Name: Hava Yollarındaki Mantar Sporlarının Mekansal Dinamiklerini Koruyan Murin Akciğerlerini Görüntülemek için Etkili Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Keşfedin, hava yolları içeriğini koruyan murin akciğer görüntüleme yöntemiyle Coccidioides posadasii mantar sporlarının akciğerdeki doğal konumunu ve epitel hücreleriyle etkileşimini floresan mikroskopi ile analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu protokolde anlatılan tüm yöntemler Rutgers Biyomedikal Sağlık Bilimleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Sporları hücre içi floresan ile etiketleyin
<ol>
	<li>30 ° C'de 30 dakika boyunca 5 μM'de karboksifloresein süksinimidil ester (CFSE), Cell Tracker Orange veya Cell Tracker Red (veya tercih edilen hücre içi boya) içinde 1 x 106 sporu boyayın, ardından PBS ile yıkayın ve sporları 12.000 x g'da döndürün. Bu yıkamayı bir kez tekrarlayın.</li>
	<li>Spor aşısını, 25 μL'nin bir fare için uygun spor dozunu içermesi için uygun konsantrasyonda hazırlayın.</li>
</ol>
2. İzofluran anestezisi kullanılarak aspirasyon inhalasyonu yoluyla farenin sporlarla aşılanması
DİKKAT: İzofluran uçucu bir anestezik ajandır ve kanallı bir biyogüvenlik kabini veya çeker ocak içinde kullanılmalıdır.
<ol>
	<li>İzofluran maruz kalma kavanozunu hazırlamak için, katlanmış bir peçeteyi 1 L'lik vidalı Nalgene kavanozuna yerleştirin ve fareler için bir platform olarak peçetenin üzerine plastik bir ağ çemberi yerleştirin. Peçeteye 2 mL izofluran ekleyin, kavanozu kapatın ve gazın kapta dengelenmesi için 1-2 dakika bekleyin.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig01.jpg"> 
Şekil 1: Spor aşılamasının izofluran açık damla yöntemi için aparat. 1 L'lik vidalı bir kavanozun dibine katlanmış bir peçete yerleştirilir ve daha sonra fareler için bir platform görevi görmesi için dairesel bir plastik ağ yerleştirilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<ol start="2">
	<li>Fareyi anesteziye maruz bırakmadan önce, 25 μL inokülum içeren bir pipet hazırlayın. Fareyi izofluran kabına yerleştirin ve farenin bilincini kaybettiği ve baş aşağı olduğu doğrultma refleksinin kaybını izlemek için kabı eğin. Bu genellikle yaklaşık 10 saniye sürer.</li>
	<li>Solunum hızını (RR), dinlenme RR'sinin yaklaşık% 50'si olan dakikada 50-80 nefese (bpm) yavaşlayana kadar izleyin. Bu genellikle 10 saniye daha sürer. Bu sırada, fareyi izofluran kavanozundan çıkarın. NOT: Bu, anestezinin hızlı bir şekilde indüksiyonunu üretecek yüksek bir izofluran konsantrasyonudur ve farenin çok yakından izlenmesi gerekir. Ölümcül izofluran doz aşımı bir risktir, çünkü izofluran konsantrasyonu değişken olabilir ve izoflurana doz-yanıt eğrisi çok diktir. Solunum hızı 50 bpm'nin altına düşerse ve/veya düzensizse, fareyi izoflurandan çıkarın, 3-5 dakika iyileşmesine izin verin ve tekrar deneyin (en fazla iki tekrarlanan deneme).</li>
	<li>Ayak parmağı sıkışmasına yanıt vermeyerek anestezik derinliği onaylayın. Ardından, fareyi bir elinizle sırtüstü pozisyonda konumlandırın ve farenin artan hızda (50-60 bpm'den başlayarak) ve kuvvetle 3-5 düzenli nefes almasına izin verin. Bu başladığında, pipet ucunu fare orofarenksinin arkasına yerleştirin ve bir inhalasyon sırasında aşıyı serbest bırakın. NOT: Ağızdan gelen bu nefesler, nefes almak için aksesuar kasların işe alınması nedeniyle başı aşağı doğru sarsar. Bu nefes alma sırasında pipet yerleştirildiğinde, her nefes alışta ağzın açılması gerekir. Ağız açılmazsa, fare yeterince uyuşturulmaz ve muhtemelen orofarenksten gelen içeriği solumaz. Pipet, aşının yutulmasını önlemek için dili bastırmalı, ağzın altına ve önüne doğru itmelidir. Pipet ağızda olduğunda ve fare yeterince uyuşturulduğunda, fare her nefeste ağzını açacaktır.</li>
	<li>El ve başparmak fareyi tutarken, aşının solunduğunu doğrulamak için fare göğsünün arka ve ön yönlerinde çatırtı hissedin.</li>
</ol>
3. Farelerin ötenazisi
<ol>
	<li>Kurban zaman noktasından 10 dakika önce fareye intraperitoneal olarak 200 mg / kg ketamin ve 24 mg / kg ksilazin kokteyli enjekte edin.</li>
	<li>Enjeksiyondan sonra 10 dakika bekleyin, fare cerrahi bir anestezi düzlemine girene kadar bekleyin, bu da ayak parmağının sıkışmasına yanıt vermeme ile onaylanır.</li>
</ol>
4. PBS ve formalin ile akciğerlerin perfüzyonu
<ol>
