Hücreden Arındırılmış Fare Akciğerleri ve Primer İnsan Endotel Hücreleri Kullanılarak Biyomühendislik Ürünü Akciğerin Transplantasyonu

Biyomühendislik insan boyutundaki organlar, genellikle akademik laboratuvarların kapasitesini aşan büyük miktarda kaynak gerektirir. Yinelemeli protokol geliştirme maliyetinin düşürülmesi, bu alandaki araştırma ilerlemesini hızlandıracaktır. Bu çalışmanın amacı, fare kalp-akciğer blokları kullanılarak akciğer biyomühendisliği için standardize edilmiş protokolü sağlamaktır. Organ biyomühendisliği için hangi hücrelerin uygun olduğu ve bu hücrelerin organ biyoreaktör kültürüne nasıl entegre edilmesi gerektiği hala bilinmemektedir. Ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir protokoller oluşturmak için birden fazla hücre türünün ve koşulun karşılaştırılması gerekir.

Fareler küçük ve kullanımı kolay deney hayvanlarıdır. Bununla birlikte, küçük olmalarına rağmen, akciğerin temel mimarisi memeliler arasında benzerdir. Bu küçük platformdaki protokolü optimize ederek, optimize edilmiş sonuçları hayvanların boyutlarına göre çarparak lazer hayvan modellerini ölçeklendirebiliriz. Bu fare boyutundaki akciğer biyomühendislik platformu, araştırmacıların kök hücrelerini verimli bir şekilde test etmelerini sağlar. Bu genetik olarak değiştirilmiş hücreler, tüm akciğer mühendisliği için kullanmak için değerli veya pahalı olabilir. Ek olarak, hastadan türetilen hücreler, in vitro hastalık modelleri oluşturmak için de kullanılabilir.

