Name: Gen Tabancası İşaretleri ve Dilim Kültür Nöronlar Biyolistik Transfeksiyon hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 42 s
Description: Öğrenin, hipokampal dilim kültürlerindeki nöronları biyolistik transfeksiyonla hedeflemek için DNA kaplı altın mermilerin hazırlanması. Bu yöntem, bireysel nöronların temiz bir arka plan üzerinde görselleştirilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Mark Lucanic ve Hwai-Jong Cheng, bu video sunulan tüm hipokampal dilim düşük büyütme görüntüleri almak yardım için teşekkür etmek istiyorum. Biz Sarah Parrish de eşlik eden metin, video ile yardım için teşekkür etmek istiyorum.

Biyolistik Transfeksiyon İÇİN PROTOKOL Mermi yapma Bullets 6 aya kadar iyi, ama 2-3 ay sonra transfeksiyon verimliliği azalmaya başlayabilir. Bullets Dessicant pelet varlığında 4 ° C&#39;de muhafaza edilmelidir. Flakon açılmadan önce oda sıcaklığına mermi depolandığı sintilasyon şişeleri, her zaman izin verin. Başlamadan önce hazır olması: <ul><li> Spermidin (0.05M) </li><li> CaCl 2 (1M) </li><li> EtOH (% 100 yüksek dereceli açılmamış şişe) </li><li> Otoklavlı H 2 0 </li><li> Transfekte olarak DNA </li><li> Polyvinylpyrrolidone (PVP-20 mg / ml stok) </li><li> 2 X 15 ml konik (2/bullet set) </li><li> Boru (1 oyulmuş X ~ 30 inç / bullet seti) </li><li> Sintilasyon şişeleri (1/bullet seti) </li><li> Kuruma pelet </li><li> 10 ml şırınga w / ucunda boru </li></ul> Tüp hazırlayın: <ol><li> Kuru ~ tüp istasyonu w / N 2 gaz (0.4 basıncı) en az 20 dakika bir tüp 30 inç (yaklaşık 2 inç sağ O-halka ötesine uzanan) . </li></ol> Altın boncuk DNA çökeltisi: <ol><li> Mikrosantrifüj tüp içinde 50 μmL toplam hacmi (maksimum 50 mg toplam DNA) transfekte DNA hazırlayın </li><li> 6-8 mg altın tartmak ve bir mikrosantrifüj tüpe transfer </li><li> Altın 0.05M spermidin 100 mcL ekleyin ve 20 saniye boyunca sonikasyon </li><li> Altın / spermidin DNA&#39;nın 50 mcL ekleyin </li><li> Vortex (yaklaşık 5 ayar) w / kapağı açık </li><li> 1M CaCl 2 bilge 100 mcL bırakın . </li><li> Sonikasyon kısa süreli (&lt;5 sn) </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika çökelti izin ver </li><li> Kısaca sonikasyon </li></ol> Sonication sırasında PVP çözüm hazırlayın: <ol><li> (3,5 ml% 100 EtOH 7.5 20mg/ml PVP stokunun mcL ekleyin) mermi her set için 15 ml konik, 3.5mL seyreltik PVP PVP çözümü sulandırmak olun </li></ol> EtOH altın boncuk Durulama: <ol><li> Mikrosantrifüj 10 sn tam hızda altın boncuk Spin </li><li> Süpernatant atın, ama altın boncuk üstüne küçük bir miktar sıvı tutmak </li><li> Gerekirse 1ml EtOH 3X yıkayın, kısaca her zaman sonikasyon </li></ol> Süspanse edin PVP çözüm altın / DNA: <ol><li> 200 mcL 3,5 ml seyreltik PVP / EtOH çözüm altın pelletini tekrar </li><li> Vortex tekrar süspansiyon için altın pelet (gerekirse kısaca sonikasyon) </li><li> Yeni bir 15 ml konik, altın / PVP çözüm 200 mcL transfer </li><li> Tüm altın, 15 ml konik devredilmiştir kadar bir defada 200 mcL PVP ekleyerek, bu şekilde devam edin ve son hacmi 3.2 mL </li></ol> Kaplama tüp: <ol><li> N 2 tüp istasyonu kapatın ve kuru tüp kaldırmak </li><li> 10 ml şırınga kuru boru takın </li><li> Gayretle 15 ml konik altın / PVP ile dolu sallamak </li><li> Altın / PVP çözüm boru sonuna yerleştirin ve kabarcıkları önlemek için yavaş yavaş olmak dikkatli emmek </li><li> ~ 2 inç boru iki ucunda kuru bırakın </li><li> Boru hala şırınga bağlı ve altın / PVP çözümü ile dolu, tüp geri istasyonu içine dikkatlice yerleştirin </li><li> Mark çözüm oturur boru ucu </li><li> Altın şırınga bağlı 5 dakika dinlendiriniz </li><li> Yerleşik altın (arka yıkamak için değil emin olun) geride bırakmış, böylece şırınga çekerek çok yavaş çözüm Suck </li><li> Şırınga çıkarın </li><li> 90 ° Döndür ve 2 saniye bekletin </li><li> 180 ° döndürün ve bir 2 saniye bekletin </li><li> 5 saniye için tüp Döndür </li><li> N 2 valf 0.4 arasında okur böylece açın - 0.5 ve 5 dakika boyunca kuruma ise altın kaplamalı boru spin. </li></ol> Tüp Kesme: <ol><li> Boru boru hazırlık istasyonu çıkarın ve işaretleri biter kesti. </li><li> Etiketli bir sintilasyon flakon koyun kesme kartuşları yakalamak için boru kıyıcı altında </li><li> Tüp kıyıcı boru ve tüp temiz ustura ile kesmek </li><li> Sintilasyon flakon bir kuruma pelet yerleştirin. </li><li> 4 Mağaza kartuşları ° C </li></ol> Atıcılık Doku Dilimleri Kültürlü dilim çekerken, kontaminasyonu önlemek için nispeten steril bir