	<li>Anestezi uygulanmış fareye% 70 etanol püskürtün. Farenin derisini geri kesmek için makas kullanın ve her taraftaki peritonu ortaya çıkarmak için cildi ayırın. Cildi farenin üst yarısından başının üzerinden çekin ve kolları deriden dışarı çekin.</li>
	<li>Periton zarını sternumda ve göğüs kafesinin alt yönü boyunca kesin ve peritonu açığa çıkarın. Diyaframı ortaya çıkararak karaciğeri inferior olarak değiştirin. Akciğerlerde bir delik açılmasını önlemek için diyaframı akciğer parankiminden dikkatlice delmek için makas kullanın. NOT: Yanlışlıkla akciğerlerin delinmesi, sonraki hava şişmesini imkansız hale getirecektir.</li>
	<li>Diyafram delindikten sonra, hava göğüs kafesine girer ve akciğerleri çökertir. Kalbi ortaya çıkarmak için sol taraftaki göğüs kafesini kesin. 5 G'lik bir iğne ile 30 G'lik bir iğne ile 5 saniyede 1 mL oranında (damarlara zarar vermemek için) sağ ventriküle 5-10 mL PBS enjekte edin ve akciğerleri hızla beyazlatın. DİKKAT: Formalin, kanallı bir biyogüvenlik kabini veya çeker ocak içinde taşınması gereken tehlikeli bir uçucu maddedir.</li>
	<li>Bittiğinde, iğneyi çıkarın ve 5 mL% 10 nötr tamponlu formalin (NBF) enjekte etmek için yeni bir iğne kullanın.</li>
</ol>
5. Perfüze akciğerin hava ile şişirilmesi
<ol>
	<li>Göğüs kafesinin ön yarısını çıkarın. Trakeayı ortaya çıkarmak için, üst kaburgaları ve köprücük kemiklerini boynun sağına ve soluna doğru kesin. Soluk borusunun uzanacağı orta çizginin yakınında kesmekten kaçınmaya dikkat edin. Forseps ile kalan üst kaburgaları ve köprücük kemiklerini boyun orta hattında sıkın ve trakea açığa çıkana kadar üstünden çekin.</li>
	<li>10 cm uzunluğunda bir dikiş ipliği hazırlayın, trakeanın altına çekin ve açıkta kalan trakeanın alt ucunda gevşek bir düğüm atın. 18 G kateter ile 1 mL'lik bir hava şırıngası hazırlayın. Maruz kalan bölgenin üst ucundaki trakeada bir delik açmak için 18 G'lik bir iğne kullanın.</li>
	<li>Kateteri bu deliğe yerleştirin ve havanın kaçmasını önlemek için nispeten sıkı bir uyum sağlayın. 1 mL havayı 10 saniye boyunca akciğerlere yavaşça enjekte edin ve tüm lobların akciğer şişmesini izleyin. Tam şişme, akciğerlerin kalbin etrafına hafifçe sarılması ve delinmemiş diyaframda kapladıkları hacmi doldurması ile sonuçlanır.</li>
	<li>Düğümü trakeanın etrafına sıkıca çekin ve kateteri çıkarın. Trakeayı tutun ve akciğerleri fareden çıkarmak için künt makas kullanın, akciğeri delmemeye dikkat edin.</li>
</ol>
6. Daldırma fiksasyonu ve dehidrasyon
<ol>
	<li>Akciğerleri 20 mL% 10 NBF ile doldurulmuş 50 mL'lik konik bir tüpün üst kenarına yerleştirin. Dikiş ipliklerini koninin dışında tutun, kapağı vidalayın ve konikleri ters çevirin, böylece akciğerler 20 mL NBF'de baş aşağı asılı kalır. 4 °C'de 24-48 saat bekletin.</li>
	<li>Akciğerleri PBS'de durulayın, ardından kriyoprezervasyona hazırlanırken akciğerleri kurutmak için 4 ° C'de 72-96 saat boyunca% 30'luk bir sükroz-PBS (w / h) çözeltisine koyun. Akciğerleri sakarozdan çıkarın, akciğerleri optimum kesme sıcaklığı (OCT) ortamına sahip bir kriyokalıba yerleştirin ve numuneyi -80 °C'de dondurun.</li>
</ol>
7. Kriyoseksiyon
<ol>
	<li>Kesitlemeden önce 1 saat boyunca OCT kriyobloklarındaki numuneleri kriyostatın -20 °C sıcaklığına dengeleyin. Blokları 20-100 μm kalınlıkta bölümlere ayırın. NOT: Hava şişirme, numunenin kırılganlığının artmasına neden olabilir ve artan kalınlıkta kesme, kesitleme sırasında doku kırılmasını önleyebilir.</li>
	<li>Bölümleri cam slaytlar üzerinde toplayın ve slayta doku yapışmasını sağlamak için 30 dakika ila 1 saat kurumaya bırakın. NOT: Slaytlar bu aşamada -80 °C'de tutulabilir.</li>
</ol>
8. Slayt hazırlama ve engelleme
<ol>
	<li>Slaytlardan OCT'yi çıkarmak için slaytları oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca PBS banyosuna (bir tabak veya Coplin kavanozunda) yerleştirin. NOT: Daha kalın bölümler (40-100 μm) cam slaytlara ve daha ince bölümlere yapışmayabilir, bu nedenle onları bir Coplin kavanozuna yan yatırmak yerine bir tabakta düz ve dik tutmak en iyisidir.</li>
	<li>OCT dokudan çözüldükten sonra slaytları kurutun. Doku örneğinin etrafındaki slaytın çevresinden fazla damlacıkları kurutmak için bir mendil kullanın. </li>
