Neurochem. 135, 643-658 (2015).</li>
<li>Jeong, S., Widengren, J., Lee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+for+STED+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes for STED optical nanoscopy.</a> Nanomaterials. 12 (1), 21(2021).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543548(2015).</li>
<li>Kang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+with+a+thermally+adjustable+expansion+factor+using+thermoresponsive+biospecimen-hydrogel+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy with a thermally adjustable expansion factor using thermoresponsive biospecimen-hydrogel hybrids.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 13 (24), 2896228974(2021).</li>
<li>Sun, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click-ExM+enables+expansion+microscopy+for+all+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules.</a> Nat Methods. 18 (1), 107113(2020).</li>
<li>Dube, D., Bertozzi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+oligosaccharide+engineering+as+a+tool+for+glycobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolic oligosaccharide engineering as a tool for glycobiology.</a> Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 616625(2003).</li>
<li>Scache, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+azide+and+alkyne+tags+on+bioorthogonal+reporters+in+metabolic+labeling+of+sialylated+glycoconjugates%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Switching azide and alkyne tags on bioorthogonal reporters in metabolic labeling of sialylated glycoconjugates: a comparative study.</a> Sci Rep. 12 (1), 22129(2022).</li>
<li>Holst, S., Wuhrer, M., Rombouts, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+characteristics+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Glycosylation characteristics of colorectal cancer.</a> Adv Cancer Res. 126, 203256(2015).</li>
<li>Boyaval, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycomic+signature+of+stage+II+colorectal+cancer+and+its+association+with+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">N-Glycomic signature of stage II colorectal cancer and its association with the tumor microenvironment.</a> Mol Cell Proteomics. 20, 100057(2021).</li>
<li>Ferreira, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+glycosylation+in+gastric+and+colorectal+cancers%3A+Toward+cancer+detection+and+targeted+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein glycosylation in gastric and colorectal cancers: Toward cancer detection and targeted therapeutics.</a> Cancer Lett. 387, 32-45 (2017).</li>
<li>Jennings, M. P., Day, C. J., Atack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+bacteria+utilize+sialic+acid+during+interactions+with+the+host%3A+snip%2C+snatch%2C+dispatch%2C+match+and+attach%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">How bacteria utilize sialic acid during interactions with the host: snip, snatch, dispatch, match and attach.</a> Microbiology. 168 (3), 001157(2022).</li>
<li>Gilormini, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sequential+bioorthogonal+dual+strategy%3A+ManNAl+and+SiaNAl+as+distinct+tools+to+unravel+sialic+acid+metabolic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways.</a> Chem Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).</li>
<li>Vanbeselaere, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkynyl+monosaccharide+analogues+as+a+tool+for+evaluating+Golgi+glycosylation+efficiency%3A+application+to+Congenital+Disorders+of+Glycosylation+%28CDG%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Alkynyl monosaccharide analogues as a tool for evaluating Golgi glycosylation efficiency: application to Congenital Disorders of Glycosylation (CDG).</a> Chem Commun. 49 (96), 11293-11295 (2013).</li>
<li>Gilormini, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+glycomics+enrichment%3A+imaging+the+recycling+of+sialic+acid+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">Chemical glycomics enrichment: imaging the recycling of sialic acid in living cells.</a> J Inherit Metab Dis. 4 (3), 515523(2018).</li>
<li>Rigolot, V., Biot, C., Lion, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+view+your+biomolecule%2C+click+inside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">To view your biomolecule, click inside the cell.</a> Angew Chem. 60 (43), 2308423105(2021).</li>
<li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cysteine+S-glycosylation+induced+by+per-O-acetylated+unnatural+monosaccharides+during+metabolic+Glycan+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">Artificial cysteine S-glycosylation induced by per-O-acetylated unnatural monosaccharides during metabolic Glycan Labeling.</a> Angew Chem. 130 (7), 1835-1838 (2018).</li>
<li>Qin, K., Zhang, H., Zhao, Z., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+S-glyco-modification+through+an+elimination-addition+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Protein S-glyco-modification through an elimination-addition mechanism.</a> J Am Chem Soc. 142 (20), 9382-9388 (2020).</li>
<li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+Huisgen+cycloaddition+process%3A+Copper%28I%29-catalyzed+regioselective+%26%2334%3Bligation%26%2334%3B+of+azides+and+terminal+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">Stepwise Huisgen cycloaddition process: Copper(I)-catalyzed regioselective &#34;ligation&#34; of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem. 41 (14), 25962599(2002).</li>
<li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strain-promoted+%5B3+%2B+2%5D+azide%E2%88%92alkyne+cycloaddition+for+covalent+modification+of+biomolecules+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">A strain-promoted [3 + 2] azide−alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems.</a> J Am Chem Soc. 126 (46), 15046-15047 (2004).</li>
<li>Mbua, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-promoted+alkyne-azide+cycloadditions+%28SPAAC%29+reveal+new+features+of+glycoconjugate+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Strain-promoted alkyne-azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis.</a> ChemBioChem. 12 (12), 19121921(2011).</li>
<li>Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine+ligation%3A+Fast+bioconjugation+based+on+inverse-electron-demand+Diels-Alder+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Tetrazine ligation: Fast bioconjugation based on inverse-electron-demand Diels-Alder reactivity.</a> J Am Chem Soc. 130 (41), 1351813519(2008).</li>
<li>Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine-based+cycloadditions%3A+Application+to+pretargeted+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Tetrazine-based cycloadditions: Application to pretargeted live cell imaging.</a> Bioconjug Chem. 19 (12), 22972299(2008).</li>
<li>Bird, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+chemistry+and+its+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal chemistry and its applications.</a> Bioconjug Chem. 32 (12), 2457-2479 (2021).</li>
<li>Slade, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+CHO+secretome+using+mucin-type+O-linked+glycosylation+and+click-chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Identifying the CHO secretome using mucin-type O-linked glycosylation and click-chemistry.</a> J Proteome Res. 11 (12), 61756186(2012).</li>
<li>Gambarotto, D., Hamel, V., Guichard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+expansion+microscopy+%28U-ExM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM).</a> Methods Cell Biol. 161, 5781(2021).</li>
<li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+%28U-ExM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nat. Methods. 16, 71-74 (2019).</li>
<li>Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-catalyzed+azide-alkyne+click+chemistry+for+bioconjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation.</a> Curr Protoc Chem Biol. 3 (4), 153-162 (2011).</li>
<li>Santiago, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+swelling+behaviour+of+poly%28sodium+acrylate%29%2Fsepiolite+superabsorbent+composites+and+nanocomposites%5BTitle%5D)+AND+%22Polym+Int%22%5BJournal%5D)">Synthesis and swelling behaviour of poly(sodium acrylate)/sepiolite superabsorbent composites and nanocomposites.</a> Polym Int. 55 (8), 843848(2006).</li>
<li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+direct+grafting+strategies+via+trivalent+anchoring+for+enabling+lipid+membrane+and+cytoskeleton+staining+in+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy.</a> ACS Nano. 14 (7), 78607867(2020).</li>
<li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+progress+in+expansion+microscopy%3A+Chemical+strategies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Current progress in expansion microscopy: Chemical strategies and applications.</a> Chem Rev. 123 (6), 32993323(2023).</li>
<li>Drelich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+high+spatially+resolved+proteomics+using+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Toward high spatially resolved proteomics using expansion microscopy.</a> Anal Chem. 93 (36), 12195-12203 (2021).</li>
<li>Zwettler, F. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+resolution+imaging+by+post-labeling+expansion+single-molecule+localization+microscopy+%28Ex-SMLM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM).</a> Nat Commun. 11 (1), 3388(2020).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+with+multifunctional+polymer+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy with multifunctional polymer dots.</a> Adv Mater. 33 (25), 2007854(2021).</li>
<li>Klimas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnify+is+a+universal+molecular+anchoring+strategy+for+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy.</a> Nat Biotechnol. 41 (6), 858869(2023).</li>
</ol>

