Yüksek Büyütmeli Canlı Hücre Konfokal Floresan Mikroskobu için Equibiaxial Germe Cihazı

Fizyolojik ve patolojik bağlamda hücrelerin mekanik uyaranlara nasıl tepki verdiğini ve uyum sağladığını inceliyoruz. Bunun için hücrelere dış kuvvetler, bu durumda bir zorlanma uygulamak için germe cihazını kullanıyoruz.

Hücrelerin ve hücre dokularının belirli mekanik uyaranlara nasıl tepki verdiğini ve diğer biyolojik ipuçlarına mekanik olarak nasıl tepki verdiklerini bulduk.

Germe cihazımız, farklı sertlikteki poliakrilamid jeller üzerinde kültürlenmiş hücreleri germe veya sıkıştırma deneyleri yapma imkanı sunduğundan diğerlerine kıyasla çok yönlüdür.

[Anlatıcı] Başlamak için PMMA halkalarını beyaz bir tezgah kağıdına yerleştirin. Tüm çevre boyunca temiz bir kesim sağlamak için bir bıçak kullanarak PDMS kaplı plakanın kenarından dikkatlice geçin. Membranı bir kenarından kaldırmak için cımbız kullanın, ardından membranın yarısını plakadan eşit şekilde ayırmak için başparmağınızla hafifçe soyun. PMMA halkasının tüm üst yüzeyine %96 etanol eşit şekilde yaymak için parmaklarınızı kullanın. PDMS membranını önceden kaldırılmış kenardan kaldırarak plakadan dikkatlice çıkarın. Daha sonra etanol kaplı PMMA halkasının üzerine simetrik olarak yerleştirin, esnemeyi önlerken kırışıklık olmamasını sağlayın. Daha sonra başka bir boş PMMA halkası alın ve montaj halkasının üstüne yerleştirin. PDMS membranını iki halka arasına sıkıştırarak bunları birbirine yapıştırmak için metal klipsler kullanın. Gerdirme halkasının alt yarısını montaj desteğinin üzerine yerleştirin. PDMS halkasını gerdirme halkasının üzerine sıkıştırın ve contanın doğru konumlandırıldığından emin olarak tamamen oturana kadar sıkıca aşağı doğru bastırın. Dairesel pirinç ağırlıkları numunenin üzerine yerleştirin. Daha sonra metal gerdirme halkasının üst yarısını vida deliklerini hizalayarak üstüne yerleştirin. Tüm vidaları takın ve sıkın. Bir bıçak kullanarak halkanın etrafındaki PDMS'yi yavaşça kesin. Membranı tozdan korumak için düzeneği bir Petri kabı ile örtün. Seri seyreltme kullanarak PBS'de 0,2 mikrometre floresan boncuklardan oluşan bir 250.000 seyreltme hazırlayın. Ve PDMS'nin ortasına 10 ila 30 mikrolitrelik bir damla boncuk çözeltisi yerleştirin. Kürlenme sonrası kafa karıştırıcı sorunları önlemek için 40 santigrat dereceden yüksek olmayan bir sıcaklıkta kurumasını bekleyin. Şimdi, germe cihazını mikroskop tabla tutucusuna monte edin ve germe direğini mikroskoba sabitleyin. Direğin dairesel alanına cömertçe yağlayıcı uygulayın. Hazırlanan gerdirme halkasını gerdirme direğine monte edin ve düzeneği kapatmak için üst kapağı vidalayın. Ardından, vakum kontrol kutusunun arkasını vakum kaynağına, ardından kutunun önünü gerdirme direğine bağlayın. Gerinim kalibrasyonu yapmak için, yüksek boncuk yoğunluğu ve kullanıcı için tanınabilir boncuk kümeleri içeren bir ilgi alanı seçin. Seçilen görüş alanının geri kalanında bir görüntü elde edin ve konumu kaydedin. Negatif 20 milibarlık düşük vakum seviyesinde streç uygulayarak her yöne harekete neden olun. Şimdi, Z düzleminde yeniden odaklanın ve aynı ilgi alanını bulmak ve uzatılmış durumda bir görüntü elde etmek için sahneyi XY yönlerinde hareket ettirin. Ardından, gerilimi serbest bırakın ve adımları daha yüksek bir vakum seviyesiyle tekrarlayın. Alınan görüntüleri örneğe göre düzenlenmiş bir klasörde depolayın. İsim, reference_str1 olarak gerilmeden elde edilen referans boncuk görüntüsü ve stretched_str1, stretched_str2, stretched_str3 