	<li>Numunenin etrafına bir çevre çizmek için hidrofobik bir Pap kalem kullanın ve 5 dakika kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Slayt başına 300 mL'de% 0.3 Tween-20 ve 1: 100 Fc Blok ile hayvansız engelleme çözeltisinden oluşan bir engelleme tamponu hazırlayın. NOT: Hücre içi hedefler için %1 Tween-20 kullanılabilir. 300 μL'lik bir hacim genellikle yeterlidir, ancak dokuyu tamamen kaplamak için gerekli hacim hidrofobik işaretleyicinin çevre boyutuna bağlıdır. Doku bu noktadan itibaren kurumamalıdır.</li>
	<li>Engelleme solüsyonunu RT'de 1 saat slaytlar üzerinde bırakın.</li>
</ol>
9. İmmün boyama
<ol>
	<li>Sıvıyı pipetleyerek ve 300-500 μL PBS ekleyerek slaytı yıkayın. Yıkamayı bir kez tekrarlayın.</li>
	<li>Birincil AlexaFluor-647 konjuge sıçan anti-fare EpCAM (klon G8.8) antikoru (hava yolu epitel belirteci)% 0.33 Tween-20 (veya hücre içi hedefler için% 1) ile hayvansız bloker çözeltisinde hazırlayın. Bu çözeltinin slaytı başına 300 μL ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de boyayın. NOT: Antikorlar, boyama konsantrasyonu, süresi ve sıcaklığı için ampirik olarak test edilmelidir. İnce kesitler (8-20 μm) 37 °C'de 30 dakika ve daha kalın kesitler (20-100 μm) gece boyunca 4 °C'de çoğu antikor için 1:100 seyreltme kullanılarak boyanır. Konjuge olmayan antikorlar kullanılıyorsa, 2x'i (yukarıdaki gibi) yıkayın ve ampirik olarak belirlenmiş bir süre ve sıcaklık için ikincil bir floresan antikor uygulayın. Genel olarak, ikincil antikor boyaması RT'de 1:1000 seyreltmede 1 saat boyunca yapılır.</li>
	<li>Antikor çözeltisini numuneden çıkarın ve slaytı 300 mL PBS ile 5 dakika boyunca yıkayın. Bu yıkamayı bir kez tekrarlayın. Slaytları kurutun, numunedeki ve çevresindeki camdaki tüm fazla sıvıyı çıkarın.</li>
	<li>Her bir doku parçasına bir damla RT yumuşak set montaj ortamı (örn. SlowFade Glass) ekleyin. Şişenin baş aşağı dururken oturmasına izin vererek ve her damlayı yavaşça dokuların üzerine bırakarak kabarcıkları önlemeye dikkat edin. Numunenin ve hidrofobik işaretleyici çevresinin ötesine uzanmak için uygun boyutta bir kapak fişi yerleştirin.</li>
</ol>
10. Floresan mikroskobu ile görüntüleme
<ol>
	<li>Tek tek sporları ve konakçı hücreleri çözmek için yeterli çözünürlüğe sahip bir objektif kullanarak tüm akciğer bölümlerini tarafsız bir şekilde taramak için çok kanallı bir floresan mikroskobu kullanın (örneğin, NA = 0.8 veya benzeri olan 20x yağ objektifi kullanan Zeiss Axioscan 7). NOT: Lazer gücünün ve PMT hacminintage kazancın, floresan eksi bir (FMO) kontrolü ile belirlenen arka plan üzerinde hedefin sinyal-gürültü oranlarını en üst düzeye çıkaracak şekilde ayarlandığından emin olun.</li>
	<li>Tüm akciğer lobunu yakalamak için yeterli görüntü döşemesi toplayın (ör. 400 μm x 400 μm boyutunda ~200 döşeme). Mikroskop yazılım programını (örneğin, Zeiss ZEN 3.7 veya benzeri) kullanarak birleştirilmiş döşeme görüntüsünü sonraki işleme için dışa aktarın.</li>
</ol>
11. QuPath ile mekansal analiz
<ol>
	<li>Ücretsiz bir açık kaynaklı yazılım olan QuPath'te14, bir proje dosyası oluşturun ve floresan görüntüleri dosyaya ekleyin.</li>
	<li>Üst menü seçeneği Sınıflandır'a, ardından Piksel sınıflandırması &gt; Eşitleyici Oluştur'a tıklayarak EpCAM+ piksellerini epitel olarak sınıflandırın. Hedef bölgeyi en iyi tanımlayan çözünürlüğü, kanalı, yumuşatma sigmasını ve eşik değerini seçin. Sınıflandırıcıyı benzersiz bir adla kaydedin ve Nesne Oluştur'u seçin.</li>
	<li>Yeni Nesne oluştur penceresinde, Ek Açıklama olarak Yeni nesne türü'nü seçin. Akciğer epiteli için minimum nesne boyutunu ve minimum delik boyutunu 100 mm2 olarak ayarlayın. Burada Nesneleri Böl'ü seçmeye gerek yoktur. Tamam'ı seçtikten sonra, ek açıklamalar oluşturulur ve sol üst taraftaki Fırça aracı kullanılarak gözle değiştirilebilir.</li>
	<li>Sporları sınıflandırmak için, sporların yakalandığı kanalı kullanarak 11.3-11.4 arasındaki adımları tekrarlayın ve yeni nesne türünü Ek Açıklama yerine Algılama yapın. Minimum nesne boyutunu ve minimum delik boyutunu 0 mm2 olarak ayarlayın ve Nesneleri Böl'ü seçin.</li>
	<li>Sporların uzamsal analizini yapmak için, Uzamsal Analiz &gt; Analiz &gt; Ek açıklamalara 2D işaretli mesafeyi hesapla üst menü seçeneğini seçin. Tespit edilen her spor için EpCAM+ epiteline olan mesafeler hesaplanacaktır. Bunları, Ölçümleri Dışa Aktar &gt; üst menü seçeneği aracılığıyla dışa aktarın.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Floresan Mikroskobu Analizi için Akciğerlerde Mantar Sporu Lokalizasyonunun Korunması