Mevcut CuAAC etiketleme protokolü, reaksiyon tamponunda aminoguanidin içermez. Hücre içi glikokonjugatların görselleştirilmesi amaçlandığından, herhangi bir sitotoksisite sorununu önlemek ve katalitik sistemin alımını iyileştirmek için metabolik birleştirme adımından sonra sabitlenen hücreler üzerinde gerçekleştirilir. Aminoguanidin kullanımı tipik olarak, dehidroaskorbat ile proteinlerin arginin, histidin ve lizin kalıntıları arasındaki yan reaksiyonları önlemek için canlı hücrelerin hücre yüzeyi etiketlemesi için öneri...

Floresan mikroskobu, hücreler içindeki belirli molekülleri etiketlemek ve görselleştirmek için yaygın olarak kullanılırken, yaklaşık 200-250 nm'den daha yakın nesneler arasında ayrım yapma yeteneğini kısıtlayan Abbe'nin ışıkkırınım sınırı 1 ile doğal olarak çözünürlükte sınırlıdır. Bu sınırlama, ışığın dalga doğasından ve mikroskobun objektif merceğinin sayısal açıklığından kaynaklanır ve hücre altı yapıları görüntülerken bir zorluk ortaya çıkarır. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek, nanometrik ölçekte belirli biyolojik süreçler hakkında daha iyi bilgiler sağlar.
Işığın kırınım sınırını aşmak için STORM (Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskobu) ve STED (Uyarılmış Emisyon Tükenmesi) gibi süper çözünürlüklü mikroskopi teknikleri geliştirilmiştir 2,3. STORM, floroforların stokastik aktivasyonuna dayanır ve herhangi bir zamanda yalnızca seyrek bir alt kümenin görüntülenmesine izin verir. Bu, yüksek çözünürlüklü bir görüntünün yeniden yapılandırılmasına izin veren tek tek floroforların hassas bir şekilde lokalizasyonunu sağlar. Öte yandan STED, uyarma noktasının çevresi etrafındaki floresansı seçici olarak söndürmek için bir tükenme lazeri kullanarak çözünürlüğü iyileştirir ve nokta yayılma işlevini etkili bir şekilde daraltır.
Bu yaklaşımlar, tüm floroforların aynı anda algılandığı geniş alan veya konfokal mikroskopi ile kontrast oluşturur, bu da tüm kırınım modellerini birleştiren ve yakındaki bireysel floroforlar arasındaki ayrımı önleyen ve çözünürlük kaybına yol açan bir görüntü ile sonuçlanır. Bununla birlikte, bu süper çözünürlüklü yöntemler çok özel ışık kaynakları, ekipman, numune hazırlama ve/veya floroforlar gerektirir, bu da bu teknolojileri maliyetli, çoğu laboratuvarda erişilmesi zor ve rutin deneylerde uygulanması zor hale getirir. Bu kısıtlamalar, bilim camiasının, hazır mikroskopi ekipmanı ve rutin boyama protokolleri ile uyumlu olacak daha yüksek çözünürlük elde etmek için alternatif çözümler aramasına yol açmıştır. 2015 yılında, numuneyi fiziksel olarak genişleterek optik mikroskopinin sınırlamalarını aşmak için Boyden ve meslektaşları tarafından Genişleme Mikroskobu (ExM) 4 adı verilen bir yöntem geliştirildi.
ExM, ışığın kırınım sınırını aşmadan biyolojik numunelerin nano ölçekli ayrıntılarını sağlayan üç aşamalı bir yöntemdir (Şekil 1). Bunun yerine, izotropik bir şekilde fiziksel olarak büyütülmüş numuneleri görüntülemek için geleneksel kırınım sınırlı mikroskoplar kullanır. Jelleşme adı verilen ilk adım, biyolojik numunenin, tipik olarak sabit hücrelerin veya dokuların, sodyum akrilat ve akrilamid bazlı şişebilir bir polielektrolit hidrojel içine gömülmesinden oluşur. Biyolojik numune daha sonra proteinler veya zarlar gibi belirli bileşenleri kısmen parçalamak ve hücrelerin düzgün bir şekilde genişleyebilmesini sağlamak için yoğun hücresel yapıları parçalamak için enzimatik işleme tabi tutulur. Parçalama adı verilen bu adım, numunenin yapısal bileşenlerini