Name: Kromatografik Hat İçi İzleme Kullanılarak mRNA Üretimi için İn vitro Transkripsiyon Reaksiyonunun Optimizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Keşfedin, kromatografik hat içi izleme yöntemiyle mRNA üretimi için in vitro transkripsiyon reaksiyonlarını nasıl optimize edebilirsiniz. Bu yöntem, NTP tüketimini ve mRNA üretimini gerçek zamanlı izleyerek verimi artırır ve maliyetleri düşürür.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nat Biotechnol. 40, 840-854 (2022).</li>
<li>Baden, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+the+mRNA-1273+SARS-CoV-2+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine.</a> N Engl J Med. 384 (5), 403(2021).</li>
<li>Lopez Bernal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+Covid-19+Vaccines+against+the+B.1.617.2+%28Delta%29+Variant%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of Covid-19 Vaccines against the B.1.617.2 (Delta) Variant.</a> N Engl J Med. 385 (7), 585-594 (2021).</li>
<li>Sahin, U., Karikó, K., Türeci, Ö <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-based+therapeutics+-+developing+a+new+class+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">mRNA-based therapeutics - developing a new class of drugs.</a> Nat Rev Drug Discov. 13, 759-780 (2014).</li>
<li>Baptista, B. R., Carapito, N., Pichon, C., Sousa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA%2C+a+revolution+in+Biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">mRNA, a revolution in Biomedicine.</a> Pharmaceutics. 13, 2090(2021).</li>
<li>Rosa, S. S., Prazeres, D. M. F., Azevedo, A. M., Marques, M. P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+vaccines+manufacturing%3A+Challenges+and+bottlenecks%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">mRNA vaccines manufacturing: Challenges and bottlenecks.</a> Vaccine. 39, 2190(2021).</li>
<li>Whitley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mRNA+manufacturing+for+vaccines+and+therapeutics%3A+mRNA+platform+requirements+and+development+of+a+scalable+production+process+to+support+early+phase+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Res%22%5BJournal%5D)">Development of mRNA manufacturing for vaccines and therapeutics: mRNA platform requirements and development of a scalable production process to support early phase clinical trials.</a> Transl. Res. 242, 38-55 (2022).</li>
<li>Kis, Z., Kontoravdi, C., Shattock, R., Shah, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resources%2C+production+scales+and+time+required+for+producing+RNA+vaccines+for+the+global+pandemic+demand%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Resources, production scales and time required for producing RNA vaccines for the global pandemic demand.</a> Vaccines. 9 (1), 3(2021).</li>
<li>Hengelbrock, A., Schmidt, A., Helgers, H., Vetter, F. L., Strube, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+mRNA+machine+for+regulatory+approval+of+variable+scale+between+1000+clinical+doses+to+10+million+manufacturing+scale+doses%5BTitle%5D)+AND+%22Processes%22%5BJournal%5D)">Scalable mRNA machine for regulatory approval of variable scale between 1000 clinical doses to 10 million manufacturing scale doses.</a> Processes. 11, 745(2023).</li>
<li>Rosa, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mRNA+vaccine+production+with+Bayesian+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Maximizing mRNA vaccine production with Bayesian optimization.</a> Biotechnol Bioeng. 119 (11), 3127-3139 (2022).</li>
<li>Sari, Y., Sousa, S. S., Jeffries, J., Marques, M. P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+evaluation+of+T7+promoter+for+enhanced+yield+and+quality+in+mRNA+production%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Comprehensive evaluation of T7 promoter for enhanced yield and quality in mRNA production.</a> Sci Rep. 14, 9655(2024).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA+vaccine+development+landscape+for+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The mRNA vaccine development landscape for infectious diseases.</a> Nat Rev Drug Discov. 21 (5), 333-334 (2022).</li>
<li>Pregeljc, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+yield+of+in+vitro+transcription+reaction+with+at-line+high+pressure+liquid+chromatography+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Increasing yield of in vitro transcription reaction with at-line high pressure liquid chromatography monitoring.</a> Biotechnol Bioeng. 120 (3), 737-747 (2023).</li>
<li>Kern, J. A., Davis, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+fed-batch+system+to+produce+RNA+by+in+vitro+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Application of a fed-batch system to produce RNA by in vitro transcription.</a> Biotechnol Prog. 15 (2), 174-184 (1999).</li>
<li>Skok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gram-Scale+mRNA+Production+Using+a+250-mL+Single-Use+Bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Chemie+Ingenieur+Technik%22%5BJournal%5D)">Gram-Scale mRNA Production Using a 250-mL Single-Use Bioreactor.</a> Chemie Ingenieur Technik. 94 (12), 1928-1935 (2022).</li>
