Konak-Patojen Etkileşimlerinin İn Vitro Araştırılması için Organotipik Doku Model Sistemleri

Dental plat biyofilmleri, ağız epitelinde iltihaplanmaya neden olabilen ve diş eti iltihabı gibi hastalıklara yol açabilen yüzlerce mikroorganizmadan oluşur. Organotipik doku modellerini kullanarak bu etkileşimleri daha iyi anlamak istiyoruz. Bu sistemler, alternatif tedavi modalitelerinin kontrollü bir şekilde değerlendirilmesi için yararlı platformlar sağlar.

Bu nedenle, son yıllarda dizileme teknolojilerinin ilerlemesi, enfeksiyon biyolojisi alanını dönüştürüyor. Bu teknolojiler, proteomik, transkriptomik ve metabolomik düzeyde konak ve mikrobiyal imzaların değerlendirilmesi yoluyla çoklu OMIC teknikleri kullanarak konak patojen etkileşimlerini gerçekten araştırmamıza olanak tanır. Son araştırmamız, biyofilm ile ilişkili enfeksiyonlarda krallıklar arası ve polimikrobiyal etkileşimlerin önemini vurgulamıştır.

İn vitro model sistemlerin kullanımı sayesinde, RAM ve spektroskopi gibi yenilikçi teknolojileri kullanarak konak biyofilm etkileşimlerini araştırabildik, yeni anti-biyofilm terapötiklerini test edebildik ve mikrobiyal toplulukların profilini çıkarabildik. Bu organotipik doku modellerini kullanan gelecekteki çalışmalar, mikroorganizma ve konakçı doku ve kültürün birlikte multi-omic imzasını ve profilini çıkarmayı amaçlayacaktır. Biyofilm modellerimizde konakçı ile spesifik bakteri ve mantar türleri arasındaki karmaşık etkileşimleri ortaya çıkarmayı ve çözmeyi umuyoruz.

Başlamak için, streptokok türleri içeren gözenekli boncukların donmuş saplarını 80 santigrat dereceden çıkarın. Streptokok türlerini, %5 steril defibrine at kanı içeren Columbia kan burgu taban plakalarında canlandırın. Plakaları 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Ertesi gün, plakadan üç ila dört koloniyi 10 mililitre tripton soya suyu ortamına aktarın. Et suyunu 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 16 ila 18 saat boyunca kültürleyin. İnkübasyondan sonra, hücre süspansiyonlarını 20 santigrat derecede beş dakika boyunca 3.000 G'de santrifüjleyin.

Hücre peletlerini 10 mililitre steril PBS ile yıkayın. Peletleri 10 mililitre PBS'de yeniden süspanse edin ve 550 nanometreye ayarlanmış bir spektrofotometre kullanarak her bir streptokok türü süspansiyonunu ayrı ayrı standartlaştırın. Standardizasyonun ardından, Todd Hewitt suyu ve Roswell Park Memorial Institute ortamının bire bir karışımında mililitre başına yedi hücrenin gücüne bir kez 10 ila 10 konsantrasyona ulaşmak için her bir streptokok süspansiyonunu bir ila 10 seyreltin.

500 mikrolitre seyreltilmiş hücre süspansiyonunu, 13 milimetrelik bir hidroksiapatit disk içeren 24 oyuklu bir mikrotitre plakaya pipetleyin. Biyofilm oluşumuna izin vermek için kültürü 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 24 saat inkübe edin. Benzer şekilde,% 5 steril defibrine at kanı içeren titiz bir anaerobik burgu tabanı üzerinde anaerobik mikroorganizmalar için kültür.

Her anaerobik mikroorganizmayı belirli bir absorbansa standardize edin ve bunları Todd Hewitt suyu ve Roswell Park Memorial Institute ortamının bire bir karışımında seyreltin. Streptokok biyofilm olgunlaşmasından sonra, yapışmamış hücreleri ve kullanılmış ortamları kuyulardan dikkatlice çıkarın. Her bir oyuğa dört anaerobik mikroorganizmanın süspansiyonları olan mililitre başına yedi hücrenin gücüne 500 mikrolitre standartlaştırılmış bir çarpı 10 ekleyin.

