Harici yetişkin Drosophila yapılarının miktarının belirlenmesi için hızlı ve basit bir iş akışı

Laboratuvarımız, hücre içi pH dinamiklerinin hücresel davranışları nasıl modüle ettiğini anlamakla ilgilenmektedir. Kanserin ilerlemesine katkıda bulunan davranışlarla ilgileniyoruz çünkü çoğu kanserde hücre içi pH'ın arttığını biliyoruz. Bu görüntülerden elde edilen verileri ölçmek için çok fazla mikroskopi yapıyoruz ve protokoller geliştiriyoruz.

pH tarafından düzenlenen hücresel yollar ve süreçler hakkında daha fazla şey öğreniyoruz. Çoğu kanser hücresi dizisi daha yüksek hücre içi pH'a sahiptir ve birçoğu artmış otofaji seviyeleri gösterir, ancak bunun bağlantılı olduğunu bilmiyorduk. Son zamanlarda, genetik olarak normal hücrelerde daha yüksek hücre içi pH'ın otofajiyi artırmak için yeterli olduğunu gösterdik.

Laboratuvarımız, hücre içi pH veya PHI'nin bütün bir hayvan modelinde hücre davranışlarını nasıl düzenlediğini inceleyen birkaç laboratuvardan biridir. Artan PHI'nin artan hücre proliferasyonunu, invaziv hücre göçünü ve doku düzensizliğini teşvik ettiğini bulduk. Son zamanlarda, daha yüksek PHI'nin bir tür hücresel yamyamlık olan otofajiyi teşvik ettiğini bulduk.

SEM için numune hazırlamanın yüksek maliyeti ve karmaşıklığının yarattığı ve birçok laboratuvar için erişilebilirliğini sınırlayan boşluğu ele alıyoruz. San Jose Eyaletinde, SEM için kaynaklardan yoksunuz. Bu nedenle, pahalı ekipmanlara ihtiyaç duymadan yüksek çözünürlüklü görüntüleri yakalamamızı sağlayan daha erişilebilir ve uygun fiyatlı bir protokol geliştirdik.

Bu protokol, entomolojide kullanılan geleneksel teknikleri birleştirir ve taramalı elektron mikroskobuna uygun maliyetli ve kullanıcı dostu bir alternatif sunar. Sineğin farklı bölümlerinin veya farklı örneklerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini yakalamak için kolayca uyarlanabilir. Başlamak için, istenen drosophila türünü seçin ve sinek yemi içeren bir şişeye yerleştirin.

Sinekler büyüyene ve yetişkinler yakın olana kadar şişeyi 25 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, yetişkin sinekleri karbondioksit ile uyuşturun ve bir karbondioksit pedine yerleştirin. Bir mililitrelik serolojik pipetin konik ucuna uyacak şekilde bir kaz tüyünü keserek bir tüy sineği sıralayıcı hazırlayın.

Sinekleri bir tüyle sıralayın ve düz kanatlı bireyleri seçin. Ardından, 1.7 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne bir mililitre %70 etanol ekleyin. Seçilen sinekleri tüpe aktarın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin.

Özel bir nokta zımbası kullanarak. 65 pound arşiv kartı stoğundan küçük üçgen noktalar kesin. Ardından, her noktanın ucunu 90 derecelik bir açıyla bükmek için Dumont numaralı beş ince uçlu forseps kullanın.

Dumont beş numaralı ince uçlu forseps kullanarak sinekleri mikro santrifüj tüpünden çıkarın. Fazla etanolü çıkarmak için sinekleri tüy bırakmayan dokuyla nazikçe kurulayın. Her sineği sol tarafına, diseksiyon mikroskobu altında bir indeks kartına yerleştirin.

Bir transfer pipeti kullanarak, bir indeks kartında bir ila iki damla deri yapıştırıcısını bir ila iki damla deiyonize su ile karıştırın. Forseps ile geniş uçta hazırlanmış bir kart noktası alın ve az miktarda tutkal uygulamak için bükülmüş ucu tutkal su karışımına sürün. Kart noktasının bükülmüş ucunu, sineğin sağ karnının ön tarafına, iki ve üçüncü karın segmentlerinin etrafına uygulayın.

Tutkal kurumadan önce, sineği ön arka ekseni kart noktasının bükülmüş ucuna dik olacak şekilde ayarlayın. Kart noktasının geniş ucuna üç numaralı montaj pimini yerleştirin ve bir böcek sabitleme bloğuna sabitleyin. Her bir pimi veya pim sırasını karşılık gelen genotiple etiketleyin.