mekanik özelliklere göre homojenize ederek ve numunenin bozulmasına yol açabilecek diferansiyel genleşmeyi önleyerek bunu başarmaya yardımcı olur. Son olarak, genleşme adı verilen son adımda, hidrojel ile gömülmüş ve sindirilmiş numune, deiyonize suya yerleştirilerek şişmesi sağlanır. Bu teknoloji, numunenin her boyutta yaklaşık 4-5 kat doğrusal bir büyütme faktörü ile genişlemesine neden olur ve standart mikroskopi teknikleri kullanılarak ince hücresel ayrıntıların görselleştirilmesine olanak tanır. Genleşmenin izotropik doğası göz önüne alındığında, jel matrisi içinde büyütülen biyolojik numune, üç boyutlu geometrik ayrıntılarını ve çeşitli yapısal bileşenleri arasındaki uzamsal ilişkileri korur. Bu nedenle, uzamsal bilgi şişme üzerine korunurken, jel bağlantılı floresan etiketler veya biyomoleküller arasındaki mesafe her yöne eşit şekilde artar. Bu, sinyallerin daha iyi ayrılmasını sağlayarak gelişmiş çözünürlük sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67479/67479fig01.jpg"> 
Şekil 1: ExM Protokolüne Genel Bakış. (a) Jelleşme: Biyolojik numune sabitlenir ve şişirilebilir bir polielektrolit hidrojel içine gömülür. (b) Sindirim: Numunenin mekanik özellikleri, enzimler ve deterjanlar kullanılarak, aksi takdirde genleşmeyi kısıtlayacak ve bozulmalara neden olacak proteinleri ve lipit zarlarını parçalayarak homojenize edilir. (c) Genleşme: Hidrojel, deiyonize suya daldırılır ve izotropik olarak genişlemesine neden olur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67479/67479fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
ExM, 2015 yılından bu yana mekansal bilgilerin korunmasında önemli teknolojik gelişmeler gördü. Özellikle, biyomolekülleri doğrudan şişirilebilir hidrojel 5,6'ya kovalent olarak bağlamak için çeşitli moleküler ankrajlar tasarlanmıştır. Bu protokolde, bir akriloil grubunu glikoproteinler de dahil olmak üzere hücrenin proteinlerine biyokonjuge etmek için biyomoleküllerin serbest amin gruplarıyla (tipik olarak, lizin kalıntıları veya proteinlerin N-terminal pozisyonları) reaksiyona giren N-akriloksisüksinimid (NAS) kullandık. Bu akriloil grubu daha sonra jelleşme sırasında çapraz bağlama reaksiyonları yoluyla diğer monomerlerle reaksiyona girer ve bu biyomolekülleri doğrudan polimere bağlar.
ExM, Metabolik Oligosakkarit Mühendisliği (MOE) dahil olmak üzere çok çeşitli etiketleme yöntemleriyle uyumludur. MOE, biyoortogonal bir kimyasal tutamak7 ile donatılmış metabolik öncülerin analoglarını birleştirerek glikanların etiketlenmesini sağlayan güçlü bir araçtır. Kimyasal raportörler olarak bilinen bu analoglar, toksisiteye neden olmadan metabolik yollara entegre olur. MOE yaklaşımında, raportör monosakkaritler metabolik olarak aktive edilmiş nükleotid şekerlerine işlenir ve daha sonra yeni ortaya çıkan glikokonjugatlara aktarılır. Birincil odak noktamız, hücre-hücre etkileşimleri, bağışıklık regülasyonu ve gelişimindeki rolleri nedeniyle sağlık ve hastalık bağlamında çok önemli olan sialilasyon, özellikle hücre içi dinamikler ve sialillenmiş N-glikoproteinlerin kaçakçılığı olmak üzere sialilasyon çalışmasıdır. Anormal sialilasyon, kanser 8,9,10,11, bulaşıcı hastalıklar12 ve genetik bozukluklar 13,14,15 gibi hastalıklarda rol oynar ve bu da onu terapötik geliştirme ve biyobelirteç keşfi için önemli bir hedef haline getirir. Sialilasyonu anlamak, glikobiyoloji ve hastalık mekanizmalarına ilişkin içgörüleri geliştirir.