teknik istihdam için çok önemlidir. Mermi iki farklı yapıları çekim yaparken, her iki seti de aynı kartuş tutucu içine yüklenmiş olabilir, ancak namlu-liner ve ekran yapıları arasında değiştirilmesi gerektiğini unutmayın. Başlamadan önce hazır olması: <ul><li> DNA mermi (açmadan önce oda sıcaklığına kadar sintilasyon flakon sıcak izin) </li><li> Doku dilimleri </li><li> Gen Tabancası Helios </li><li> Gen tabancası hortumu ile Helyum tankı bağlı &lt;/ P&gt; <li> Kartuş tutucu </li><li> Yerinde plastik Namlu liner O-ring </li><li> Difüzör (modifiye) </li><li> Difüzör Ekran </li><li> Forseps </li></ul> Hazırlayıcı gen tabancası: <ol><li> Kullanarak forseps kartuş tutucu içine altın kaplamalı plastik kartuşlarda yerleştirin. </li><li> Kartuşu tutucu kilit ilk geri iterek, gen tabancasının içine yerleştirin </li><li> Kilidi ile kartuş tutucu Güvenli </li><li> O-ring ve güvenli bir yerde difüzör ekran ile bir varil liner edinin </li><li> Gen tabancasının içine varil-liner Vida </li></ol> Gen tabancası ile kültür dilim Çekim: <ol><li> Kulak manşonlar koyun </li><li> Hortum bağlı helyum gazı tankı içine gen tabancası Tak </li><li> 180 PSI tankı üzerinde baskı </li><li> Difüzör ekranı herhangi bir toz veya enkaz kaldırmak için havaya bir boş vur. Silahı ateşlemek için, ilk tetiği çekin, sonra silah sesi çıkarıncaya kadar güvenlik kilidi düğmesini bastırın. </li><li> Boş Çekimden sonra, inkübatör dilim kaldırmak </li><li> Avans tabancası ilk inşa etmek </li><li> Yaklaşık 0.5 difüzör ekranı ile çekim dilim 1 inç </li><li> Advance kartuş kuyuları arasında. </li><li> Son iyi Çekimden sonra, kuvöz içine dilimlerini </li><li> Helyum hortum tabancası ayrılmakta önce gaz ve serbest basınç kapatın </li><li> Sökün varil liner ve kartuşunu çıkarın ve kullanılan kabuklar </li></ol> Temizleme kartuşu sahipleri ve varil gömlekleri: <ol><li> Yeri kartuşları, varil gömlekleri ve sabunlu su ile beher difüzör ekranları </li><li> 20 dakika banyo sonikatör ve sonikasyon yerleştirin beher </li><li> Tüm sabun artıkları kaldırılana kadar iyice su ile durulayın </li><li> Bir saat için% 70 EtOH yıkayınız </li><li> Kuruması için kuru kağıt havlu üzerine koyun bir gecede </li><li> Temizlik kartuşları, varil gömlekleri, ve ekranlar sonra sonraki Biyolistik transfections yeniden </li></ol> Biyolistik Transfeksiyon Sorun giderme ipuçları Biyolistik transfeksiyon bazen suboptimal transfeksiyon koşulları neden olabilir. Bu çok az ya da çok fazla hücre transfekte çok yüksek veya çok düşük ekspresyon düzeyleri yol açabilir, ya da genel olarak sağlıksız hale doku dilim neden olabilir. Genellikle sağlıksız dilimleri sonucu basınç patlama. Optimal transfekte doku dilimler elde etmek için bazı ipuçları bulunmaktadır. : Dilim (ya da çok fazla hücre / dilim transfekte varsa) deneyin sağlıksız görünüyorsa <ul><li> artan çekim mesafesi </li><li> azalan basınç gaz tankeri </li><li> altın miktarını azaltarak </li><li> Bio-Rad difüzör merkezi kesme ve difüzör ekranı ile merkezi yerine. </li></ul> Eğer çok az hücreler transfekte deneyin: <ul><li> çekim mesafesi azalan </li><li> gaz tankeri giderek artan bir baskı </li><li> altın miktarını artırarak </li><li> / iyi doku dilim sayısını artırarak </li><li> O-ring varil-liner sağlam olduğundan emin olun. </li></ul> Emin olun aynı çekim sırasında transfekte hem de çok sayıda ve çok az sayıda hücre ile dilimleri alırsanız: <ul><li> simetrik yukarıda silah tutan </li><li> bu altın eşit boru iç kaplama. (Altın bir çizgi alıyorsanız, altın yerine bir kez daha hızlı bir oranda tüp süpernatantı çizmek ve azot açmadan önce altın uzun döndürmek Öte yandan, altın şeritli, Bu muhtemelen mermi yapımı sırasında çok fazla nem maruz kalma nedeniyle boru kaplama önce iyice kurulayın ve kapakları kapaklama) zamanında mermi hazırlanıyor, EtOH açılmamış bir şişe kullanarak emin olun. </li></ul> Transfeksiyon verimliliği en iyi görünüyorsa (# hücreleri / dilim transfekte), ancak ifade seviyesi çok yüksek veya çok düşük görünüyor: <ul><li> altın oran DNA ayarlayın. (Çok düşük ise, örneğin, altın miktarı korumak, ancak DNA miktarını artırmak.) </li><li> çekim ve veri toplama arasındaki süreyi ayarlamak </li></ul> Yapıları çok az ifade alıyorsanız, çift transfeksiyon durumunda, emin olmak amacıyla, iki yapıları oranı uygun şekilde ayarlayın ve hem de yapıları aynı organizatörü altında olduğundan emin olun bir organizatörü dışı rekabet olmaz.