Noktaya monte edilmiş drosophila gözlerinin yüksek çözünürlüklü fotoğraflarını elde etmek için istifleme görüntüleme sistemini açın. Ardından, 77 milimetrelik bir lens adaptörü aracılığıyla 20x Apo mikroskop objektifine bağlı 70 ila 200 milimetre telefoto lensli bir DSLR kamera gövdesi kurun. Numunenin bir difüzör aracılığıyla bir flaşla aydınlatıldığından emin olun.

Bir StackShot denetleyicisi ve makro ray kullanarak kameranın Z konumunu kontrol edin. Noktaya monte edilmiş sineği evrensel sahne gimbal üzerine, göz merceğe bakacak şekilde konumlandırın. Optimum hizalama için forseps kullanarak baş pozisyonunu dikkatlice ayarlayın.

Kamerayı bir dizüstü bilgisayara bağlayın ve çekim ayarlarını yapın. Büyütmeyi 20x, deklanşör hızı, saniyenin 1/200'ü, diyafram açıklığı f/2.8 ve ISO 400'e ayarlayın. Ardından, elde edilen görüntü yığınını istediğiniz dosya klasörüne kaydetmek için konumu ayarlayın.

Şimdi, otomatik mesafe modunda StackShot kontrol ünitesindeki odak yığını ayarlarını yapın. Adım boyutunu beş mikrometreye ayarlayın ve odak yığınının başlangıç ve bitiş konumlarını ayarlayarak adım sayısını hesaplayın. Kamera otomatik çekim modundayken numuneyi canlı görüntü modunda görüntüleyin.

Rayı, numunenin en yakın kısmı odakta olacak şekilde hareket ettirin. Ardından, ilgilendiğiniz en uzak özelliğe gidin ve odağı ayarlayın. Kamerayı manuel çekim moduna geri döndürün ve StackShot kontrol ünitesinden görüntü alımını başlatın.

Görüntülemeden sonra, alınan görüntü dosyalarını referans alınan odak istifleme yazılımında açın. Yığınla'yı seçin, ardından yığınlanmış bir görüntü oluşturmak için tümünü veya Pmax'ı hizala ve yığ'ı seçin. Sonra tıklayın fileto ve son yığılmış görüntüyü bir tif dosyası olarak kaydetmek için çıktı görüntüsünü kaydedin.

İğneye takılmış drosophila gözlerini görüntüledikten sonra, gözün merkezlendiği ve yeterli aydınlatma ve minimum çevresel bulanıklık ile hizalandığı analiz için yığılmış görüntüyü seçin. 500 mikrometre ölçekli çubuk görüntüsünü Fiji yazılımında açın. Düz çizgi aracını kullanarak ölçek çubuğunun uzunluğunu ölçün.

500 mikrometreye karşılık gelen piksel mesafesini kaydetmek için Analiz Et ve Ölç'e tıklayın. Ardından, mikron başına pikselleri hesaplayın ve bunu piksel ölçümlerini mikrometre ölçümlerine dönüştürmek için kullanın. Yığılmış görüntü dosyasını Fiji'de açın.

Odak alanını büyütmek için araç çubuğundan büyüteç seçin. Ekranı göz ve çevresindeki kafa kütikülü ile doldurun. Ardından, araç çubuğundan serbest seçim aracını seçin ve en dıştaki ommatidia sırasını takip ederek retina alanını ana hatlarıyla belirtin.

Seçimin bir kısmını kaldırmak için seçenek düğmesini basılı tutun ve kaldırılacak pikselleri seçin. Seçime eklemek için seçenek ve shift düğmelerini basılı tutun ve eklenecek pikselleri seçin. Alanı hesaplamak için Analiz Et ve Ölç'ü seçin.

Yeni bir pencere alanı, ortalamayı, minimum ve maksimum parametreleri gösterecektir. Dokümantasyon ve piksellerden mikrometre ölçümlerine dönüştürme için verileri kopyalayıp bir elektronik tabloya yapıştırın. GMR-DNhe2 sineklerinde DNhe2'nin aşırı ekspresyonu, vahşi tip yetişkin sineklere kıyasla önemli ölçüde daha küçük yetişkin gözlerle sonuçlanmıştır.

GMR-DNhe2 sinekleri, yabani tip sineklere kıyasla göz bölgesinde %41 azalma ve GMRGAL4 heterozigot sineklere kıyasla %48 azalma göstermiştir. Atg1 aleli 3 için GMR-DNhe2 sinekleri heterozigotunda göz boyutu restore edildi ve 74.28 mikrometre kareden 129.9 mikrometre kareye getirildi.