Sialilasyon, insanlarda en bol bulunan sialik asit olan N-asetilnöraminik asit (Neu5Ac) analogları ile veya Neu5Ac'nin metabolik bir öncüsü olan N-asetilmannozamin (ManNAc) analogları ile MOE kullanılarak incelenebilir ve biyoortogonal bir sap 8,16 taşır. ManNAc, sitozolde Neu5Ac'ye dönüştürülür, daha sonra çekirdekte sitididin-5'-monofosfo-N-nöraminik aside (CMP-Neu5Ac) aktive edilir. Bir nükleotid şekerine aktive edildikten sonra, Golgi aygıtındaki siail transferazlar, Neu5Ac birimlerini büyüyen glikan zincirlerinin terminal pozisyonlarına aktarır (Şekil 2). Doğal olmayan ManNAc türevlerinin metabolik olarak dahil edilmesinin ardından, etiketli sialillenmiş glikanlar, biyoortogonal tıklama kimyası yoluyla raportör tutamağına tamamlayıcı reaktif bir grup taşıyan bir florofora kovalent olarak bağlanabilir. Bu, glikokonjugatların in vivo veya ex vivo olarak doğrudan gözlemlenmesine izin verir.
Çoğu monosakkarit raportör için, pasif difüzyon yoluyla plazma zarını geçmek için perasetillenmiş bir form gereklidir. Bununla birlikte, hem perasetillenmiş hem de korunmasız raportörlerin sialilasyonu etkili bir şekilde araştırdığı gösterilmiştir16. Korunmasız sialilasyon raportörleri, Neu5Ac analogları için pinositoz ve ManNAc için henüz tanımlanmamış bir taşıyıcı olan aktif taşıma mekanizmaları ile hücrelere girebilirler. Korunmasız şekerler, karşılaştırılabilir etkiler elde etmek için daha yüksek bir konsantrasyon (tipik olarak 100-500 μM) gerektirirken, hücrenin içine girdikten sonra doğrudan sialik asit metabolik yoluna girebilirler. Buna karşılık, perasetillenmiş şekerlerin, metabolik olarak aktif hale gelmeden önce hücre içi spesifik olmayan esterazlar tarafından tamamen deasetillenmesi gerekir. Daha düşük konsantrasyonlarda (tipik olarak 10-50 μM) kullanılabilmelerine rağmen, eksik deasetilasyon, enzim aktivitesine müdahale edebilir veya kısmen asetillenmiş sialik asit analoglarının dahil edilmesine yol açabilir ve bu da potansiyel olarak aşağı akış analizini çarpıtabilir. Ek olarak, asetik asit salınımı pH'ı lokal olarak etkileyebilir ve potansiyel olarak hücresel işlevi etkileyebilir. Chen ve meslektaşları ayrıca, per-O-asetillenmiş şekerlerin, enzimatik olmayan bir mekanizma yoluyla proteinlerdeki serbest sistein kalıntıları ile reaksiyona girdiğini, hedef dışı birleşmeye ve spesifik olmayan sinyalin artmasına yol açtığını göstermiştir 17,18. Bu nedenle mevcut protokolde korumasız ManNAc muhabirleri istihdam ediyoruz.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67479/67479fig02.jpg"> 
Şekil 2: Sialik asitlerin metabolik oligosakkarit mühendisliği ve etiketlenmesi. UDP-GlcNAc, sitozoldeki GNE/MNK'nin UDP-GlcNAc 2-epimaz alanı tarafından ManNAc'ye dönüştürülür. ManNAc daha sonra ManNAc-6-fosfat oluşturmak için GNE/MNK'nin ManNAc 6-kinaz alanı ile sitozolde fosforile edilir. N-asetilnöraminat sentaz, ManNAc-6-P'nin fosfoenolpiruvat ile yoğunlaşmasını katalize ederek Neu5Ac-9-fosfat üretir ve daha sonra Neu5Ac elde etmek üzere sialik asit fosfataz ile fosforillenir. Neu5Ac ayrıca endositoz ve lizozomal geri dönüşüm8 yoluyla kurtarma yolu tarafından da sağlanabilir. Çekirdeğe taşındıktan sonra, CMP-sialik asit sentetaz tarafından CMP-Neu5Ac'ye dönüştürülür. Golgi aygıtında, CMP-NeuAc, sonunda hücre zarında eksprese edilen veya salgılanan, olgunlaşan glikokonjugatlar üzerindeki glikanların terminal pozisyonlarında bir Neu5Ac kısmı oluşturan sialiltransferazların substratıdır. Biyoortogonal bir tutamak taşıyan ManNAz kimyasal raportörleri, tanımlanamayan bir aktif taşıyıcı aracılığıyla hücreye nüfuz edebilir