<ol><li>Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+foreign+genes+into+intact+maize+cells+with+high-velocity+microprojectiles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).</li>
<li>Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+biolistic+transfection+of+brain+slices+and+dissociated+cultured+neurons+with+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).</li>
<li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+STKE%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neurons.</a> Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
</ol>

Biyolistik transfeksiyon transfecting hücreleri canlı doku yüksek hız DNA kaplı altın parçacıkları ile bombardımanı ile fiziksel bir araçtır. Mermi çekirdeğinde dinlenmek için geldiğinde parçacık aracılı gen transferi, genel transfekte hücreler neden. Birçok farklı Transfeksiyonu yöntemleri var iken, mikroenjeksiyon, lipofection, kalsiyum-fosfat transfeksiyon, elektroporasyon ve viral transfeksiyon gibi, Biyolistik transfeksiyon, bu diğer yöntemleri kullanarak kolayca transfekte değil hücreler transfecting için yoğun daha az emek, ve verimli bir alternatif sunabilir. Aslında, hücre duvarının varlığı, önceden var olan yöntemleri 1 transfeksiyon zorlaştırdı beri ilk bitkilerde gen transferi için bir teknik olarak geliştirilmiştir . Benzer şekilde, post-mitotik nöronlar 2,3 transfect herkesin bildiği gibi zor olduğundan biolistics nörobiyoloji alanında popülerlik kazanmıştır. Özellikle, ince bozulmamış beyin dilimleri tek nöronların morfolojisi değerlendirilmesini amaçlayan deneylerde kullanılmak üzere ilkesine tekniği yaygın olarak kabul edilmektedir. Burada açıklanan yöntemler, gen tabancası düzenlenen bir elin (Bio-Rad Helios Gen Tabancası sistemi) kullanarak kültürlü beyin dilim Biyolistik transfeksiyon nasıl gerçekleştirileceğine ilişkin detaylı ve kapsamlı bir açıklama sağlamak. Seyrek, beyin dilim boyunca hücrelerinin sayısı transfeksiyon sağlar çünkü Biyolistik transfeksiyon dilim kültüründe nöronlar transfecting için tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir. Bu şekilde, bireysel nöronlar izolasyon incelenebilir. Bu tekniğin özellikle de beyin dilim nöronlar transfecting için uygun olduğundan, genellikle ışık saçılması doku 4 içinde derin floresan işaretli hücrelerin foton 2-eksitasyon sağlar görselleştirme bu yana, 2-foton mikroskobu ile birlikte kullanılır . Aslında bu video boyunca sunulan tek piramidal nöronlar yüksek büyütme görüntüleri özel bir dahili 2-foton lazer tarama mikroskobu kullanılarak ele geçirildi. Sonuç Biyolistik transfeksiyon çevreleyen hücreler yüksek yoğunluklu kapsamında tek tek hücrelerin transfecting etkin bir araçtır ve floresan nöronal dilim kültüründe bireysel nöronlar etiketleme gibi son derece yararlı olduğunu kanıtlamıştır.