<ol><li>American Society for Microbiology. One Health: Fungal Pathogens of Humans, Animals, and Plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Report+on+an+American+Academy+of+Microbiology+Colloquium%22">Report on an American Academy of Microbiology Colloquium</a>. , Washington, DC. (2019).</li>
<li>Crossen, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+airway+epithelium+responses+to+invasive+fungal+infections%3A+A+critical+partner+in+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fungi+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Human airway epithelium responses to invasive fungal infections: A critical partner in innate immunity.</a> J Fungi (Basel). 9 (1), 40(2022).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-size+distributions+and+seasonal+diversity+of+allergenic+and+pathogenic+fungi+in+outdoor+air%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air.</a> ISME J. 6 (10), 1801-1811 (2012).</li>
<li>Thakur, A. K., Kaundle, B., Singh, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThakur%2C+AK+%22Mucoadhesive+Drug+Delivery+Systems+in+Respiratory+Diseases.Targeting+Chronic+Inflammatory+Lung+Diseases+Using+Advanced+Drug+Delivery+Systems%22">Mucoadhesive Drug Delivery Systems in Respiratory Diseases.Targeting Chronic Inflammatory Lung Diseases Using Advanced Drug Delivery Systems</a>. , Elsevier, Academic Press. (2020).</li>
<li>Darquenne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerosol+deposition+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Aerosol+Med+Pulm+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Aerosol deposition in health and disease.</a> J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 25 (3), 140-147 (2012).</li>
<li>Kradin, R. L., Mark, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+of+pulmonary+disorders+due+to+Aspergillus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pathol+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">The pathology of pulmonary disorders due to Aspergillus spp.</a> Arch Pathol Lab Med. 132 (4), 606-614 (2008).</li>
<li>Karnak, D., Avery, R. K., Gildea, T. R., Sahoo, D., Mehta, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endobronchial+fungal+disease%3A+An+under-recognized+entity%5BTitle%5D)+AND+%22Respiration%22%5BJournal%5D)">Endobronchial fungal disease: An under-recognized entity.</a> Respiration. 74 (1), 88-104 (2006).</li>
<li>Amich, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+light+sheet+fluorescence+microscopy+of+lungs+to+dissect+local+host+immune-Aspergillus+fumigatus+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-Aspergillus fumigatus interactions.</a> mBio. 11 (1), e02752-e02819 (2020).</li>
<li>Wiesner, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Club+cell+TRPV4+serves+as+a+damage+sensor+driving+lung+allergic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Club cell TRPV4 serves as a damage sensor driving lung allergic inflammation.</a> Cell Host Microbe. 27 (4), 614-628.e6 (2020).</li>
<li>Evans, S. E., Hahn, P. Y., McCann, F., Kottom, T. J., Pavlovic', Z. V., Limper, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumocystis+cell+wall+%CE%B2-glucans+stimulate+alveolar+epithelial+cell+chemokine+generation+through+nuclear+factor-%CE%BAB-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Pneumocystis cell wall β-glucans stimulate alveolar epithelial cell chemokine generation through nuclear factor-κB-dependent mechanisms.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (6), 490-497 (2005).</li>
<li>Bauer, C., Krueger, M., Lamm, W. J. E., Glenny, R. W., Beichel, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lapdMouse%3A+associating+lung+anatomy+with+local+particle+deposition+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">lapdMouse: associating lung anatomy with local particle deposition in mice.</a> J Appl Physiol. 128 (2), 309-323 (2020).</li>
<li>Srirama, P. K., Wallis, C. D., Lee, D., Wexler, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+extra-thoracic+airways+and+deposited+particles+in+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Aerosol+Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging extra-thoracic airways and deposited particles in laboratory animals.</a> J Aerosol Sci. 45, 40-49 (2012).</li>
<li>Thomas, S. M., Bednarek, J., Janssen, W. J., Hume, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air-inflation+of+murine+lungs+with+vascular+perfusion-fixation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Air-inflation of murine lungs with vascular perfusion-fixation.</a> J Vis Exp. 168, e62215(2021).</li>
<li>Bankhead, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuPath%3A+Open+source+software+for+digital+pathology+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">QuPath: Open source software for digital pathology image analysis.</a> Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).</li>
<li>Davenport, M. L., Sherrill, T. P., Blackwell, T. S., Edmonds, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+and+inflation+of+the+mouse+lung+for+tumor+histology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology.</a> J Vis Exp. 162, e60605(2020).</li>
<li>Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+official+research+policy+statement+of+the+American+Thoracic+Society%2FEuropean+Respiratory+Society%3A+Standards+for+quantitative+assessment+of+lung+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for quantitative assessment of lung structure.</a> Am J Respir Crit Care Med. 181 (4), 394-418 (2010).</li>
<li>Gil, J., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+lining+of+bronchioles+after+perfusion-fixation+of+rat+lungs+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Extracellular lining of bronchioles after perfusion-fixation of rat lungs for electron microscopy.</a> Anat Rec. 169 (2), 185-199 (1971).</li>