ve metabolik yola girebilir. Biyosentezden sonra glikanlara dahil edilen etiketli Neu5Az birimleri daha sonra bir floresan probun CuAAC aracılı konjugasyonu yoluyla etiketlenir. Kısaltmalar: NAc = N-asetil; UDP-GlcNAc = Üridin difosfat N-asetilglukozamin; ManNAc = N-asetilmannozamin; GNE = UDP-GlcNAc 2-epimeraz; MNK = ManNAc 6-kinaz; ManNAc-6-P = ManNAc-6-fosfat; NANS = N-asetilnöraminat sentaz; PEP = fosfoenolpiruvat; Neu5Ac = N-asetilnöraminik asit; Neu5Ac-9-P = Neu5Ac-9-fosfat; NANP = sialik asit fosfataz; CMP = sitidin-5"-monofosfat; CMAS = CMP-sialik asit sentetaz; ST'ler = sialiltransferazlar; ManNAz = N-azidoasetilmannozamin; Neu5Az = N-azidoasetilnöraminik asit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67479/67479fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Olası biyoortogonal reaksiyonlar arasında, ilgimizi Bakır katalizli Azide-Alkin Sikloilavesi (CuAAC)16,19 üzerine odakladık. Deneyimlerimize göre, CuAAC, sabit hücrelerde hücre içi glikanları etiketlemek için en iyi seçenektir. Bu reaksiyon iyi kurulmuş, biyoortogonal kimyada kapsamlı bir şekilde incelenmiştir ve karmaşık biyolojik ortamlarda kullanım için standartlaştırılmış, sağlam bir bilgi temeli ve optimize edilmiş protokoller sağlamıştır. Hızlı kinetiği gerçekten de yüksek reaksiyon verimliliği ve özgüllüğü sunar ve sentezlenmesi kolay, kararlı, canlı sistemlerde bulunmayan ve doğal biyomoleküllere karşı inert olan azid ve alkin gruplarını içerir, bu da onu bakır toksisitesinin bir sorun olmadığı sabit hücreli uygulamalar için ideal hale getirir. Suş destekli Alkin-Azid Siklo Ekleme (SPAAC)20,21, bakır toksisitesinden kaçınırken, hidrofobik tuzak nedeniyle hücre içi uygulamalar için daha yüksek arka plan sinyaline ve daha düşük sinyal-gürültü oranına yol açma eğiliminde olan daha yavaş kinetiklere ve daha hacimli problara sahipken, Ters Elektron Talebi Diels-Alder (IEDDA)22,23, hızlı ve bakır içermemesine rağmen, daha karmaşık prob sentezini içerir ve MOE uygulamalarında henüz tam olarak karakterize edilmemiş daha hacimli raportör grupları gerektirir. ExM yalnızca sabit hücreler gerektirdiğinden, CuAAC biyoortogonal etiketleme için sağlam ve verimli bir çözüm sunar.
Bu makale, metabolik etiketleme, biyoortogonal tıklama kimyası ve genleşme mikroskobunu birleştirerek hücrelerde hücre içi sialillenmiş glikoproteinlerin görselleştirilmesi için bir protokol sunmaktadır. Bu yazıda açıklanan deneysel prosedürlerde, kimyasal raportör olarak N-azidoasetilmannozamin (ManNAz) kullanıyoruz ve genişletme prosedüründen önce küçük organik floroforların CuAAC ligasyonu gerçekleştiriliyor. Glikoproteinler, jelleşme, sindirim ve genişlemeden önce NAS ile hidrojele bağlanır. Sialik asitlerin MOE etiketlemesi, burada cis-Golgi aparatında lokalize edilmiş bir fare anti-GM130 birincil antikoru ile örneklendiği gibi, ko-lokalizasyon değerlendirmesi için immünofloresan yaklaşımları ile ilişkilendirilebilir. Bu protokol, fizyolojik durumdaki hücrelere veya kimyasal işleme tabi tutulmuş hücrelere uygulanabilir. Bunu göstermek için, klorokin, hücreler içindeki glikoproteinlerin işlenmesini ve kaçakçılığını etkileyen lizozomal fonksiyonu inhibe etmek için kullanıldı. Nükleer boyama, yalnızca hücreleri lokalize etmek için değil, aynı zamanda ExM işleminin kalitesinin bir göstergesi olarak da bir dönüm noktası olarak kullanılır. Genişleme faktörü gerçekten de çekirdeğin genişleme öncesi (preExM) ve genişleme sonrası (postExM) boyutunun karşılaştırılmasıyla ölçülebilir.