<li>Welbourne, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anion+exchange+HPLC+monitoring+of+mRNA+in+vitro+transcription+reactions+to+support+mRNA+manufacturing+process+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Anion exchange HPLC monitoring of mRNA in vitro transcription reactions to support mRNA manufacturing process development.</a> Front Mol Biosci. 11, 1250833(2024).</li>
<li>Lee, K. H., Song, J., Kim, S., Han, S. R., Lee, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+strategies+for+optimization+of+in+vitro+transcription+and+quality+control+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring strategies for optimization of in vitro transcription and quality control of RNA.</a> Front Mol Biosci. 10, 1229246(2023).</li>
<li>Matuszczyk, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+provides+valuable+process+insights+for+cell-derived+and+cellular+products%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy provides valuable process insights for cell-derived and cellular products.</a> Curr Opin Biotechnol. 81, 102937(2023).</li>
<li>Mu, X., Hur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+in+vitro-transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of in vitro-transcribed RNA.</a> Acc Chem Res. 54 (21), 4012-4023 (2021).</li>
<li>Cho, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoporous+silica+particle+as+an+RNA+adsorbent+for+facile+purification+of+in+vitro-transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mesoporous silica particle as an RNA adsorbent for facile purification of in vitro-transcribed RNA.</a> Int J Mol Sci. 24 (15), 12408(2023).</li>
<li>Ziegenhals, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+dsRNA+by-products+during+in+vitro+transcription+can+be+reduced+by+using+low+steady-state+levels+of+UTP%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Formation of dsRNA by-products during in vitro transcription can be reduced by using low steady-state levels of UTP.</a> Front Mol Biosci. 10, 1291045(2023).</li>
<li>Höfer, K., Langejürgen, L. V., Jäschke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+aptamer-based+real-time+monitoring+of+enzymatic+RNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Universal aptamer-based real-time monitoring of enzymatic RNA synthesis.</a> J Am Chem Soc. 135 (37), 13692-13694 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.22 ve mikro; m PES membran filtre, örn. Sartolab BT 500</td><td>Sartorius</td><td>180E14---------E</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL plastik tüpler; örneğin DNA LoBind, PCR temiz</td><td>Eppendorf</td><td>30108035</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL plastik tüpler; örneğin DNA LoBind, PCR temiz</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>ATP Solüsyonu</td><td>MEBEP BİYOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>R1331T2</tr><tr><td>Tezgah üstü soğutucu -20 derece; C</td><td>Marka</td><td>114935</td><td></td></tr><tr><td>CIMac PrimaS 0.1 mL Analitik Kolon (2 & mikro; m)</td> <td>Sartorius BIA Ayrımları</td><td>110.5118-2, 2 & mikro; m kanalları</td><td></td></tr><tr><td>CTP Çözümü</td><td>MEBEP BİYOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>R3331T2</tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na2 x 2H2O</td><td>Kemika&nbsp;</td><td>Ör. 11368 08</td><td></td></tr><tr><td>GTP Çözümü</td><td>MEBEP BİYOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>R2331T2</tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck</td><td>1.10110.1000</td><td></td></tr><tr><td>HPLC yüksek geri kazanım flakonu</td><td>Macherey-Nagel</td><td>702860</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen</td><td>9530G</td><td></td></tr><tr><td>Mikrohacim spektrofotometresi</td><td>Thermo Scientic</td><td>Nanodrop</td><td></td></tr><tr><td>mRNA standardı, mFix4, 4000 nt</td><td>Sartorius BIA Ayrımları</td><td>BIA-mFix4.1.1</td><td></td></tr><tr><td>Na4P2O7 + 10 H2O</td><td>Sigma</td><td>S6422-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fluka</td><td>31434-1KG-M</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1064691000</td><td></td></tr><tr><td>PATfix mRNA analitik platformu&nbsp;</td><td>Sartorius BIA Ayırma</td><td>PAT0021</td><td></td></tr><tr><td>Pipet 100 &ndash; 1000 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>Referans 2</td><td></td></tr><tr><td>Pipet 2 &ndash; 10 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>Referans 2</td><td></td></tr><tr><td>Pipet 20 &ndash; 200 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>Referans 2</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosfataz</td><td>MEBEP BİYOSCIENCE&nbsp;</td><td>M2403L</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Away Dekontaminasyon Reaktifi</td><td>Thermo Scientic</td><td>10328011</td><td></td></tr><tr><td>RNAse inhibitörü</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>RNK3501</tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma</td><td>85558-5G</td><td></td></tr><tr><td>T7 mRNA polimeraz</td><td>MEBEP BIOSCIENCE</td><td>TR01</td><td></td></tr><tr><td>Termoblok</td><td>Termo Scientic</td><td>EPPE5382000.015</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T6066-1KG</td><td></td></tr><tr><td>UTP Çözeltisi</td><td>MEBEP BİYOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>R5331T2</tr><tr><td>Flakon kapakları</td><td>Macherey-Nagel</td><td>70245</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>IKA</td><td>V1900</td><td></td></tr></tbody></table>