Biyofilmleri 37 santigrat derecede anaerobik koşullar altında 24 saat inkübe edin. Ertesi gün, yapışmamış hücreleri ve kullanılmış ortamları kuyulardan çıkarın. 500 mikrolitre steril bire bir Todd Hewitt suyu ve Roswell Park Memorial Institute ortamı karışımı ekleyin.

Biyofilmleri 24 saat boyunca anaerobik koşullar altında kültürleyin. Yedinci günde, ko-kültür için biyofilmleri 500 mikrolitre steril PBS ile iki kez yıkayın. Başlamak için, insan oral epitelini veya HOE dokusunu ve ortamını kutusundan çıkarın ve ikinci sınıf bir güvenlik kabinine aktarın.

12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna doku ile birlikte verilen bakım ortamından bir mililitre ekleyin. Steril cımbız kullanarak, HOE dokusunu içeren polikarbonat ekleri besin burgusundan ve 24 kuyulu nakliye plakasından çıkarın. Dokuyu hazırlanan 12 oyuklu plakaya aktarın.

Doku modellerini laboratuvar koşullarına alıştırmak için 37 santigrat derecede 24 saat ve% 5 karbondioksit inkübe edin. Bu arada, hidroksiapatit disklerden biyofilmleri çıkarmak için, diskleri 24 oyuklu plakanın altından kaldırmak için 19 gauge iğne ve cımbız kullanın. Diskleri bir mililitre steril DPBS içeren bir bijou'ya aktarın.

Diskleri bir sonikasyon su banyosunda 10 dakika boyunca 35 kilohertz'de sonikasyon. İklimlendirmeden sonra, doku eklerini 12 oyuklu plakadan çıkarmak için cımbız kullanın. Biyofilm sonikat süspansiyonunun 100 mikrolitresini doğrudan doku modellerine pipetleyin.

Ekleri, bir mililitre taze bakım ortamı içeren başka bir 12 oyuklu plakaya aktarın. Doku modellerini 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 24 saat inkübe edin. Doku işleme için, iki mililitrelik vidalı kapaklı O-ring tüpünde% 1 ışın merkaptoetanol içeren 350 mikrolitre RLT-lizis tamponu hazırlayın.

Tüpe yaklaşık 100 mikrolitre 0,5 milimetre asitle yıkanmış cam boncuk ekleyin. Cımbız kullanarak, dokuyu içeren ekleri ortamdan çıkarın ve ek parçada kalan mikrobiyal süspansiyonu atın. Ek parçayı göz hizasında ters çevirin, ardından dokuyu ve zarı ek parçanın altından dikkatlice dilimlemek için 19 gauge bir iğne kullanın.

Doku ve zarı hazırlanan RLT tamponuna aktarın. Tezgah üstü boncuk boncuk homojenizatörü kullanarak dokuyu 30 saniye homojenize edin. Üreticinin RNA ekstraksiyon kitini izleyerek elde edilen lizattan RNA'yı çıkarın.

Düşük ve yüksek verimli metodolojileri kullanarak proteomik analizler için kalan kullanılmış doku ortamını toplayın. HOE dokusundaki inflamatuar biyobelirteçlerin gen ekspresyonu, uyarılmamış kontrole kıyasla biyofilm sonikata maruz kaldıktan sonra önemli ölçüde yukarı regüle edildi. En büyük kat değişiklikleri CCL2, CXCL1 ve CSF3 için gözlendi.

HOE dokusundaki IL8 mRNA ekspresyonu, kontrollü dokuya kıyasla biyofilm sonikat ile stimülasyonu takiben 8.67 kat artmıştır. Harcanan ortamdaki IL8 protein seviyeleri, kontrol dokusunda mililitre başına 1.005 nanogramdan, biyofilm sonikat ile uyarılmış dokuda mililitre başına 4.245 nanograma yükseltildi.