<li>Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+fixation+of+lungs+for+structure-function+analysis%3A+credits+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+Respir+Environ+Exerc+Physiol%22%5BJournal%5D)">Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations.</a> J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 53 (2), 528-533 (1982).</li>
<li>Evans, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymeric+mucin+Muc5ac+is+required+for+allergic+airway+hyperreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The polymeric mucin Muc5ac is required for allergic airway hyperreactivity.</a> Nat Commun. 6, 6281(2015).</li>
<li>Galati, D. F., Asai, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence microscopy.</a> Curr Protoc. 3 (8), e842(2023).</li>
<li>Hickey, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy-An+outline+of+hardware%2C+biological+handling%2C+and+fluorophore+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy-An outline of hardware, biological handling, and fluorophore considerations.</a> Cells. 11 (1), 35(2021).</li>
<li>Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-drop+anesthesia+for+small+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Can+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Open-drop anesthesia for small laboratory animals.</a> Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).</li>
<li>Bodnar, M. J., Ratuski, A. S., Weary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+isoflurane+anesthesia+using+the+drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Mouse isoflurane anesthesia using the drop method.</a> Lab Anim. 57 (6), 623-630 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>18 G, 1 1/2 iğne (305185)</td><td>Fisher</td><td>305185</td><td></td></tr><tr><td>1 L&nbsp; Vidalı Kavanoz&nbsp; (Nalgene)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-823-33</td><td></td></tr><tr><td>Air-Tite Toplu Steril Olmayan Şırıngalar 10 mL Luer Lock</td><td>Fisher</td><td>14-817-175</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed Enjeksiyonu (ksilazin steril solüsyonu)</td><td>Akorn</td><td>59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Hayvansız Engelleyici ve Seyreltici, RTU</td><td>Vektör</td><td>SP-5035-100</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard Kanatlı Korumalı IV Kateter, BD Vialon Kateter Malzemeli 18 G x 1.88 BD</td><td></td><td>381547</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen Saflaştırılmış Sıçan Anti-Fare CD16/CD32 (Fare BD Fc Blok ve ticaret;)</td><td>BD</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Turuncu CMRA Boya</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0873640</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Labviva</td><td>75003</td><td></td></tr><tr><td>Coccidioides posadasii cts2 / ard1 / cts3 & Delta; &nbsp;</td><td>BEI Kaynakları</td><td>NR-166</td><td></td></tr><tr><td>Corning 70 mikron süzgeçler</td><td>VWR</td><td>10054-456</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM AlexaFluor647 monoklonal antikor</td><td>Biolegend</td><td>118211</td><td></td></tr><tr><td>Exel International HYpodermic İğneler 30 G x 1/2"</td> <td>Labviva</td><td>EN3012</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tek Kullanımlık Steril Şırıngalar (1 mL, Leur Slip) Fisher</td><td></td> <td>14-955-462</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz Monohidrat</td><td>Azer Scientific&nbsp;</td><td>ES17530-500G</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Vakumlu Gres</td><td>VWR</td><td>59344-055</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Çözelti 20 mM (5 mL)</td><td>ThermoFischer</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran USP</td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin Hidroklorür</td><td>Dechra</td><td>1000001250</td><td></td></tr><tr><td>KIMWIPES Hassas Görev Silecekleri (4.4" x 8.4")</td> <td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Lexer Bebek Makası</td><td>FST</td><td>14078-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Adson Forseps</td><td>FST</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Nötr Tamponlu Formalin (%10) (Azer Scientific)</td><td>Fisher</td><td>22-026-350</td><td></td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask doku kültürü şişeleri, T75, filtre kapakları</td><td>VWR</td><td>15708-134</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Soyulabilir-A-Way gömme kalıpları</td><td>Sigma</td><td>E6032-1CS</td><td></td></tr><tr><td>QuPath 0.5.1 Yazılım</td><td>Açık kaynaklı</td><td>https://qupath.github.io/</td><td></td></tr> <tr><td>İpek Sütür iplik boyutu 3/0</td><td>FST</td><td>18020-30</td><td></td></tr><tr><td>SlaytlarMicro Slaytlar Superfrost Plus&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Cam Yumuşak Set Antifade Mountant (2 mL)</td> <td>ThermoFischer</td><td>S36917</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT Bileşiği, Sakura Finetek</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>ThermoFischer</td><td>J20605. </td><td></td>AP</tr><tr><td>Vektör Laboratuvarları ImmEDGE Hidrofobik Bariyer Kalem 2'li</td><td>Set Fisher Scientific</td><td>NC9545623</td><td></td></tr><tr><td>VWR Mikro Kapaklı Camlar, Dikdörtgen (24 mm x 40 mm # 1.5)</td> <td>VWR</td><td>48393-230</td><td></td></tr><tr><td>Beyaz Plastik Hasır</td><td>MAPORCH</td><td>789862904922</td><td></td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>Fisher</td><td>BP9727-500</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioScan 7&nbsp;</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html</td><td>çok kanallı floresan mikroskop</td></tr><tr><td>ZEN 3.7 Yazılımı</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html</td><td>mikroskobu yazılımı</td></tr></tbody></table>