kromatografik hat İçi İzleme kullanılarak mrna Üretimi için İn vitro transkripsiyon reaksiyonunun optimizasyonu

Optimization of In vitro Transcription Reaction for mRNA Production Using Chromatographic At-Line Monitoring

Bu protokolde açıklanan kromatografik analiz, IVT optimizasyonu için veya bir kesikli IVT reaksiyonunu beslemeli kesikli reaksiyona dönüştürmek için kullanılabilir (Şekil 1).
Farklı tampon bileşimlerinin IVT reaksiyonunun kinetiği üzerindeki etkisini test etmek için, Tablo 2'de yazılan protokole göre üç farklı IVT reaksiyonu karıştırıldı. pH'ın HCl ile ayarlandığı Tris içeren tampon, pH'ın asetik asit ile ayarlandığı Tris tamponu ile karşılaştırıldı. Ayrıca, her iki Tris tamponu, pH'ın NaOH ile ayarlandığı HEPES tamponu ile karşılaştırıldı. Tüm 1x IVT tamponunun bileşimi 40 mM Tris/HEPES, 10 mM DTT, 2 mM spermidin ve pH 7.9 idi.
100 μL IVT reaksiyon karışımından, IVT reaksiyonundan 2 μL IVT numunesi alındı ve inkübasyonun ilk saatinde her 15 dakikada bir ve daha sonra 180 dakikalık inkübasyona kadar her 30 dakikada bir 2 μL 100 mM EDTA ile söndürüldü. Bu reaksiyon koşulu için beklenen nihai mRNA verimi 15 mg/mL idi, yani su vermeye bağlı 2 kat seyreltmeyi analiz için MPA+NaCl'de 400 kat seyreltme izledi. Numune toplamda 800 kat seyreltildi, yani 15 mg/mL üretimde bile analitik kromatografik kolona yüklenen mRNA konsantrasyonu hala kalibrasyon eğrisi konsantrasyonları içindeydi.
A260'taki NTP ve mRNA alanları, her bir zaman noktasında (tx) her bir numune için entegre edildi. Alanlar daha sonra, mRNA kalibrasyon eğrisi ve NTP'ler için tüketim yüzdesi kullanılarak, NTP'lerin A260 alanı kullanılarak 0 dk'da (t0) 0 olarak mRNA konsantrasyonlarına dönüştürüldü (aşağıdaki denkleme bakın).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67503/67503eq01.jpg" style="margin: auto;">
Sonuçlar, zamanın x ekseninde ve mRNA konsantrasyonunun gösterildiği ve kalan NTP'lerin y ekseninde gösterildiği her bir IVT reaksiyonu için grafikler olarak gösterilebilir (Şekil 2A). Zamana bağlı olarak mRNA konsantrasyonları anlamına gelen tüm IVT, tek bir grafikte birlikte çizilebilir ve mRNA üretim kinetiği incelenebilir ve optimal IVT koşulları seçilebilir (Şekil 2B).
Beslemeli toplu deney için IVT, Tablo 3'te yazıldığı gibi karıştırıldı. 300 μL IVT reaksiyon karışımından, IVT reaksiyonundan 2 μL IVT numunesi çıkarıldı ve her 30 dakikada bir 2 μL 100 mM EDTA ile söndürüldü. Ek olarak, numune her toplu NTP + MgCl2 ilavesinden hemen sonra alındı. Önceden her bir NTP'den 42.4 mM ve 152.5 mM MgCl2 içeren bir besleme çözeltisi hazırlandı ve her bir 200 mM NTP'den 106 μL, 76.2 μL 1 M MgCl2 ile karıştırıldı. Her saat bolus yeminin eklendiği bir besleme rejimi oluşturulmuştur (60 dakika, 120 dakika, 180 dakika ve 240 dakika inkübasyonda). Besleme rejimi Tablo 3'te açıklanmıştır: Numuneler, toplu IVT reaksiyonu için tarif edildiği gibi analitiklerle neredeyse gerçek zamanlı olarak analiz edildi. 300 dakikalık izlemeden sonra IVT reaksiyonu söndürüldü.
Sonuçlar, inkübasyon süresi boyunca kalan NTP'ler/mRNA üretimi olarak gösterilebilir. Bolus besleme ilaveleri aynı zamanda IVT reaksiyonunu da seyrelttiğinden, IVT'deki mRNA konsantrasyonu her yem ilavesinde düşer (Şekil 3A). mRNA kütlesindeki artış, zaman içinde mRNA üretiminde doğrusal bir artış gösteren transkripsiyon faktörleri (mmRNA/mpDNA olarak tanımlanır) ile de ölçülebilir ve sunulabilir (Şekil 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67503/67503fig01.jpg"> 
Şekil 1: Şematik genel bakış (A) NTP'lerin ve mRNA'nın hat içi kromatografik analiz miktar tayini ile IVT optimizasyon iş akışının temsili. (B) (i) t0, (ii) orta nokta, (iii) son reaksiyon zaman noktalarında örneklenen bir toplu IVT reaksiyonunun temsili kromatogramları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/67503fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67503/67503fig02.jpg"> 
Şekil 2: Toplu IVT grafikleri. (A) Y ekseninde mRNA üretimi ve NTP tüketimi ile IVT reaksiyonunun temsili grafiği. Sınırlayıcı NTP (ATP) olarak NTP tüketimi ile ilişkili olan 120 - 180 dakikalık inkübasyonda görülebilen mRNA konsantrasyon platosu 120 dakikada tüketilir. (B) IVT tamponunun IVT kinetiği üzerindeki etkisini gösteren IVT grafiği. Tampon A (Tris+asetik asit) içeren IVT en hızlı mRNA üretimini gösterirken, bunu en yavaş olarak Tampon B (Tris+HCl) ve Tampon C (HEPES+NaOH) izledi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/67503fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67503/67503fig03.jpg"> 
Şekil 3: Fed-batch IVT grafiği. (A) NTP + MgCl2 beslemelerinin 60, 120, 180 ve 240 dakikada eklendiği IVT grafiği. IVT reaksiyonundaki mRNA konsantrasyonu, NTP + MgCl2 beslemesi ile seyreltme nedeniyle her besleme ilavesinde düşer. (B) Transkripsiyon faktörü ile gösterilen mRNA kütlesindeki artış, reaksiyon inkübasyonu boyunca doğrusaldır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/67503fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: Genel IVT protokolü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 2: Toplu IVT protokolü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/Table%202_RE.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 3: Fed-batch IVT protokolü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/Table%203_RE.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Kromatografik Hat İçi İzleme Kullanılarak mRNA Üretimi için İn vitro Transkripsiyon Reaksiyonunun Optimizasyonu

