Echinococcus granulosus'tan Küçük Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Dendritik Hücre Alımı

Araştırmamız, Echinococcus granulosus hücre dışı veziküllerinin karakterizasyonu ve parazit-konak etkileşimlerindeki rolleri üzerine odaklanmaktadır. Konak dendritik hücreler tarafından bileşim alımını ve immünomodülasyon üzerindeki potansiyel etkisini araştırıyoruz. E. granulosus EV'nin dendritik hücreler tarafından alındığını, olgunlaşmayı ve antijen sunumunu etkilediğini gösterdik. Ayrıca, EV kargosunda parazit-konak etkileşimlerini ve bağışıklık tepkilerini etkileyebilecek temel immünomodülatör ve antijenik proteinleri de tanımlıyoruz.

Protokolümüz, gelişmiş küçük EV üretimi için in vitro parazit kültürünü optimize eder ve yüksek kaliteli izolasyon sağlar ve immünomodülasyonu incelemek için dendritik hücre testlerini entegre eder. Bütün olarak veya parçalar halinde uygulanabilir. Gelecekteki araştırmamız, E. granulosus EV'lerin bağışıklık tepkileri üzerindeki in vivo etkilerini, aşı bileşenleri olarak potansiyellerini ve dendritik hücreler, mikrofajlar ve bu hücrelerin bağışıklık modelleri üzerindeki etkilerini araştıracaktır.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, ötenazi uygulanmış farenin ventral yüzeyini% 70 alkol kullanarak hidatik hastalığı ile temizleyin. Makas ve forseps kullanarak geliştirilen metacestodları çıkarmak için periton boşluğunu cerrahi olarak açın. Daha sonra, metacestod kütlelerini forseps kullanarak steril bir Petri kabına aktarın. Kistleri metacestod kütlelerinden serbest bırakmak için gerekirse forseps kullanarak bağ dokusunu çıkarın. Elde edilen metacestodları takviye edilmiş PBS ile dört santigrat derecede yıkayın. Şimdi, gerekli tüm bileşenleri kullanarak kültür ortamını hazırlayın ve çözeltiyi ters çevirerek hafifçe karıştırın. Hazırlanan kültür ortamının beş mililitresini her bir Leighton tüpüne aktarın. Parazitleri kültür ortamına ekleyin ve tüpleri ortamı değiştirmeden beş gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Parazit kültürü ortamını her Leighton tüpünden toplayın ve 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Toplanan ortamı 300 g'da dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Şimdi, süpernatanı 2.000 g'da dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Elde edilen süpernatanı bir pipet kullanarak 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Daha küçük hücre kalıntılarını gidermek için tüpü 10.000 g'da dört santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak, süpernatanı ultrasantrifüj rotoru için uygun bir tüpe aktarın. Tüpün bir tarafını bir işaretleyici ile işaretleyin. Ve tüpü işaretli tarafı yukarı bakacak şekilde rotora yerleştirin. Tüpleri 100.000 g'da dört santigrat derecede bir saat santrifüjleyin. Süpernatanı hızlı bir şekilde dökün ve tüpün bir dakika baş aşağı dinlenmesine izin verin. Kirletici proteinleri çıkarmak için peleti en az üç mililitre PBS ile yıkayın. Peletin olması beklenen işaretli tarafa odaklanarak, tüm tüp yüzleri boyunca bir pipet kullanarak peleti birden çok kez yeniden süspanse edin. Ultrasantrifüjlemeyi tekrarladıktan sonra, peleti 30 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Yeniden askıya alınan numuneyi 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücre dışı vezikülleri saklamak için eksi 80 santigrat derecede dondurun. Ötenazi yapılmış beş ila sekiz haftalık dişi CF-1 faresini bir doku kültürü başlığına yerleştirmeden önce etanol ile püskürtün. Fareyi sırtüstü pozisyonda bir