hava yollarındaki mantar sporlarının mekansal dinamiklerini koruyan murin akciğerlerini görüntülemek için etkili yöntem

Efficient Method for Imaging Murine Lungs that Preserves Spatial Dynamics of Fungal Spores in the Airways

Bu yöntem sonuçta, hava yollarını rahatsız etmeden bırakmak için fizyolojik hava şişirme kullanarak fare akciğerlerinin immünofloresan görüntülerini üretir. Daha da önemlisi, yol boyunca birden fazla kontrol noktası, protokolün bileşenlerinin başarıyla gerçekleştirildiğini onaylayacaktır. Aşılama sırasında, farenin arka göğüs duvarında sıvının hava yollarına girdiğini gösteren "çatırtılar" hissedilerek aşının aspire edildiğini doğrulamak önemlidir. Çatırtı hissi yoksa, farenin aşıyı yutmuş olması mümkündür. Fare akciğerlerinin PBS ile perfüzyonu, akciğerlerin beyaz benekleşmesine ve ardından tüm akciğerin tamamen beyazlaşmasına neden olmalıdır (Şekil 2A). Eksik beyazlatma varsa, sonraki formalin perfüzyonu akciğer parankiminin tüm bölgelerine ulaşmayacaktır (Şekil 2B). Akciğeri hava ile şişirirken, akciğerler fizyolojik boyuta ulaşana kadar yavaşça şişmelidir. Akciğerlerin içindeki havayı sabitlemek için trakeal sütürü bağladıktan sonra, akciğerlerin boyutu kasılmamalıdır. Eğer yaparlarsa, işlem sırasında akciğer muhtemelen delinmiştir.
Burada, hem hava ile şişirilmiş hem de formalin sıvı ile şişirilmiş akciğerlerde Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ sporları (yeşil) ve EpCAM+ kolumnar bronşiolar epitel (macenta) etiketli kesitlerin temsili görüntülerini gösteriyoruz (sırasıyla Şekil 3A,B). Bu sporlar esas olarak distal bronşiyoller içinde ve bu distal bronşiyollerin hemen bitişiğindeki alveolar boşluklarda, muhtemelen alveolar kanallarda birikir. Hava ile şişirilmiş fiksatif perfüze akciğerler, sporların bronşiolar epitelden biraz daha dağınık göründüğü sıvı fiksatiften ziyade, bronşiyoller içinde daha sık görülen ve bronşiollere daha yakın kümelenen sporları içerir (Şekil 3A). QuPath uzamsal analizi sayesinde, sporların bronşiyolden uzağa ve daha distal alveolar boşluklara dağılma seviyesini belirtmek için tek tek sporların en yakın EpCAM+ bronşiolar epitele olan mesafesini ölçüyoruz. Sıvı şişirmenin, fizyolojik hava şişirmesine kıyasla sporları bronşiyollerden daha uzağa dağıttığını gösteriyoruz (Şekil 4A,B). Hava şişirme vasküler perfüzyonu, bu sporların distal bronşiyollerde doğal yerleşimini korur ve intratrakeal fiksatif damlatma ile bu sporların daha distal alveoler boşluklara yapay olarak dağılmasını önler.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig02.jpg"> 
Şekil 2: Akciğer perfüzyonu başarı göstergesi. (A) Başarılı bir şekilde perfüze edilen akciğerler tamamen beyaz olacaktır. (B) Tam olarak perfüze edilmemiş akciğerler pembe veya benekli görünecektir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig03.jpg"> 
Şekil 3: Hava ile şişirilmiş formalin ile şişirilmiş akciğerlerde ve formalin ile şişirilmiş akciğerlerde spor dağılımının temsili görüntüleri. Hücre içi floresan sporlarının (yeşil), (A) hava ile şişirilmiş akciğerlerde (B) formalin ile şişirilmiş akciğerlere göre EpCAM+ bronşiolar epitele (macenta) daha yakın dağıldığı görülmektedir. Her tedavi grubundaki farelerin sol loblarının arka yüzeyinden 1.2 mm derinliğinde kesitlerden 20x büyütmede çok kanallı floresan mikroskopta görüntüler elde edildi ve karolar mikroskopi yazılımı kullanılarak dikildi. Ölçek çubuğu = 800 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig04.jpg"> 
Şekil 4: Hava ile şişirilmiş ve formalin ile şişirilmiş spor ile tedavi edilmiş akciğerler arasındaki bronşiolar epitele spor mesafesinin (mm) karşılaştırılması. Tedavi grubu başına 3 fareden alınan akciğerler, 1 x 106 Coccidioides posadasii cts2 / ard1 / cts3Δ artrokonidia ile aşılamayı takiben 1.5 saat boyunca toplandı, işlendi ve görüntülendi. Fare başına dört kesit, sol lobun arka yüzeyinden 0.8 mm, 1.2 mm, 1.6 mm ve 2.0 mm'de örneklendi, boyandı ve çok kanallı bir floresan mikroskopta görüntülendi. Her gruptaki tüm sporlar, (A) en yakın EpCAM+ kolumnar bronşiolar epitele olan mesafeyi belirlemek için QuPath'te tespit edildi ve uzamsal olarak analiz edildi ve (B) medyan ve% 95 güven aralıkları mikrometre birimlerinde görüntülendi. Hava şişirme sporları, n = 11,673. Sıvı enflasyon sporları, n = 9,837. Normallik olmaması nedeniyle Mann-Whitney t-testi yapıldı ve p &lt; 0.0001 idi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Hava Yollarındaki Mantar Sporlarının Mekansal Dinamiklerini Koruyan Murin Akciğerlerini Görüntülemek için Etkili Yöntem