In vitro transcription reaction (IVT) is a complex, multi-component enzymatic synthesis of mRNA from a linear DNA template, catalyzed by an RNA ...

optimization-vitro-transcription-reaction-for-mrna-production-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu protokol hazırlanması için sentetik bir tRNA substrat...

Entamoeba histolytica DNA ve tRNA Metiltransferaz Dnmt2 (Ehmeth) Enzim ile in vitro tRNA Metilasyon Testi

Burada örnek sınırlı miktarda çalışma, özellikle microRNA (miRNA) ekspresyon düzeyleri için bir maliyet ve zaman etkili yüksek verimli bir tarama aracı olarak mikroakışkan platformu ile birlikte optimize edilmiş bir multiplex ters transkriptaz kantitatif PCR (QRT PCR) protokolü açıklamak.

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

Biz primer T hücreleri kullanarak kromatin immunoprecipitation için bir sağlam bir yöntem tarif. Metodu standart yaklaşımlar üzerine kurulmuştur, ama hücrelerin sınırlı bir miktarda için verimliliği artırmak koşulları ve reaktifler belirli bir kümesi kullanır edilir. Önemli olarak, veriler analiz aşaması bölgesinin, bir ayrıntılı bir açıklama sunulmaktadır edilir.

Biyokütle Limit Tutarlar kullanarak Verimli Kromatin Immunoprecipitation

Burada RNA / protein etkileşimleri analiz etmek için bir protokol mevcut. elektroforetik hareketlilik kayma deneyi (EMSA), yerli jel elektroforez sırasında RNA / protein kompleksleri ve serbest RNA ayırıcı geçiş dayanmaktadır. Bir radyo-etiketli bir RNA probu kullanarak, RNA / protein kompleksleri otoradyografi ile görselleştirilebilir.

