Doğal γH2A ile yaygın kırılgan bölge kırılmalarının yakalanması. X ChIP

Lüksümüz, flörtün kaybedilmesine, tümörün yeniden oluşumunda jive'deki yaygın kırılgan bölge dengesizliğinin rolüne odaklanıyor. Onkogen gyron kanser hücrelerinde terapötik olarak kullanılabilecek viral mobiliteleri belirlemeye çalışın. Aksi takdirde, tek hücre sempatisi ve canlı hücre görüntüleme gibi görüntüleme ve dizileme teknolojileri, kütle olarak genomik kararsızlığın yüksek çözünürlüklü haritalanmasını sağlar.

Onkogen genomik kararsızlığının mekanizmalarını ayrıntılı olarak araştırmak için çevremizdeki gürültü, genetiği değiştirilmiş fare modelleri ve CRISPR tabanlı sistemler dahil olmak üzere bölge in vivo modelleri. Laboratuvarımızın uzun vadeli ilgisi, normal hücrelere verilen zararı en aza indirmeye odaklanarak, enfekte tedaviler için stratejik olarak tedavi edilebilecek kanser hücrelerindeki belirli zayıflıkları belirlemektir. Bu, normal terapötik fırsatları ortaya çıkarmak için genetik ve epigenetik güvenlik açıklarını keşfetmeyi içerir.

Başlamak için, HEK 293 T hücrelerini 24 saat boyunca üç farklı plakada DMSO etil dekolin ve hidroksiüre ile tedavi edin. Hücreleri PBS ile iki kez yıkadıktan sonra, dört santigrat derecede 500 G'de dört, beş dakika santrifüjleyin. Peleti 500 mikrolitre taze hazırlanmış soğuk tampon A içinde yeniden süspanse edin ve buz üzerinde beş ila 10 dakika inkübe edin.

Tam hücre lizizini doğrulamak için lizis ilerlemesini ışık mikroskobu altında gözlemleyin. Parçalandıktan sonra, hücre süspansiyonunu 500 G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin ve çekirdek peletini 500 mikrolitre soğuk tampon A.Santrifüj içinde tekrar süspanse edin ve bozulmamış çekirdekleri beş ila 10 kez pipetleyerek 100 mikrolitre mikrokokal nükleaz tamponu ile yeniden süspanse edin. Numunelere hemen önceden belirlenmiş miktarda mikrokok nükleazı ekleyin.

Tüpleri 37 santigrat derecede beş dakika boyunca bir döndürücüye yerleştirin. Tüpleri hemen buza geri koyun ve sindirimi sonlandırmak için EDTA ekleyin. Vortekslemeden sonra, 500 mikrolitre tampon B ekleyin ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.

Proteinleri çözündürmek için tüpü buz üzerinde beş dakika inkübe edin. Çözünmeyen malzemeyi peletlemek için numuneleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin. Berrak süpernatanı, doğal kromatin fraksiyonu olarak etiketlenmiş yeni 1,5 mililitrelik tüplere aktarın.

Kromatin parçalanmasını doğrulamak için, süpernatanı 10 mikrolitre yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe ayırın. Süpernatanı 20 mikrolitre damıtılmış su ve 30 mikrolitre fenol kloroform izoamil alkol ile karıştırın. Güçlü girdaptan sonra, tüpleri 20.000 G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin ve üç farklı katman gözlemleyin: şeffaf bir üst katman, beyaz bir orta katman ve sarı bir alt katman.

DNA içeren üst sulu fazın 20 mikrolitresini dikkatlice taze bir tüpe aktarın. Saflaştırılmış DNA'yı %1.5'lik bir agaroz jel içinde 30 voltta 100 dakika ayırın. Kromatin fragmanlarının boyutunun öncelikle 200 ila 1.000 baz çifti arasında olduğundan emin olarak sindirim modellerini görselleştirin.

180 mikrolitre elüsyon tamponu içeren her tüpe 20 mikrolitre sindirilmiş kromatin aktarın. Tüpleri giriş numuneleri olarak etiketleyin ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. Kromatin immünopresipitasyonu veya çip için başka bir 1.5 mililitrelik tüpe 400 mikrolitre sindirilmiş kromatin ekleyin.