<table><tbody><tr><td>(+) Sodyum L-askorbat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>12 kuyulu hücre kültürü plakası</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Akrilamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>Akrilik asit N-hidroksisüksinimit ester ve nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8060</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 alkin&nbsp;</td><td>Jena Biyobilim</td><td>CLK-1277-5</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 keçi anti-fare IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11003</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9913</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Akrilamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>BTTAA</td><td>Jena Biyobilim</td><td>CLK-067-100</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj tüpü 2 mL</td><td>EPPENDORF</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>Klorokin difosfat tuzu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>Konik tüp 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352097</td> kapak fişleri 12 mm #1 epredia CB00120RA120MNZ0 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kapak fişleri 32 mm #1</td><td>epredia CB00320RA140MNZ0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>DMEM yüksek glikoz ortamı&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>L0104-500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu (PBS)&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast 533T</td> <td>-</td><td></td> <td>Sağlıklı bireysel</td></tr><tr><td>FIJI ImageJ 2.9.0</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Jelatin</td><td>Bio-RAD</td><td>170-6537</td><td></td></tr><tr><td>Guanidin HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>50950</td><td></td></tr><tr><td>HeLa hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 10.2</td> <td>-</td> <td>K</td><td></td></tr> <tr><td>< alt > 2 < / alt >HPO< alt > 4< / alt ></td> <td>Euromedex</td><td>PB0447-B</td><td>Susuz</td></tr><tr><td>LSM 780 Konfokal Mikroskopi&nbsp;</td><td>Zeiss-MCF7</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>N-asetilmannozamin (ManNAc)</td> <td>BIOSYNTH</td><td>MA05269</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carlo Erba</td><td>479687</td><td></td></tr><tr><td>N-azidoasetilmannozamin (ManNAz)</td> <td>BIOSYNTH</td><td>MA46002</td><td></td></tr><tr><td>Objectif "Plan-Apochromat" 63x / 1,4 Yağ DIC M27</td><td>Zeiss</td><td>420782-9900-799&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) 10x</td><td>Euromedex</td><td>ET330</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2308'den</td><td>&nbsp; Tritirachium albümü</td></tr><tr><td>saflaştırılmış fare GM130 antikoru</td><td>BD Bioscience</td><td>610822</td><td>50 & g</td></tr><tr><td>Sodyum akrilat&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408220</td><td></td></tr><tr><td>T75 Şişe</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>tris Asetat EDTA (TAE) 10x</td><td>Euromedex</td><td>EU0202-B</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi</td><td>Dutscher</td><td>702630</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA 1x</td><td>Dutscher</td><td>L0930-100</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

