Bir İnsersiyonel Mutajenez Hücre Kütüphanesinde İşlevsel Olarak İlgili Lentivirus Entegrasyon Bölgelerinin Tanımlanması

İnsan genomundaki fonksiyonel unsurları tanımlamaya ve karakterize etmeye odaklanarak fonksiyonel genomik alanında araştırmalar yürütüyoruz. Ana ilgi alanımız, potansiyel rollerini ve insan biyolojisine ve hastalığına nasıl katkıda bulunabileceklerini daha iyi anlamak için genomun henüz iyi tahsis edilmemiş kısmını keşfetmektir. Mevcut ters genetik araçlarının, spesifik olmayan etkiler ve karmaşık SSI veya SGI kütüphaneleri oluşturmada yüksek maliyet gibi bazı sınırlamaları vardır.

Diğer bir zorluk, bu yöntemin yalnızca tahsis edilmiş genomik unsurları hedefleyebilmesi ve genomun büyük bir bölümünü keşfedilmemiş halde bırakabilmesidir. Burada geliştirilen protokol, hem protein kodlayan hem de uzun kodlayan gözlerde yeni fonksiyonel ekzonlar da dahil olmak üzere daha önce bilinmeyen genomik elementleri tanımlamak için yeni bir yaklaşım sunmaktadır. Başlamak için, 50 mikrolitrelik bir reaksiyonda doğrusal bir PCR için bir şablon olarak lentivirüs bazlı bir insersiyonel mutajenez hücre kütüphanesinden izole edilen genomik DNA'yı kullanın. Sonra.

burada PCR tüpünde gösterilen diğer gerekli reaktifleri ekleyin. Verilen PCR koşulları altında standart bir termodöngüleyicide 50 döngü doğrusal PCR gerçekleştirin. PCR ürünlerini yeni, temiz, 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

PCR ürünlerini 10 mikrolitre biotin-streptavidin manyetik boncuk ile iyice karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında iki saat inkübe edin, metal bir banyoda 400 RPM'de çalkalayın. Ardından, boncukları toplamak için manyetik bir stand kullanın ve süpernatanı dikkatlice çıkarın. Boncukları 300 mikrolitre bağlayıcı veya yıkama tamponu ile altı kez yıkayın ve her yıkamadan sonra süpernatanı atın.

İkinci iplik sentezi için, boncukları bir PCR tüpünde Klenow fragman tamponu, DNTP karışımı ve P24N5 primer içeren 6 mikrolitrelik bir reaksiyon hacminde yeniden süspanse edin. Karışımı bir PCR termocycler'da 15 santigrat derecede 20 dakika önceden inkübe edin, ardından reaksiyon karışımına iki birim Klenow parçası ekleyin. Karışımları verilen koşullar altında bir PCR termosiklerde inkübe edin.

Ardından, PCR ürünlerini yeni ve temiz 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Boncukları yakalamak ve süpernatanı atmak için manyetik bir stand kullanın. Bundan sonra, boncukları dört santigrat derecede 300 mikrolitre DNaz ve RNaz içermeyen damıtılmış su ile nazikçe yıkayın.

Boncukları toplayın ve süpernatanı atın. Boncukları, bir PCR tüpünde Taq tamponu, Taq DNA polimeraz, primer P5, DNTP karışımı ve primer 3-LTR_Nest içeren 25 mikrolitrelik bir PCR reaksiyon hacminde yeniden süspanse edin. PCR'yi burada gösterilen ayarlarla bir termodöngüleyicide gerçekleştirin.

Primer Illumina P5 ve primer Illumina P73-LTR ile bir sonraki PCR reaksiyonu turu için şablon olarak beş mikrolitre PCR ürünü kullanın. PCR'yi verilen koşullar altında bir termodöngüleyicide gerçekleştirin. Ardından, PCR ürünlerini 1,5 mililitrelik temiz bir santrifüj tüpüne aktarın.

Boncukları 30 dakika boyunca iki ila sekiz santigrat derece arasında oda sıcaklığına dengeledikten sonra, boncukları ters çevirerek veya girdaplayarak iyice karıştırın. Boncukların hacminin 1,2 katını temiz bir 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne pipetleyin. PCR ürünlerini boncuklara ekleyin ve 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.

DNA'nın onlara bağlanmasına izin vermek için boncukları inkübe edin. Ardından, numuneleri manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve çözelti berraklaştığında süpernatanı çıkarın. Şimdi boncukları 200 mikrolitre% 80 etanol ile yıkayın.

Oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin ve süpernatanı çıkarın. Boncukları oda sıcaklığında, kapak açıkken yaklaşık beş dakika havayla kurutun. Şimdi, tüpü manyetik standdan çıkarın.

22 mikrolitre DNaz ve RNaz içermeyen damıtılmış su ekleyin. 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın ve oda sıcaklığında iki dakika bekletin. Çözelti berraklaşana kadar tüpü manyetik standa geri yerleştirin.

Ardından, 21 mikrolitre süpernatanı 1.5 mililitrelik temiz bir santrifüj tüpüne aktarın. Florometre ile konsantrasyonu ölçmek için, reaktifi ve tamponu bir ila 200 oranında karıştırarak çalışma çözeltisini hazırlayın. Tahlil standartlarını hazırlamak için her biri 190 mikrolitre çalışma solüsyonu ile 10 mikrolitre standart bir ve 10 mikrolitre standart iki karıştırın.

Karışımları iki ila üç saniye boyunca hafifçe girdaplayın. Daha sonra, saflaştırılmış PCR ürünlerinin bir mikrolitresini 199 mikrolitre çalışma solüsyonu ile karıştırarak tahlil örneğini hazırlayın. Karışımı iki ila üç saniye boyunca hafifçe girdaplayın.

Tahlil standartlarını ve tahlil örneklerini oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin, ışıktan koruyun, ardından florimetreyi açın. Ana menüden çift sarmallı DNA yüksek hassasiyetli test programını seçin. Kalibrasyon için standart olanı makineye yerleştirin ve ilk standardı ölçmek için standart okuma düğmesine basın.

Ardından, standart ikiyi yerleştirin ve ikinci standardı ölçmek için standart okuma düğmesine basın. Numune ölçümü için, numune ölçüm sayfasına gitmek için numuneleri çalıştır düğmesine basın. Tahlil örneğini içeren her bir tüpü yerleştirin ve konsantrasyonu elde etmek için okuma tüpü düğmesine basın.

Düşük kaliteli numunede, 83 baz çifti civarında baskın bir tepe noktası, adaptör dimer kontaminasyonunu gösterir. Buna karşılık, yüksek kaliteli NGS kütüphanesi, başarılı bir kütüphanenin profilini yansıtan 150 ile 1.500 baz çifti arasındaki ana zirveleri görüntüler.