Biz tüm ürünler ayrı ayrı listelenmiş olmasına rağmen, Bio-Rad (kedi # 165-2431) Yukarıda listelenen tüm ürünler içerir &quot;Helios Gen-Gun Sistemi&quot; satın almak için daha ekonomiktir.

gen tabancası İşaretleri ve dilim kültür nöronlar biyolistik transfeksiyon hazırlanması

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Biyolistik transfeksiyon yüksek hız DNA kaplı parçacıkları ile bombardıman doku hücreleri transfecting fiziksel bir araçtır. Biz DNA kaplamalı mermi ilk hazırlık Organotipik dilim kültürlerin bir gen tabancası kullanarak nihai çekim, rat hipokampal dilim Biyolistik transfeksiyon için ayrıntılı bir protokol sağlar. Gen tabancası transfeksiyon nöronlar transfecting verimli ve kolay bir yoludur ve floresan hücrelerin doku dilim küçük bir alt etiketlenmesi için özellikle yararlıdır. Bu video ilk DNA ile kat altın parçacıkları için gerekli adımları özetlemektedir. Gelecek, plastik boru içine altın / DNA mermilerle hattına nasıl göstermek, gen tabancasının içine yüklemek için plastik kartuşları elde etmek için bu boru kesmek için nasıl. Son olarak, Bio-Rad taşıma gösteren gen tabancası Helios ve sorun giderme danışma hizmeti sunan sağlıklı ve optimal transfekte bir doku dilimler elde etmek için, sıçan hipokampal dilim kültürlerin Biyolistik transfeksiyon gerçekleştirmek.

Biz DNA kaplı altın mermi hazırlanması için bir metodu tanımlar ve biolistically kültürlü hipokampal dilim nöronlar transfect gibi mermi kullanımını göstermek.

Gen Tabancası İşaretleri ve Dilim Kültür Nöronlar Biyolistik Transfeksiyon hazırlanması

Biyolistik transfeksiyon, dokuların yüksek hızda DNA kaplı parçacıklarla bombalanması yoluyla hücrelere transfeksiyon yapmanın fiziksel bir yoludur. Ayrıntılı bir ...