IRE / IRP Örnek: RNA-protein Etkileşimleri Çalışmaları elektroforetik hareketlilik Shift Testi (EMSA)

Galyum (III) 'ün 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole ve serbest baz analog düşük mikromolar hücre sitotoksisite arzetmemiştir. Bu yazıda corroles transkripsiyon inhibisyonunu değerlendirmek için, UV-Vis spektroskopisi ile bir RNA transkripsiyon reaksiyonu, etidyum bromür ile boyanmış jel ile görüntüleme RNA ve RNA miktarının açıklar ve antikanser aday özelliklerin değerlendirilmesi için basit bir yöntem ortaya koymaktadır.

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Enzimatik Deneyi Galyum (III) ve H Transkripsiyon İnhibisyonunu Tedbir<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentaflüorofenil) corroles

Bu çalışmada, aktif geliştiricilerin nasıl tanımlanabileceğine ve deneysel olarak doğrulanabileceğine dair deneysel bir iş akışı sağlıyoruz.

Tahmin ve Gen Düzenleme Elementlerin Doğrulama Retinoik Asit Kaynaklı Embriyonik sırasında Aktif Hücre Farklılaşma Kök

Bu iletişim kuralı birden çok model organizmalar transkripsiyon kalitesini izlemek için araştırmacılar ile yeni bir araç sağlar.

Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim

cDNA'nın kinetik çapraz bağlanması ve analizi, canlı hücrelerdeki protein-RNA etkileşimlerinin dinamiklerinin yüksek zamansal çözünürlükte araştırılmasını sağlayan bir yöntemdir. Burada protokol, maya hücrelerinin büyümesi, UV çapraz bağlama, hasat, protein saflaştırma ve yeni nesil dizileme kütüphanesi hazırlama adımları dahil olmak üzere ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

χCRAC Kullanarak Yüksek Zamansal Çözünürlükte Protein-RNA Etkileşim Dinamiğinin İn Vivo İzlenmesi

Dört plazmidli in vitro hücrelerde kullanılmak üzere bir intronic mikroRNA biyogenez muhabir testi geliştirdik: biri intronic miRNA ile, biri hedefli, biri düzenleyici bir proteini aşırı eksprese etmek ve biri Renilla lusiferaz için. MiRNA işlendi ve hedef diziye bağlanarak lusiferaz ekspresyonunu kontrol edebildi.

Memeli Hücrelerinde Intronic mikroRNA Olgunlaşmasını Analiz Etmek İçin Bir Muhabir Testi

Burada, yüksek, uzun vadeli, kararlı, hedefe yönelik susturma verimliliğine ve düşük genom çapında, hedef dışı aktiviteye sahip tasarlanmış transkripsiyonel baskılayıcıların (ETR'ler) in vitro seçimi için bir protokol sunuyoruz. Bu iş akışı, aday ETR'lerin başlangıçtaki karmaşık repertuarını, terapötik olarak ilgili ortamlarda daha fazla değerlendirme için uygun olan kısa bir listeye indirgemeye olanak tanır.

In Vitro Hedeflenen Epigenetik Susturma için Tasarlanmış Transkripsiyonel Baskılayıcıların Seçimi

Bu protokol, fare embriyonik kök hücrelerinde intergenik ve intragenik güçlendirici RNA'ların kararlılığını ve yarı ömrünü Aktinomisin D tedavisi, RT-qPCR ve doğrusal olmayan regresyon analiziyle nicel olarak ölçer. Konuma özgü normalleştirme stratejileri, eRNA bozunma dinamiklerini bağlama bağlı olarak doğru şekilde modellemek için dahil edilir.

Fare embriyonik kök hücrelerinde Enhancer RNA Stabilitesinin Optimize Edilebilir Nicel Değerlendirmesi

Keşfedin, kromatografik hat içi izleme yöntemiyle mRNA üretimi için in vitro transkripsiyon reaksiyonlarını nasıl optimize edebilirsiniz. Bu yöntem, NTP tüketimini ve mRNA üretimini gerçek zamanlı izleyerek verimi artırır ve maliyetleri düşürür.

Kromatografik Hat İçi İzleme Kullanılarak mRNA Üretimi için İn vitro Transkripsiyon Reaksiyonunun Optimizasyonu

Daha fazla video keşfet