Mevcut çabalar, gerekli proliferasyon potansiyelini ve akciğer biyomühendisliği için diferansiyel kapasiteyi anlamak için birden fazla mühendislik kök hücre ve progenitör hücre türünün test edilmesini içermektedir. Uygun hücreler belirlendikten sonra, bu araştırma domuz gibi daha büyük bir hayvan modeline genişletilecektir.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, ötenazi fareyi cerrahi bir masaya sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve uzuvları sabitleyin. Sterilize etmek için göğüs ve karın yüzeyine eşit olarak% 70 etanol püskürtün. Daha sonra, paslanmaz makas kullanarak boyuna uzanan medyan çizgi boyunca karın boşluğunu açın ve sternumu ayırın. Diyaframı torasik duvardan rezeke edin. Torasik boşlukları ortaya çıkarmak için ventral göğüs duvarını kesin ve timusu çıkarın. 4/0 ipek sütür kullanarak, inferior vena kava ve sağ superior vena kava legate edilir. Drenaj için abdominal aortu paslanmaz makasla kesin. 27 gauge iğne ile donatılmış beş mililitrelik steril bir şırınga kullanarak, ventrikül duvarını delerek sağ ventriküle üç mililitre steril PBS enjekte edin. Ana pulmoner arterin etrafına 4/0 ipek sütür ilmek için Dumont forseps kullanın. Ardından, sağ ventrikül duvarına erişmek için yaylı makas kullanarak pulmoner arter kapakçıklarının altında iki milimetrelik bir pencere açın. Pulmoner arter kateterini pencereden yerleştirin ve önceden ilmekli 4/0 ipek sütür ile sabitleyin. Beş mililitrelik bir şırınga kullanarak pulmoner arter kateterinden yavaşça iki mililitre PBS enjekte edin. Trakeayı bir trakeal kateter ile kanüle edin ve 4/0 ipek sütür ile yerine bağlayın. Şimdi, boş beş mililitrelik bir şırınga kullanarak trakeal kateterden yavaşça iki mililitre hava enjekte edin. Akciğerlerden hava sızıntısı olmamasını sağlamak için havayı 10 saniye tutun. Kalp ve akciğer uç bloğunu çıkarın. Daha sonra, rezeke edilen kalp-akciğer bloğunu, akciğerlerin hücrelerden arındırılması için deiyonize su içeren 10 santimetre çapında plastik bir Petri kabına aktarın. Bloğu dört santigrat derecede bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, beş mililitrelik bir şırınga kullanarak, trakeal kateterden üç kez iki mililitre steril deiyonize su enjekte edin. Akciğerler geri teperken sıvının çıkmasına izin vermek için her enjeksiyondan sonra duraklayın. Benzer şekilde, pulmoner arter kateterinden iki mililitre su enjekte edin. Hem trakeal hem de pulmoner arter kateterlerine iki mililitre% 0.1 Triton X-100 çözeltisi enjekte edin. Kalp-akciğer bloğunu bir Petri kabına aktarın ve gece boyunca dört santigrat derecede Triton X-100 çözeltisinde statik olarak inkübe edin. Ertesi gün, Triton X-100 çözeltisini akciğerlerden çıkarmak için, trakeal kateter ve pulmoner arter kateterine iki mililitre deiyonize su enjekte edin ve bunları iki mililitre% 2 deoksikolat çözeltisi ile tekrarlayın. Deoksikolat çözeltisini akciğerlerden çıkardıktan sonra, hem trakeal hem de pulmoner arter kateterlerine iki mililitre bir molar sodyum klorür çözeltisi enjekte edin. Kalp-akciğer bloğunu bir saat inkübe edin. Sodyum klorür çözeltisini deiyonize su ile çıkardıktan sonra, trakeal ve pulmoner arter kateterlerine iki mililitre DNaz I çalışma çözeltisi enjekte edin. Kalp-akciğer bloğunu bir saat inkübe edin. DNaz I solüsyonunu çıkarmak için trakeal ve pulmoner arter kateterlerine steril PBS enjekte edin. Hücre çözmeden sonra, akciğerlerin kenarlarının beyaz ve şeffaf olduğunu onaylayın. Cam teneke kutuya 70 mililitre Endotel Hücre Büyüme Ortamı 2 veya EGM-2 kültür ortamı ekleyin ve kapatmak için silikon tıpayı teneke kutunun üzerine yerleştirin. Üç musluklar kullanarak bir silikon tıpa, bir cam teneke kutu, borulu GL45 vidalı kapak, 250 mililitrelik otoklavlanabilir bir cam şişe ve yem bağlantı parçalarına sahip L/S 14 boruyu monte edin. GL20 vidalı kapağın silikon septumuna 45 gauge bir iğne sokun. A, B ve C borularını, birinci ve üçüncü musluklara bağlı 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak kültür ortamıyla doldurun. Hücreden arındırılmış kalp-akciğer bloğunun pulmoner arter kateterini bir yem bağlantısı ile boru C'ye takın. Kateterde veya hortumda hava kabarcığı olmadığından emin olun. Endotel hücrelerinin yerçekimi güdümlü enjeksiyonu için, insan göbek damarı endotel hücrelerini veya HUVEC'leri içeren bir hücre rezervuarını manyetik bir karıştırıcı üzerine yerleştirin ve rezervuarın organ odasının 30 santimetre üzerinde olduğundan emin olun. Manyetik karıştırıcıyı 120 RPM hızında açın. Hücre süspansiyonunun hücre dışı iskeleye A hortumu, C borusu ve pulmoner arter kateteri aracılığıyla akmasına izin vermek için birinci ve ikinci muslukları açın. Organ kültürünün perfüzyonu için, organ odasını bir karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. Hortumu B'yi pulsatil bir pompaya bağlı bir pompa kafasına takın. Kuluçka makinesinin cam kapısını kapatın. Borunun kapı ile lastik conta arasına düzgün şekilde yerleştirildiğinden emin olun. Endotel hücrelerinin iskele içine yerleşmesine izin vermek için hücrelerden arındırılmış iskeleyi 37 santigrat derecede üç saat boyunca inkübe edin. Pompayı altı RPM hızında çalıştırın, bu da L/S 14 hortumu kullanarak dakikada iki mililitre ortam perfüzyonu ile sonuçlanır. Ortam perfüzyonu nedeniyle hücreden arındırılmış akciğerin hafifçe genişlediğini gözlemleyin. Ardından kuluçka makinesinin kapağını kapatın. Ortam değişimi yapmak için pompa tahrikini durdurun. Üçüncü musluk için 50 mililitrelik steril bir şırınga takın ve hazneden 50 mililitre ortam çekin. 50 mililitrelik steril bir şırıngayı 50 mililitre önceden ısıtılmış ortamla doldurun. Solüsyonu bir cam teneke kutuya enjekte edin ve medyayı, vananın uygun şekilde değiştirildiğinden emin olarak vana üç vasıtasıyla hazneye aktarın. Pulsatil pompayı yeniden başlatın. İki günlük perfüzyon organ kültüründen sonra yeniden kültürlenmiş kalp-akciğer bloğunu hasat edin. Fare akciğerleri, hücreden arındırmayı takiben beyaz ve yarı saydam göründü, bu da genel akciğer yapısını korurken hücresel bileşenlerin çıkarıldığını gösterdi. Deselüler fare akciğerlerinin histolojik analizi, hiçbir hücresel bileşeni kalmayan sağlam alveolar yapıları ortaya çıkardı. İki günlük perfüzyon bazlı biyoreaktör kültüründen sonra yedi HUVEC'in gücüne üç kez 10 ile yeniden hücrelenmiş fareler akciğerleri, HUVEC'lerin homojen dağılımını sergiledi. HUVEC'ler, recullularize akciğerlerde gözlendiği gibi, kılcal damar benzeri bir ağ oluşturarak periferik alveolar alanlara göç etti.