Biyotik veya gen tabancası transfeksiyonu, dokunun yüksek hızlı DNA kaplı parçacıklarla bombalanması yoluyla hücrelere transfeksiyon yapmanın fiziksel bir yoludur. Bu teknik, nöronların transfeksiyona tabi tutulması için etkili ve kolay bir yöntemdir ve özellikle doku kesitindeki az sayıda hücrenin transfekte edilmesi için kullanışlıdır. Örneğin, floresan mikroskobisi ile sağlam bir kesitte nöronal morfolojiyi incelemeyi amaçlayan çalışmalarda tercih edilir.Bic transfeksiyonu, transfekte edilmemiş hücrelerin oluşturduğu temiz bir arka plan üzerinde bireysel nöronların görselleştirilmesini kolaylaştırır. Bu videoda, DNA kaplı gen tabancası mermilerinin hazırlanması ve ardından organotipik hipokampal dilim kültürlerinde Bic transfeksiyonunun uygulanması yöntemini gösteriyoruz. Merhaba, ben Georgia Woods.California Üniversitesi Davis'teki Dr. Karen Zito'nun laboratuvarında lisansüstü öğrencisiyim. Bugün, DNA kaplı mermilerle nasıl hazırlanacağını ve sıçan hipokampal dilimlerinde Bic transfeksiyonunun nasıl gerçekleştirileceğini göstereceğim. Bic transfeksiyonunun temel adımları şunlardır: birincisi, altın partiküllerin transfekte edilecek DNA ile kaplanması, ikincisi, plastik tüpün iç kısmının bu altınlarla kaplanması, üçüncüsü.Tüpleri gen tabancasına yüklemek için kartuşlar şeklinde kesin ve ardından transfekte edilecek dokuya ateşleyin. Hadi başlayalım. Transfeksiyon için hazır olmadan önce, öncelikle DNA kaplı mermileri hazırlamamız gerekir.Bu işlem, transfekte edilecek DNA plazmidi ile 1,6 mikronluk altın partiküllerin kaplanmasını gerektirecektir. Atış sırasında, tek bir altın partikül, hücreye nüfuz ederek transfeksiyona yol açacak olan mermi görevi görecektir. Bu nedenle öncelikle, transfekte edilecek DNA'yı hazırlamamız gerekir.İdeal olarak, 50 µL toplam su hacmindeki bir mermi seti için 50 µg'dan daha az DNA kullanmanız istenir. Kullanılacak kesin DNA miktarının, optimum ekspresyon düzeyini elde etmek için her bir konstrükt için deneysel olarak belirlenmesi gerektiğini unutmayın. DNA alikotumuz hazır olduğuna göre, şimdi altın boncuklara spermidin eklememiz gerekiyor.Önceden tartılmış 8 mg altın üzerine, 100 µL sperm ekleyin ve yaklaşık 20 saniye boyunca sonikasyon uygulayın. Bu işlem sperm içindir.Meine, altın uçları pozitif yükleyerek negatif yüklü DNA'nın pozitif yüklü metalle etkileşime girmesini sağlayan bir poliamindir. 22. saniyeden sonra, altına 50 µL DNA su çözeltisini ekleyin. DNA boncuklara eklendikten sonra, 100 µL kalsiyum klorürü damla damla eklerken vorteksleyin; kalsiyum klorür, DNA'nın çökelmesine neden olur.Kısa bir vorteksleme işleminin ardından, çözeltinin 10 dakika boyunca çökelmesini bekleyin. 10 dakikalık çökelme süresinin ardından, DNA ve altını bir masaüstü santrifüjle 30 saniye boyunca tam hızda döndürün. 32. yüksek hızdaki döndürme işleminin ardından, altın peletini çekmemeye dikkat ederek süpernatantın büyük kısmını pipetle alın. Bu aşamada, altın üzerinde çökelmemiş olan tüm DNA'yı uzaklaştırıyorum.Altın partiküller daha sonra 1 mL taze etanol ile yıkanır ve kısa süreliğine sonikasyona tabi tutulur. DNA çöktüğünde, altının kümelenmesine neden olma eğilimindedir. Hafif bir sonikasyon bu altın kümelerini parçalar. Ancak, aşırı sonikasyon yaparak DNA'yı parçalamamaya dikkat edin.Altın pelletler tekrar santrifüjlenir ve etanol pipetleme yoluyla uzaklaştırılır. Etanol yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Üçüncü etanol yıkamasından sonra, 200 µL seyreltilmiş polivinilperon veya PVP çözeltisi ekleyin ve sonikasyona tabi tutun.Kaplanmış altını, halihazırda 200 µL seyreltilmiş PVP çözeltisi içeren 15 mil konik tüpe hızlıca aktarın. PVP, altın partiküllerinin kullanılan plastik tüplere yapışmasını sağlayan bir çözücüdür. Bir sonraki adımda, epi tüpe 200 µL PVP ekleyerek tüpte kalan altın boncuk kalıntılarını temizleyin.Ardından kısa süreliğine vorteksleyerek 15 ml'lik konik tüpe aktarın. Tüm altın 15 ml'lik konik tüpe aktarılana kadar bu işlemi tekrarlayın. Kalan PVP çözeltisini aktararak altının 3,2 ml'lik PVP etanol çözeltisinde yeniden süspande olmasını sağlayın.