Brillouin Spektroskopisi Kullanılarak Sferoidlerin Mekanik Haritalanması

Mekanik biyolojinin hastalık ilerlemesindeki rolünü anlamak için hücre mekaniğini invaziv olmayan değerlendirmek için Brillouin spektroskopisini kullanıyoruz. Brillouin spektroskopisi gibi invaziv olmayan teknolojiler, örneğini rahatsız etmeden mekaniği üç boyutta karakterize etmemize olanak tanır. Başlangıç olarak, mikrokuyu plakasının kuyularını her kuyuya 500 mikrolitre anti-yapışma durulama çözeltisi ekleyerek önceden işleyin.

Plakayı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1.300 g santrifüjlen. Hava kabarcıkları giderildikten sonra, kuyulardan yapışma önleyici durulama çözeltisini çıkarın. Sonra, her kuyuya bir mililitre PBS ekleyin ve tamamen aspire edin.

PBS yıkamasını tekrarladıktan sonra, deneysel tasarıma göre küre başına hücre sayısını ve jel başına sferoid sayısını belirleyin. Hücreleri pellet edin ve onları bir mililitre takviyeli DMEM'de yeniden süzülün. Sonra bu hücre süspansiyonundan bir mililitre mikro kuyu plakasının bir kuyusuna ekle iyi karıştır.

Plakayı oda sıcaklığında üç dakika boyunca 100 gramda santrifüjlen. Mikro kuyu plakasını mikroskop altında inceleyerek hücrelerin eşit dağılımını ve kuyunun dibine yerleştiğini doğrulayın. Hücreleri 37 derece Celsius sıcaklığında %5 karbondioksit ile 24 saat boyunca kuluçka altına alın, böylece küre oluşumu sağlanır.

Küreleri toplamak için, kültür medyasını nazikçe ve yavaş yavaş çıkararak sferoidleri rahatsız etmeden. PBS/FBS kaplı pipet ucunu keserek açıklığı genişletin ve küreleri yerinden çıkarmak için her kuyuya 500 mikrolitre PBS ekleyin. Sferoidleri içeren PBS'yi bir tüpe toplayın.

Sonra 50 mikrolitre sferoid süspansiyonu 96 kuyruklu bir plakanın bir kuyusuna aktarın. Saymayı kolaylaştırmak için, kalıcı bir işaretleyici kullanarak kuyunun dibine bir haç çizin ve bu hacimdeki küre sayısını mikroskop altında sayın. Denklemi kullanarak toplam küre sayısını hesaplayın.

SpectraLok yazılımını açın ve bağlı tüm cihazlar tespit edilene kadar bekleyin. Sonra spektrometre kamerasını seçin. Akrilik küpü mikroskop numune tutucusuna şeffaf tarafı objektif merceğe bakacak şekilde takın.

Objektif lensi mümkün olduğunca aşağı indirin ve küpü altındaki ortaya yerleştirin. Spektrometre kamerasının pozlanması için spektrometre kamerasının pozlanması için optik yolunun ayarlandığından emin olun; döner port seçicisini SpectraLok Kamera penceresine L.In çevirin, sensör pozlama süresini 500 milisaniyeye ve Yazılım Kazancını 100'e ayarlayın. Yakalama tuşuna basın ve objektif lensi yavaşça yukarı doğru hareket ettirin.

Merceği Brillouin zirveleri görünür hale gelene ve yoğunlukları stabil olana kadar kaldırmaya devam edin; bu da odak noktasının akrilik küp içinde konumlandığını gösterir. Şimdi, Pump Killer veya PK kontrol penceresini açın. En parlak Brillouin siparişlerinden birine yakınlaştırın ve basınç aktüatörü konumunu hareket ettir rel'e tıklayarak 100 mikrometre aralıklarla ayarlayarak Rayleigh zirve yoğunluğunu en aza indirin.

Rayleigh sinyali artarsa, ayar yönünü değiştirmek için Geri Geri tuşuna tıklayın. Rayleigh zirve yoğunluğu azaldığında, etalon basıncını 10 mikrometrelik küçük adımlarla ince ayarlayın. Kamera penceresinde Brillouin emirlerinden birine yakınlaştırın.