vb. gibi artan vakum seviyelerinde gerilen görüntüler. Suşu ölçmek için MATLAB'ı açın ve jel gerinim kodunu yükleyin. Parametreleri ayarladıktan sonra, üst öğeyi ve deney klasörü yollarını tanımlayın ve kodu çalıştırın. Ardından, kodun istediği gibi stretched_str1 açın ve ardından reference_str1. Şimdi, her vakum seviyesi için medyan gerinim matrisini hesaplayın. Bu işlemi en az üç numune için tekrarladıktan sonra, kalibrasyon eğrisini elde etmek için medyan gerinim matrisini vakum seviyesine göre çizin. PDMS halkasını kaplamak için ultraviyole ışık altında 15 dakika sterilize edin. Bir biyogüvenlik kabini altında, davlumbazın altındaki plakayı steril PBS ile durulayın. Plakayı durulamak için kullanılan tüm PBS'leri aspire ettikten sonra. Halkanın ortasına 100 ila 200 mikrolitrelik bir çözelti damlası bırakın. PDMS membranının alt tarafından kalıcı bir işaretleyici ile damlanın çevresini çizin ve inkübe edin. Deney gününde, yapışma proteinini PBS ile yıkayın. Hücreleri tripsinizledikten sonra hücre sayımına geçin. Bağlanmayı teşvik etmek için standart hücre ortamıyla yaklaşık 20 ila 50 mikrolitrelik küçük bir hacimde uygun sayıda hücreyi tohumlayın ve nem kontrollü bir karbondioksit inkübatöründe inkübe edin. 20 ila 30 dakika sonra, hücrelerin üzerine yavaşça 500 mikrolitre ortam ekleyin ve hücrenin daha fazla yayılmasına izin vermek için plakayı inkübatöre geri koyun. Tek bir streç serbest bırakma döngüsü ve görüntüleme için, gerdirme halkasını daha önce gösterildiği gibi mikroskop aşamasına monte edin. İlgilenilen bir hücreyi bulduktan sonra, konumunu kaydedin ve önceden gerilmiş hücrenin bir görüntüsünü yakalayın. Hücreyi germek için kalibrasyon eğrisine bağlı olarak gerekli alt tabaka gerilimine karşılık gelen istenen vakum seviyesini uygulayın. Uzatma hücresini bulmak için önce Z düzleminde yeniden odaklanın. Ardından, hücreyi görüş alanında ortalamak için XY yönlerinde hareket edin. Görüntüleri istediğiniz süre boyunca kaydedin. Hücrenin orijinal konumuna gidin ve yeniden odaklandıktan hemen sonra görüntü yakalamanın başlamasını sağlamak için mikroskobun çekim modunu etkinleştirin. Uzatmayı serbest bırakın ve Z düzleminde manuel olarak hızla yeniden odaklanın. Serbest bırakılan hücrenin görüntülerini gerekli süre boyunca yakalayın ve çekim boyunca odağı manuel olarak ayarlayın. İşlem sonrası için Fiji'yi açın ve dinlenme sırasında ve zorlanma sırasında elde edilen görüntüleri yükleyin. Hizalama için hücrenin bir bölgesini seçmek için Fiji eklenti şablonu eşleştirmesini kullanın. Kalibrasyon, uygulanan gerinim üzerinde tekrarlanabilirlik ve kontrol sağlayarak vakum ile gerinim arasında %20'ye kadar neredeyse doğrusal bir ilişki olduğunu doğruladı. Radyal yer değiştirme analizi, PDMS membranı üzerindeki uzama izotropisini ve homojenliğini gösterdi. Canlı hücre gerilmesi altında fibroblast hücrelerinin floresan görüntülemesi, gerilme serbest bırakıldığında üç ila beş dakika içinde yeniden emilen membran istilalarını ortaya çıkardı. Sabit hücrelerin yeniden gerilmesi, gergin bir durumda görüntülemeyi mümkün kıldı ve yapay katlanma artefaktlarını önledi. Desenli bir ızgaraya sahip PDMS membranı, multimodal görüntülemeyi kolaylaştırdı ve aynı hücrelerin floresan ve taramalı elektron mikroskobunda lokalizasyonuna izin verdi. Fibronektin ile kaplanmış yumuşak PAA jelleri üzerine oturtulan hücreler, gerilmemiş hücrelere kıyasla yalnızca belirli döngüsel gerilme döngülerine tabi tutulduğunda fokal yapışıklıklar oluşturdu.