click kimyası ve genleşme mikroskobu ile hücre İçi sialilasyonun görselleştirilmesi

Visualizing Intracellular Sialylation with Click Chemistry and Expansion Microscopy

Aşağıda, HeLa hücrelerinde (Şekil 3A) ve MCF7 hücrelerinde (Şekil 3B) sialile glikoproteinleri görselleştirmek için protokolün uygulanması, CQ tedavisi (protokol bölüm 2) ve immünofloresan ko-lokalizasyon boyaması (protokol adımı 5.3) atlanmıştır.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67479/67479fig03.jpg"> 
Şekil 3: ExM protokolün...

Click Kimyası ve Genleşme Mikroskobu ile Hücre İçi Sialilasyonun Görselleştirilmesi

Metabolic labeling techniques allow the incorporation of bioorthogonal reporters into glycans, enabling the targeted bioconjugation of molecular dyes ...

visualizing-intracellular-sialylation-with-click-chemistry-expansion

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Neisseria meningitidis (Nm), gram negatif bir insana özgü solunum patojen, insan α-aktinin bağlayabilirsiniz . Burada insan beyninin mikrovasküler endotel hücreleri (HBMECs) içine bakteriyel girmesinden sonra intraselüler α-aktinin bakterinin colocalisation görselleştirilmesi için bir protokol mevcut.

Görselleştirme ve Miktar hücre içi Etkileşimleri Neisseria meningitidis</emKonfokal Görüntüleme α-aktinin> ve İnsan

Adenovirüs parçacıklar doğal olmayan bir amino asit analog azidohomoalanine veya azido şeker içermesi için...

Bioorthogonal tıklayın Kimya ile Viral Yüzeylerin Kemoselektif Modifikasyonu

Bu videoda, floresan tespitine yardımcı olmak için uygun bir floresan etiketleme reaktifi ile türevlendirmeyi takiben yüksek performanslı sıvı kromatografisi, HPLC kullanarak sialik asitlerin, N-asetilnöraminik asit ve N-glikolilnöraminik asidin tespitini gösteriyoruz.