Gama H2 AX antikorunu DMSO ile muamele edilmiş, etil dekolin ile muamele edilmiş ve hidroksiüre ile muamele edilmiş numuneye aktarın. Tüpleri beş saat veya tercihen gece boyunca dört santigrat derecede bir döndürücüye yerleştirin. Bu arada, geniş delikli uçlar kullanarak, 100 mikrolitre çip dereceli manyetik protein AG boncuklarını yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe ayırın.

Tüpü bir dakika boyunca manyetik bir stand üzerine yerleştirin, ardından sıvıyı dikkatlice atın. Ardından, boncukları %0,5 BSA içeren bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Tüpü dört saat boyunca dört santigrat derecede döndürün.

Tüpü bir dakika boyunca manyetik standa geri yerleştirin ve süpernatanı atın. İkinci yıkamadan sonra, önceden kodlanmış boncukları 100 mikrolitre tampon B'de yeniden süspanse edin. Tüpleri iki saat boyunca dört santigrat derecede döndürün, ardından çip tüplerini manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve boncuklar tüpün kenarına yapışana ve çözelti berraklaşana kadar bekleyin.

Manyetik boncukları bozmadan şeffaf süpernatanı atın. Boncukları bir mililitre yıkama tamponunda yeniden süspanse edin ve 10 dakika boyunca dört santigrat derecede döndürün. Tüpleri tekrar manyetik standa yerleştirin ve yıkama tamponunu atmadan önce çözeltinin berraklaşmasını bekleyin.

Son yıkamadan sonra, kalan sıvıyı çıkarmak için tüpleri 400 G'de 30 saniye boyunca dört santigrat derecede kısa bir süre santrifüjleyin. Tüpleri tekrar manyetik standa yerleştirin ve tüpün dibinde kalan sıvıyı dikkatlice çıkarın. Çip antikorunun aşağı çekme etkinliğini doğruladıktan sonra, western blot kullanarak, kalan çip örneklerinin her birine 50 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin.

Tüpleri bir Therma mikserine yerleştirin ve oda sıcaklığında 15 dakika çalkalayın. Tüpleri bir dakika boyunca manyetik bir tutucuya yerleştirin ve elüiti yeni tüplere toplayın. Her çip elüsyon örneğine 100 mikrolitre elüsyon tamponu ve her giriş örneğine 180 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin.

Daha sonra her numuneye 200 mikrolitre fenol kloroform izoamil alkol ekleyin ve karıştırmak için tüpleri kuvvetlice vorteksleyin. Numuneleri santrifüjledikten sonra, üst sulu tabakayı dikkatlice 19 mikrolitre üç molar sodyum asetat ve iki mikrolitre glikojen çözeltisi içeren tüplere aktarın. Tüpleri vorteksleyerek karıştırın.

Her numuneye 500 mikrolitre %100etanol ekleyin ve iyice girdap yapın. DNA'yı çökeltmek için tüpleri iki saat boyunca veya gece boyunca eksi 20 santigrat dereceye yerleştirin. Daha sonra süpernatanı atmadan önce tüpleri santrifüjleyin ve peleti bir mililitre %70 etanol içinde yeniden süspanse edin.

Artık etanol santrifüjleme ile uzaklaştırıldıktan sonra, DNA peletlerini 400 mikrolitre TE tamponunda yeniden süspanse etmeden önce iki ila üç dakika havayla kurutun. Daha yüksek mikrokok nükleaz konsantrasyonları, kromatinin daha kapsamlı sindirimine yol açarak mono-nükleozom fragmanlarının baskın olmasına neden oldu. Buna karşılık, daha düşük mikrokokal nükleaz konsantrasyonlarında, kromatin fragmanlarının çoğu daha büyüktü ve genellikle bir kilo bazı aşıyordu.

Gama H2 AX seviyeleri, hem doğal çip hem de çapraz bağlı çip için girdi örneklerinde gösterildiği gibi, DMSO ile muamele edilen DMSO ile muamele edilen kontrollere kıyasla, replikasyon stresli hücrelerde önemli ölçüde yükseldi.