Şimdi, gen tabancasına yüklendiklerinde gen tabancası mermilerini barındıracak olan plastik tüpü kaplamaya hazırız. Altın parçacıkları DNA ile kaplandığına göre, plastik tüpün içini altın parçacıklarıyla kaplamamız gerekiyor. Gen tabancası tüpüne asıl olarak yüklenecek olan şey, DNA kaplı altın içeren bu plastik tüptür.Başlangıç olarak, borunun O halkasının yaklaşık iki inç ötesine uzanacak şekilde bir parçasını kesin. Boru, boru hazırlama istasyonuna yerleştirildikten sonra, debimetre yaklaşık 0.4 değerini gösterene kadar basınç valfini çevirin. Azot, boruyu kurutmak için susuz bir atmosfer sağlar; boruyu yaklaşık 20 dakika boyunca kurutun.Bu kurutma adımını, önceki adımda gösterildiği gibi altın mermileri DNA ile kaplarken gerçekleştirmeniz en iyisidir. Böylece işlem bittiğinde tüpler kurumuş ve kaplama için hazır olacaktır. Tüplerin kuruması ve altının DNA ile kaplanmasının ardından altın boncuklar hazırlanmaktadır.Altın PVP çözeltinizle tüpleri doldurmadan önce N iki istasyonunu kapatın, istasyondaki kurumuş tüpleri çıkarın ve PVP ile altını tüplere çekmeden önce 10 mil şırıngaya bağlayın. Çözeltiyi iyice çalkalayın ve kabarcık oluşmamasına dikkat ederek hemen kurumuş tüplerin içine çekin. Ayrıca, çözeltiyi şırınganın içine çekmemeye özen gösterin.Hortum PVP Gold çözeltisi ile doldurulduktan sonra, hortumu dikkatlice N iki istasyonuna geri yerleştirin. Altın partiküllerinin hortumun tabanına çökmesi için, şırınga takılı halde çözeltinin beş dakika boyunca dinlenmesini sağlayın. Çözeltinin çöktüğü bölgelerde hortumun uçlarını işaretleyin.Çözelti çöktükten sonra, ekli şırınga kullanılarak tüpün alt kısmında altın rengi bir şerit görülecektir. Ters yıkama yapmadığınızdan emin olarak, süpernatantı çok yavaşça çekin ve tüpü ayırın. Şimdi, altının tüpün iç yüzeyine eşit şekilde yapışması için tüpü döndürmemiz ve kurutmamız gerekmektedir.Önce, tüpü 90 derece döndürün. İki saniye bekleyin. Şimdi 180 derece daha döndürün ve tekrar iki saniye bekleyin.Beş saniye boyunca döndürün ve son olarak, istasyon 0,4 ile 0,5 arasında değer okuyana kadar N iki'yi açın ve tüpler kururken beş dakika boyunca döndürün. Beş dakika dolduğunda ve altın kuruduğunda, tüpleri gen tabancasına yüklenebilecek kartuşlar şeklinde kesmemiz gerekir. Şimdi, gen tabancasının silindirine yüklemek için uygun boyutta kovanlar oluşturmak amacıyla tüpleri yaklaşık yarım inçlik bölümlere ayıracağım.Kapsülleri toplamak için, foka simülasyon safra sıvısını kesicinin altına yerleştirin, tüpleri işaretli yerlerden kesin ve tüpleri temiz bir jiletle kesin. Uygun bir uzunlukta kesmek için tüpleri tüp doğrayıcıya yerleştirin. Direnç hissedene kadar tüpleri ileri sürün ve ardından kesin.Tüpler kesilip sintilasyon şişesine toplandıktan sonra, sintilasyon şişesine bir kurutma peleti yerleştirin. Pelletler altı aya kadar uygundur, ancak iki ila üç ay sonra transfeksiyonda verimlilik azalmaya başlayabilir. Bu nedenle, şişeyi konstrükt adı ve tarihle etiketlemek iyi bir uygulamadır.Pelletler hazırlandıktan hemen sonra kullanılabilir veya dört santigrat derecede saklanabilir. Dört santigrat derecede saklanan pelletleri kullanıyorsanız, pelletlerin nem çekmesini önlemek için tüpü açmadan önce yaklaşık 15 dakika oda sıcaklığında ısınmaya bırakın. Artık bir gen tabancası kullanarak DNA pelletlerini ateşlemeye hazırız.Kurşunlar hazırlandığına göre, artık hücreleri gerçekten transfekte etmeye hazırım. BioRad Helios gen tabancası kullanacağım ve diseksiyonlarından bu yana beş gün boyunca inkübe edilmiş sıçan hipokampal dilimlerini hedefleyeceğim. Gen tabancası bir helyum gaz tüpüne bağlanacaktır.Silah ateşlendiğinde, tanktan gelen kısa bir basınç patlaması dilimdeki altın partikülleri hızlandıracaktır. Genel olarak, bir altın partikül hücre çekirdeğine gömüldüğünde, o hücre transfect olmuş olacaktır.Kültürlenmiş kesitler üzerinde işlem yaptığım için kontaminasyonu önlemek amacıyla tüm B"$ transfection işlemi boyunca nispeten steril bir teknik uyguluyorum. Kartuşlar oda sıcaklığına geldiğinde, simülasyon şişesini açın ve altın kaplı plastik kartuşları kartuş tutucuya yerleştirin. Ardından, önce silindir kilidini geriye iterek kartuş tutucuyu gen tabancasına yerleştirin.