Fungi infect humans when environmental spores are inhaled into the lungs. The lung is a heterogeneous organ. Conducting airways, including bronchi and ...

efficient-method-for-imaging-murine-lungs-that-preserves-spatial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz patojenleri fagosite veya nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NET) üretirken enfekte akciğerlerde nötrofil granülositler dinamiklerinin gözlem için 2-foton mikroskopi nasıl kullanılacağını göstermektedir.

2-foton Mikroskop kullanarak Enfekte Akciğerler Nötrofiller Fagositoz ve NET-oluşumu Doğrudan Gözlem

Bu videoda, şişirme için agaroz kullanarak kanser hücreleri ve stromal hücreler arasındaki etkileşimleri incelemek için akciğerleri ex vivo canlı görüntüleme için hazırlama yöntemi açıklanmaktadır. Örnek protokolde, canlı hücresel etkileşimleri gözlemlemeden önce agaroz şişirme prosedürü açıklanmaktadır.

Tüm Akciğer Agaroz Enflasyonu: Akciğerleri Ex vivo Canlı Görüntülemeye Hazırlama Yöntemi

Farelerde floresan haberci kullanılarak, akciğer metastazı olan tümör hücre stromanın etkileşimleri ex vivo canlı görüntüleme için nispeten basit bir yöntem tarif eder. iplik disk konfokal mikroskopi kullanılarak, bu teknik, en az 4 saat boyunca canlı hücre görüntülenmesini sağlayarak ve diğer enflamatuar akciğer koşulları incelemek için adapte edilebilir.