diseksiyon tahtasına yerleştirin. Forseps ve diseksiyon makası kullanarak, üretranın üzerinde dikey bir T kesisi yapın ve yatay olarak alt ekstremitelerin tepesine uzatın. Forseps kullanarak, bacak kemiklerini ve dokularını ortaya çıkarmak için cildi her iki arka bacak boyunca ayırın. Ellerle, ayak bileğinden karın bölgesine doğru ittikten sonra her bir bacağın derisini çıkarın, cildi karşı tarafa çekin ve her iki bacağınızı da deriden serbest bırakın. Şimdi, makas ve forseps kullanarak uyluk kemiğini ve kaval kemiğini dikkatlice çıkarın ve kırılma olmadığından emin olun. Her kemiğin ucunu forseps ile sabitleyin. Ve kemiklerin etrafındaki kas fasyalarını çıkarmak için tendonları kesin. Kas dokusunu kağıt peçetelerle temizleyin. Çıkarılan her kemik, kalıntıları gidermek için iki mililitre takviye edilmiş tam RPMI ortamı içeren steril 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Ortamı attıktan sonra, kemikleri her seferinde beş dakika boyunca% 70 etanol ile iki kez yıkayın. Yıkanmış kemikleri steril bir Petri kabına aktarın ve kemik iliği hücrelerine erişmek için keskin diseksiyon makası kullanarak iki kemikli epifizleri kesin. Tam ortam içeren 20 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 25 gauge bir iğne kullanarak, dört kemiğin her birinden kemik iliği hücrelerini steril bir Petri kabına dikkatlice yıkayın. Ardından, kemik bağ dokusunu ve hücre topaklarını çıkarmak için pipetleme yoluyla ilik içeren ortamı nazikçe homojenize edin. Numuneyi steril 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın, hücreleri bağ dokusu ve kemik kalıntılarını gidermek için steril 70 mikrometre polipropilen hücre süzgecinden geçirin. Hücreleri 450 g'da dört santigrat derecede yedi dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve atın, peletin tüp duvarına yapıştığından emin olun. Hücreleri oda sıcaklığında bir dakika inkübe ettikten sonra, 500 mikrolitre RBC lizis tamponunda yeniden süspanse edin ve lizis tamponunu üç mililitre tam ortam ile nötralize edin. Hücreleri 450 g'da dört santigrat derecede yedi dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti beş mililitre tam ortamda yeniden süspanse edin. Numuneyi gösterildiği gibi filtreledikten sonra, bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Kültür ortamına mililitre başına 300 nanogram rekombinant murin FMS ile ilişkili tirozin kinaz üç ligand veya FLT3L ekleyin. Hücreleri, mililitre başına altı hücrenin gücüne bir kez 10 oranında bir konsantrasyonda çok kuyulu bir plaka içinde yerleştirin. Hücreleri% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 santigrat derecede yedi gün boyunca inkübe edin. Üçüncü günde, hücreleri rahatsız etmeden her kuyucuktan bir mililitre ortam çıkarın ve mililitre başına 150 nanogram rekombinant murin FLT3L ile desteklenmiş bir mililitre önceden ısıtılmış taze tam ortam ile değiştirin. Echinococcus granulosus larva aşamasından saflaştırılan hücre dışı veziküller veya EV'ler, dinamik ışık saçılımı ve transmisyon elektron mikroskobu ile onaylanan, esas olarak 50 ila 200 nanometre arasında değişen boyutlara sahip küçük EV'lerdi. Kemik iliği kaynaklı dendritik hücreler, küçük, yuvarlak hematopoietik hücrelerden sitoplazmik uzantılara sahip yıldız şeklindeki hücrelere ilerleyerek yedi gün boyunca morfolojik farklılaşma gösterdi. Bir saatlik inkübasyondan sonra, dendritik hücreler, konfokal mikroskopi ile onaylandığı gibi, endozomal-lizozomal bölmelerde MHCIII molekülleri ile birlikte lokalize olan floresan etiketli küçük EV'leri yakaladı.