Şimdi namlu astarının tabancaya takılması gerekmektedir. Öncelikle, O-ring'in namlu astarı içinde olduğundan ve difüzör ekranının sabitlendiğinden emin olun. Ekran, namludan gelen basıncı yayma görevi görür ve altın püskürtülmesini sağlayarak altının kuyucuğa daha düzgün dağılmasına yol açar.Namlu astarını gen tabancasının içine tamamen vidalayın. İki farklı konstrükt atışı yapıldığında, her iki mermi seti de aynı kartuş tutucuya yüklenebilir; ancak konstrüktler arasında namlu astarı ve ekran değiştirilmelidir. Gen tabancası artık helyum kaynağına bağlanmaya hazırdır.Gen tabancasını helyum gaz tankına bağlı hortuma takın. Tabanca yerine oturmalıdır; ardından tanktaki basıncı 180 PSI değerine yükseltin. Tabanca artık atış yapmaya hazırdır, ancak öncelikle kulak koruyucu takmayı unutmayın ve difüzör ekranındaki toz veya kalıntıları temizlemek için tabanca ile boş bir atış yapın.İlk olarak, tabanca bip sesi çıkarana kadar güvenlik kilidi düğmesine basın ve tetiği çekin. Artık kesiti çekime hazır hale getirdik. Boş çekim yaptıktan sonra, kesitleri inkübatörden çıkarın.Hipokampal diseksiyonlar sırasında, her kuyucuğa dört kesit yerleştiririz ve bunları membranın merkezine yakın, iki santimetrelik bir karenin köşelerini oluşturacak şekilde düzenleriz. Her kuyucuğu, difüzör ekranı kesitten yaklaşık yarım ila bir inç mesafede olacak şekilde görüntüleyin. Transfekte hücreler, konstrükta bağlı olarak genellikle bir ila beş gün içinde incelenebilir.Tüm kuyucuklar ateşlendikten sonra, tabancayı helyum hortumundan ayırmadan önce gazı kapatın ve basıncı tahliye edin. Kartuşları ve kullanılmış kovanları çıkarın. Namlu astarını sökün; kartuşlar, namlu astarları ve süzgeçler, sabunlu su banyosuna yerleştirilip 20 dakika boyunca sonik banyoda temizlendikten sonra suyla iyice durulanarak, bir saat boyunca %70 etanolda bekletilerek ve ardından gece boyunca kuru bir kağıt havlu üzerine konularak temizlenebilir.Temiz kartuşlar ve ekranlar daha sonraki biyotik transfeksiyonlarda yeniden kullanılabilir. Şimdi transfeksiyon sonuçlarının bazılarına göz atalım. Standart bir hipokampal kesit hazırlığı için bile, kullanılan mermilere ve kesitlere bağlı olarak transfeksiyon verimliliğinde oldukça geniş bir aralık görülebilir.Genellikle, düzgün şekilde izole edilmiş transfekte nöronlar elde etmek için nispeten düşük bir transfeksiyon verimliliği istenir. Ayrıca, çok fazla hücre transfekte edildiğinde, optimal koşullarda dahi kesitin genel sağlığı bozulur. Genellikle kesit başına 20 hücreden az bulunur, ancak aynı kuyucuktaki diğer kesitlerde sıklıkla çok daha fazla hücreye rastlanır.Transfekte edilen ve diğer kesitlerde hücre sayısı azalacaktır. Kesitler arasındaki transfeksiyon verimliliği tutarsızlıkları genellikle kesitlerin varile göre konumlandırılmasının simetrik olmamasından veya altının tüp çevresine eşit şekilde kaplanmamış olup bir tarafta yoğunlaşmış olmasından kaynaklanır. Çok fazla hücre transfekte edilirse, numuneden olan atış mesafesini artırmayı, atış basıncını düşürmeyi veya pelletleri oluşturmak için kullanılan altın miktarını azaltmayı deneyin.Burada, transfekte edilmiş bir CA1 parametral nöronuna dair harika bir örnek görebilirsiniz. Bu özel hücrede, hücreye gömülmüş bir altın mermi görebiliyoruz. İşte transfekte edilmiş bir nörona daha yakından bir bakış. CA1 bölgesinde, bazen uyarım yapmak sağlıksız kesitlere yol açabilir.Basınç patlaması nedeniyle genellikle sağlıklı olmayan kesitler oluşur. Helios gen tabancası sistemi, merkezinde metal bir haç bulunan bir difüzör ile birlikte gelir. İçteki metal haçı kesip çıkardık ve bu haçın yerine metal bir süzgeç kullandık.Süzgeci, namlu astarının ucundan biraz daha geniş olacak şekilde kestik ve bunu namlu astarının ucu ile kesilmiş difüzör arasına sıkıştırdık. Bunun, kesitlerin sağlığını iyileştirdiğini saptadık. Ek olarak, optimal püskürtme koşulları deneysel hazırlığa göre değişiklik gösterecektir; farklı deneysel hazırlıklar için optimizasyon sağlamak amacıyla helyum tankındaki basıncı ve numuneye olan püskürtme mesafesini değiştirin.Son olarak, çift transfeksiyon için iki farklı konstrükt içeren mermiler kullanmak isterseniz, her iki konstrüktün de aynı promotör altında olduğundan emin olun. Bu sayede bir promotör diğerine baskın gelmeyecektir. Size gen tabancası mermilerinin nasıl hazırlanacağını ve BIC transfeksiyonu kullanarak hipokampal kesitlerin nasıl transfekte edileceğini göstermiş oldum.Bu, izole şekilde görüntülenebilen tekil nöronlar üzerinde morfolojik çalışmalar yürütmek için son derece güçlü bir yöntemdir. İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