Ters Fazlı Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi: Fare Karaciğerinden İzole Edilen Floresan Etiketli ve Türetilmiş Sialik Asitlerin Kantitasyonu İçin Sağlam Bir Yöntem

Bu video, primer nöral kök ve progenitör hücrelerin yanı sıra nöronlardaki modifiye sialoglikoproteinlerin biyotinilasyonunu ve floresan etiketlemesini ve bunların floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilmesini göstermektedir.

Nöral Progenitör Hücrelerde ve Nöronlarda Sialoglikoproteinlerin İmmünofloresan Boyanması

Intravital mikroskopi canlı hayvanlarda çeşitli biyolojik süreçleri görüntüleme sağlayan güçlü bir araçtır. Bu yazıda, canlı farelerde tükürük bezlerinde bu salgılama granüller gibi alt-hücresel yapıların, dinamiklerini görüntüleme için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz.

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Arası hücresel iletişim içinde ve hücre dışında çeşitli fizyolojik aktiviteleri kontrol edilmesi için çok önemlidir. Bu kağıt tek hücre salgılarının uzay-zamansal yapısını ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır. Bunu başarmak için, bir multidisipliner bir yaklaşım canlı hücre görüntüleme ile algılama etiket içermeyen nanoplasmonic entegre olan kullanılır.

Tek Hücre Salgıları uzay-zamansal Görüntüleme için bir etiket içermeyen Tekniği

Sialik asit glycoconjugates içinde bulunan tipik bir yaşam ünitesi var. Moleküler ve hücresel etkileşimlerin bir bolluk ilgilenmektedir. Burada hücre yüzey sialik asit ifadesi N- acetylmannosamine türevleri ile metabolik glycoengineering kullanarak değiştirmek için bir yöntem mevcut.

Sialik asit Nkullanarak metabolik Glycoengineering-asil-Mannosamines modifiye

Bu protokol bırakmak Förster rezonans enerji transferi ve floresan mikroskopi Imaging ömür boyu göre SNARE proteinlerin karmaşık oluşumu nicel görselleştirme için yeni bir yöntem açıklanır.

Hücre içi SNARE mikroskobu Imaging Floresans ömür tarafından kaçakçılığı görüntülenmesi

Yağ asilasyonunun incelenmesinin hücresel protein etkileşimleri ve hastalıklarda önemli etkileri vardır. Burada sunulan, çeşitli hücre tiplerinde uygulanabilen ve nabız kovalama ve kütle spektrometrisi de dahil olmak üzere diğer tahlillerle birleştirilebilen yağlı asillenmiş proteinlerin tıklama kimyası tespitini geliştirmek için modifiye edilmiş bir protokoldür.

Click Kimya Kullanarak Yağ Asillenmiş Proteinlerin Tespiti için Alkinil Yağ Asidi Analoglarının Optimize Edilmiş Birleştirilmesi

Burada, 11 kata kadar genişleme için modifiye edilmiş, kapsamlı bir biyomolekül sınıfı dizisini koruyan ve çok çeşitli doku tipleriyle uyumlu olan genişleme mikroskobunun (ExM) yeni bir versiyonu olan Magnify sunulmaktadır. Konvansiyonel kırınım sınırlı mikroskoplar kullanılarak biyomoleküllerin nano ölçekli konfigürasyonunun sorgulanmasını sağlar.

11 Katlı Genişleme Mikroskobu ile Üniversal Moleküler Retansiyon

Bir sialidaz tedavisi kullanılarak izole edilmiş periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) de-sialillenmiş insan monosit türevli dendritik hücreler (mo-DC'ler) oluşturmak için benzersiz, kapsamlı bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, mo-DC'lerin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonunu değerlendirmek ve sialidaz tedavisinin mo-DC'lerin olgunlaşma seviyesini nasıl iyileştirdiğini değerlendirmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Farklı Sialillenmiş Fenotiplere Sahip Monosit Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Üretimi

Keşfedin: Metabolik etiketleme, tıklama kimyası ve genleşme mikroskobu kullanarak hücre içi sialilasyonu görselleştirme yöntemi. Bu protokol, süper çözünürlüklü ekipman gerektirmeden yüksek çözünürlüklü biyogörüntüleme sağlar.

Click Kimyası ve Genleşme Mikroskobu ile Hücre İçi Sialilasyonun Görselleştirilmesi

Daha fazla video keşfet