S tuşuna basarak LUT'un kamera görüntüsüne uygulandığı şeritleri görselleştirin. Ayarlar penceresini açın ve Hızlı Kalibrasyon tuşuna basarak çizgilerin optimal yatay ofsetini otomatik olarak yeniden hesaplayın. Şerit hizasını doğruladıktan sonra, Pump Killer'den spektrometreye ışığın bağlanma verimliliğini maksimize etmek için kollimatör lens eksenlerini ayarlayın.

Sonra Spectrum penceresini açın ve spektrumu almak için Unwrap'a tıklayın. Homojen bir akrilik küpte, Rayleigh sinyalinin tamamen bastırılmasını hedefleyin ve Brillouin sinyalini net görünene kadar ayarlayın. Optimize edilmiş parametreleri kaydetmek için Hepsini Yenile'ye tıklayın ve ardından PK kontrol penceresinde Hepsini Kaydet.

Son olarak, ana pencerede yapılandırmayı kaydetmek için Dosya G/Ç bölümünde Kaydet'e tıklayın. Tarama yazılımını açtıktan sonra, akrilik küp yerine hidrojel sferoid örneği içeren cam tabanlı Petri kabını takın. Petri kabı kapağını çıkarın, jelin batırılması için yeterli malzeme ekleyin ve jel hareketini önlemek için üstüne bir kapak koyun.

Önce lazer ışınını engelleyerek küreyi bulun. Mikroskop optik yolunu okul merceğine geçirin ve beyaz ışık aydınlatmasını açın. Joystick'i kullanarak sample aşamasını manuel olarak kontrol ederek küreyi bulup ona odaklanın.

Küre için parlak alan görüntüsünü alın ve kontrol çarkını döndürerek aydınlatma parlaklığını ayarlayın. Mikroskop kamerasını pozlamak için optik yolu R'ye çevirin ve pozlama süresini gerektiği gibi ayarlayın. Sonra, mikroskop portunu L olarak ayarlayın ve lazer hâlâ bloklanmış iken arka planı yakalayın.

Lazeri açın ve istenen sinyal-gürültü oranına bağlı olarak 200 ile 500 milisaniye arasında bir pozlama süresi seçin. Açılan spektrumdan, Brillouin zirve oturma serisini seçin. Eşik değerini yaklaşık Brillouin zirve yoğunluğunun yarısına ayarlayın ve eşiğin altında genliğe sahip herhangi bir Brillouin zirvesi hariç tutulur.

Lazerin tüm tanımlanan Brillouin tepe çiftlerine göre dalga boyu düzeltmesi uygulanır. Son olarak, tarama genişliğini ve adım boyutunu ayarlayarak raster tarama geometrisini seçin ve ölçümleri kaydetmek için taramaya başlayın. Hidrojel içine gömülü mezenkimal kök hücre sferoidinin temsilci görüntüleri, belirgin Brillouin kayması ve Brillouin çizgi genişliği haritalarını, buna karşılık gelen parlak alan, çekirdekler ve aktin filament floresans görüntülerini gösterdi.

Düşük çözünürlüklü Brillouin frekans kaydırma haritası, parlak alan görüntüsünden elle izlenen kontura göre jel ve küre bölgelerine ayrıldı. Aşağı örneklemeden kaynaklanan belirsiz pikseller analizden dışlanırken, jel ve küre bölgeleri için net ikili maskeler oluşturularak BFS değerleri çıkarıldı. Yüksek ve düşük çözünürlüklü BFS haritalarının karşılaştırılması, çekirdek örnekleme, yüksek çözünürlüklü taramalarla karşılaştırılabilir ortalama BFS değerleri sağladığını ve bu da küre kütle mekaniğinin tutarlı ölçümünü gösterdiğini gösterdi.

Protokolümüz, araştırmacıların mekanobiyoloji ile bağlantılı birçok hastalığı incelemesini sağlayacak bir platform sağlayacaktır. Hücre mekanik özellikleriyle ilişkili Brillouin kayması değişikliklerinin hastalık ilerleme aşamaları için etkili bir gösterge olup olmadığını görmek ilginç olacak. İlaç tedavilerinin hastalık ilerlemesini taklit eden zaman ölçekleri boyunca sferoid mekaniği nasıl etkilediğini değerlendireceğiz.