preparation-gene-gun-bullets-biolistic-transfection-neurons-slice

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Gen tabancası Transfeksiyon Hipokampal Nöronlar

Bu makale, tavşan retina ve parçacık GFP veya retina ganglion hücrelerinin içine Subselüler belirteçleri çeşitli kodlama plazmid aracılı gen transferi diseksiyonu ve inkübasyon göstermektedir.

Yetişkin Tavşan Retina Organotipik Kültürü

CDNA Doğrudan intranükleer enjeksiyonu, etkili bir post-mitotik hücrelerin transfeksiyon tekniktir. Bu yöntem, tek veya birden fazla cDNA yapıları heterolog protein ekspresyonu yüksek düzeyde sağlar ve tek bir hücre deneyleri çeşitli fizyolojik ilgili bir ortamda incelenmesi gereken protein fonksiyonu sağlar.

Yetişkin grubuyla Memeli Nöronlar içine DNA intranükleer Mikroenjeksiyon

Bu piramidal nöronların elektriksel kayıtlar yapma amaçlı bir Organotipik kültür neokortikal dilim hazırlama hazırlamak ve sürdürmek için bir protokoldür.

Neokorteks bir Organotipik Dilim Hazırlık Tüm Hücre Kaydı

Serebral kortekse bir gelişme genlerin işlevine hızlı bir değerlendirme yapmak için, ilgili yöntemler...

Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Mürin Serebral Korteks olarak&gt; RNAi Elektroporasyon

Kaynak: Keener, D. G., et al. Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü İnhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültüründe Tek Hücreli Elektroporasyon. J. Vis. Uzm. (2020).Bu video, fare hipokampal dilim kültürleri içindeki nöronlara plazmit DNA'yı sokmak için tek hücreli elektroporasyon sürecini göstermektedir. Prosedür, nöronal zarı geçici olarak geçirgen geçirgen hale getirmek ve gen transferini kolaylaştırmak için hassas pipet konumlandırma, basınç ayarlamaları ve elektroporasyon...

Fare Hipokampal Dilim Kültürlerinde Tek Hücreli Elektroporasyon Yoluyla Gen İfadesi

Bu video, bir dizi in vitro hipokampal dilim kültürü boyunca hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlardaki genlerin tek hücreli elektroporasyonu için protokolü göstermektedir. Teknik, hücre otonom mekanizmaları ve transsinaptik protein etkileşimleri dahil olmak üzere nöronların spesifik moleküler ve fizyolojik fonksiyonlarını incelemek için yararlıdır.

Organotipik Beyin Dilimi Kültürlerinde Tek Hücreli Elektroporasyon: Beyin Hipokampal Dilimlerinde Hedeflenen Nöronların İçine Plazmitleri Vermek İçin İn Vitro Bir Teknik

Kaynak: Denaxa, M., el al., Kemogenetik Olarak Tasarlanmış Kortikal İnternöron Progenitörlerinin Erken Doğum Sonrası Fare Beyinlerine Nakli. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, ilgilenilen geni taşıyan bir plazmit vektörünün embriyonik bir beyin dilimindeki internöron progenitörlerine enjekte edilmesi ve ardından plazmit girişi ve gen ekspresyonu için elektroporasyon prosedürünü göstermektedir. Bu modifiye edilmiş progenitörler daha sonra beyin bozukluklarını tedavi etmek için kullanılabilir.

Fare Kortikal İnternöron Progenitörlerinde Agaroz Gömülü Elektroporasyon Destekli Gen Transferi

Organotipik beyin dilimi preparatlarındaki son gelişmeler, bunların biyoteknolojik uygulamalar için kullanılmasına izin vermiştir. Organotipik dilimler, fonksiyonel sinaptik bağlantılar da dahil olmak üzere in vivo biyolojinin yerel yapısal özelliklerini korur. Burada, bu dilimleri etiketlemek ve genetik olarak manipüle etmek için bölgesel seçici bir biyolistik dağıtım yöntemi sunuyoruz.

Regioseçici Biolistik Modifiye Gen Tabancası kullanarak Organotipik Beyin Dilimleri Hedefleme

Burada sunulan, çeşitli in vitro hipokampal dilim kültürü çağlarında hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlarda genler sağlayabilen tek hücreli elektroporasyon için bir protokoldür. Yaklaşımımız, hücre-otonom ve hücreler arası fonksiyonları incelemek için kullanılabilecek tek tek hücrelerdeki genlerin kesin ve verimli bir şekilde ifade edilmesini sağlar.

Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü inhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültürü boyunca Tek Hücreli Elektroporasyon

Öğrenin, hipokampal dilim kültürlerindeki nöronları biyolistik transfeksiyonla hedeflemek için DNA kaplı altın mermilerin hazırlanması. Bu yöntem, bireysel nöronların temiz bir arka plan üzerinde görselleştirilmesini sağlar.

Gen Tabancası İşaretleri ve Dilim Kültür Nöronlar Biyolistik Transfeksiyon hazırlanması

Daha fazla video keşfet