Ex Akciğer Metastaz ve Bunların mikroçevresinin Canlı Görüntüleme vivo

Bu protokol, vakumla stabilize edilmiş bir görüntüleme penceresi kullanarak sağlam akciğerin gerçek zamanlı olarak uzun süreli yüksek çözünürlüklü, tek hücreli görüntülemesini gerçekleştirmek için çoklu foton mikroskobunun kullanımını açıklar.

Bir Vakum Stabilize Görüntüleme Penceresi ile Akciğer uzun vadeli Yüksek Çözünürlüklü Intravital Mikroskopi

Biz bir non-invaziv multimodal bleomycin Çift Kişilik boğaza korumak tarafından indüklenen fare akciğer fibrozis modelinin boyuna değerlendirmesi için mikro-CT ve floresan moleküler tomografi dayalı yaklaşım Imaging tanımlamak.

Yaklaşım Imaging Multimodal Bleomycin kaynaklı akciğer fibrozis farelerde boyuna değerlendirmesi için mikro-CT ve floresan moleküler tomografi dayalı

Biz gazeteci enzim floresan (REF) kullanarak Mycobacterium tüberküloz ile (M. tuberculosis) enfekte farelerin optik görüntüleme açıklar. Bu iletişim kuralı M. tuberculosis hassas ve belirli algılama Patogenez, tedavi ve aşı araştırma için önceden klinik hayvan modellerinde kolaylaştırır.

Mycobacterium tüberküloz ile muhabir enzim Floresans farelerde görüntüleme

Burada tarif biz miktar histolojik bölümlerde boyama Gomori'nın değiştirilmiş methanamine gümüş tarafından invazif aspergillosis ile farelerde akciğer mantar yükünü belirlemek için bir iletişim kuralı. Bu yöntemin kullanılması için mantar yükünün değerlendirmesi akciğer mantar DNA kantitatif PCR ile karşılaştırıldığında daha az hayvan ile karşılaştırılabilir sonuçlarında sonuçlandı.

Deneysel aspergilloz akciğer mantar yükünü belirlemek için histolojik miktar

Bu çalışmada, biz iki fotonlu intravital görüntüleme ve hücre etkileşim fare trakeal mukoza grip virüsü ile enfeksiyon sonra çözümlemesi için bir protokol mevcut. Bu iletişim kuralı bağışıklık hücre dynamics sırasında solunum yolu enfeksiyonları eğitim araştırmacılar için ilgili olacaktır.

İki fotonlu Intravital mikroskobu kullanılarak grip virüsü enfeksiyonu sırasında trakeal mukozasında görüntüleme hücre etkileşimi

Bu yayında, çift modalite radyonüklid görüntüleme kullanarak in vivo farelerde hava yolu mukozirary boşluğunu (MCC) değerlendirme protokollerini açıklıyoruz. Bu protokol, çift SPECT/CT sisteminde fare tüm gövde (MWB) kolimatörleri kullanılarak tek bir foton emisyonlu bilgisayarlı tomografi (SPECT) ve bilgisayarlı tomografi (BT) alma protokolü için tasarlanmıştır.

Farelerde Mukozdiliyel Temizliğin In vivo Değerlendirilmesi

Aspergillus fumigatus conidia'nın (3 μm boyutunda) farelerin hava yollarında dağılımının nicel analizi için yöntemi açıklıyoruz. Yöntem ayrıca çeşitli patolojik durum modellerinde hava yollarındaki mikropartiküllerin ve nanopartikül aglomera dağılımının analizi için de kullanılabilir.

Tüm Mount Optik Olarak Temizlenmiş Fare Akciğerinde Aspergillus fumigatus Conidia Dağılımının Konfokal Lazer Tarama Mikroskopi Tabanlı Nicel Analizi

Burada, zayıflatılmış BSL-2 onaylı Mycobacterium tuberculosis'un intravital görüntüleme protokolünü sunuyoruz. sürün akciğerinde kalıcı akciğer penceresi kullanarak. Bu yaklaşım, aynı akciğer mikro ortamında bakteriler lokalizasyonu, damar dinamikleri ve makrofaj alımı dahil olmak üzere erken konakçı-patojen etkileşimlerinin uzunlamasına, tek hücre çözünürlüklü analizini mümkün kılar.

Erken Intravasküler Enfeksiyonda Sönmüş Oksotrofik Mycobacterium Tuberculosis'in Sönük Oksotrofik Mycobacterium Tuberculosis'in Erken Intravasküler Enfeksiyonda

Keşfedin, hava yolları içeriğini koruyan murin akciğer görüntüleme yöntemiyle Coccidioides posadasii mantar sporlarının akciğerdeki doğal konumunu ve epitel hücreleriyle etkileşimini floresan mikroskopi ile analiz edin.

Hava Yollarındaki Mantar Sporlarının Mekansal Dinamiklerini Koruyan Murin Akciğerlerini Görüntülemek için Etkili Yöntem

Daha fazla video keşfet