Name: Hücre Dışı Akı Biyoanalizörü Kullanılarak Kronik Etanole Maruz Kalan Alveolar Makrofajlar için Yakıt Kaynağı Olarak Glutaminin Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Keşfedin, kronik etanol maruziyetinin alveoler makrofajlarda mitokondriyal metabolizmayı ve glutamin oksidasyonunu nasıl etkilediğini. Bu yöntem immün fonksiyon bozukluklarını anlamak için güvenilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Etanol, glutamine bağımlı solunuma geçerek biyoenerjetik değerlerini bozar

<ol><li>2021 National Survey on Drug Use and Health (NSDUH). Table 5.6A - Alcohol Use Disorder in Past Year: Among People Aged 12 or Older; by Age Group and Demographic Characteristics, Numbers in Thousands, 2021. , Substance Abuse and Mental Health Services Administration (SAMHSA). At
 <a target="_blank" href="https://www.samhsa.gov/data/sites/default/files/reports/rpt39441/NSDUHDetailedTabs2021/NSDUHDetailedTabs2021/NSDUHDetTabsSect5pe2021.htm">https://www.samhsa.gov/data/sites/default/files/reports/rpt39441/NSDUHDetailedTabs2021/NSDUHDetailedTabs2021/NSDUHDetTabsSect5pe2021.htm</a> (2021).</li>
<li>Everts, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+pneumonia+in+adult+general+medical+and+surgical+patients+at+Christchurch+Hospital%5BTitle%5D)+AND+%22N+Z+Med+J%22%5BJournal%5D)">Nosocomial pneumonia in adult general medical and surgical patients at Christchurch Hospital.</a> N Z Med J. 113 (1111), 221-224 (2000).</li>
<li>de Roux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+alcohol+abuse+in+the+etiology+and+severity+of+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Impact of alcohol abuse in the etiology and severity of community-acquired pneumonia.</a> Chest. 129 (5), 1219-1225 (2006).</li>
<li>Moss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+sepsis%3A+race%2C+sex%2C+and+chronic+alcohol+abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of sepsis: race, sex, and chronic alcohol abuse.</a> Clin Infect Dis. 41 (Suppl 7), S490-S497 (2005).</li>
<li>Fernandez-Sola, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+alcohol+intake+as+a+risk+and+prognostic+factor+for+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">High alcohol intake as a risk and prognostic factor for community-acquired pneumonia.</a> Arch Intern Med. 155 (15), 1649-1654 (1995).</li>
<li>Yeligar, S. M., Harris, F. L., Hart, C. M., Brown, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+attenuates+ethanol-induced+alveolar+macrophage+oxidative+stress+and+dysfunction+by+downregulating+NADPH+oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glutathione attenuates ethanol-induced alveolar macrophage oxidative stress and dysfunction by downregulating NADPH oxidases.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306 (5), L429-L441 (2014).</li>
<li>Yeligar, S. M., Mehta, A. J., Harris, F. L., Brown, L. A., Hart, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+regulates+chronic+alcohol-induced+alveolar+macrophage+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor gamma regulates chronic alcohol-induced alveolar macrophage dysfunction.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 55 (1), 35-46 (2016).</li>
<li>Liang, Y., Harris, F. L., Brown, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+induced+mitochondrial+oxidative+stress+and+alveolar+macrophage+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Alcohol induced mitochondrial oxidative stress and alveolar macrophage dysfunction.</a> Biomed Res Int. 2014, 371593(2014).</li>
<li>Liang, Y., Harris, F. L., Jones, D. P., Brown, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+induces+mitochondrial+redox+imbalance+in+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Alcohol induces mitochondrial redox imbalance in alveolar macrophages.</a> Free Radic Biol Med. 65, 1427-1434 (2013).</li>
<li>Morris, N. L., Harris, F. L., Brown, L. A. S., Yeligar, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+induces+mitochondrial+derangements+in+alveolar+macrophages+by+upregulating+NADPH+oxidase+4%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Alcohol induces mitochondrial derangements in alveolar macrophages by upregulating NADPH oxidase 4.</a> Alcohol. 90, 27-38 (2021).</li>
<li>Crotty, K. M., Kabir, S. A., Chang, S. S., Mehta, A. J., Yeligar, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pioglitazone+reverses+alcohol-induced+alterations+in+alveolar+macrophage+mitochondrial+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Pioglitazone reverses alcohol-induced alterations in alveolar macrophage mitochondrial phenotype.</a> Alcohol Clin Exp Res (Hoboken). 48 (5), 810-826 (2024).</li>
<li>Demine, S., Renard, P., Arnould, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+uncoupling%3A+A+key+controller+of+biological+processes+in+physiology+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial uncoupling: A key controller of biological processes in physiology and diseases.</a> Cells. 8 (8), 795(2019).</li>
<li>Hill, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+cellular+bioenergetics+with+mitochondrial+quality+control+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy.</a> Biol Chem. 393 (12), 1485-1512 (2012).</li>
<li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bioenergetic+Health+Index%3A+a+new+concept+in+mitochondrial+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Sci+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">The Bioenergetic Health Index: a new concept in mitochondrial translational research.</a> Clin Sci (Lond). 127 (6), 367-373 (2014).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+mitochondrial+respiration+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+myeloid+progenitors+using+Seahorse+technology%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analyzing mitochondrial respiration of human induced pluripotent stem cell-derived myeloid progenitors using Seahorse technology.</a> STAR Protoc. 4 (1), 102073(2023).</li>
<li>Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+respiration+in+adherent+cells+by+Seahorse+XF96+Cell+Mito+Stress+Test%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test.</a> STAR Protoc. 2 (1), 100245(2021).</li>
<li>Plitzko, B., Loesgen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oxygen+consumption+rate+%28OCR%29+and+extracellular+acidification+rate+%28ECAR%29+in+culture+cells+for+assessment+of+the+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism.</a> Bio Protoc. 8 (10), e2850(2018).</li>
<li>Winnica, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+differences+in+the+airway+epithelium+of+lean+versus+obese+asthmatics+are+driven+by+nitric+oxide+and+reflected+in+circulating+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic differences in the airway epithelium of lean versus obese asthmatics are driven by nitric oxide and reflected in circulating platelets.</a> Antioxid Redox Signal. 31 (10), 673-686 (2019).</li>
<li>Nickens, K. P., Wikstrom, J. D., Shirihai, O. S., Patierno, S. R., Ceryak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioenergetic+profile+of+non-transformed+fibroblasts+uncovers+a+link+between+death-resistance+and+enhanced+spare+respiratory+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">A bioenergetic profile of non-transformed fibroblasts uncovers a link between death-resistance and enhanced spare respiratory capacity.</a> Mitochondrion. 13 (6), 662-667 (2013).</li>
<li>Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+related+bioenergetics+profiles+in+isolated+rat+cardiomyocytes+using+extracellular+flux+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Age related bioenergetics profiles in isolated rat cardiomyocytes using extracellular flux analyses.</a> PLoS One. 11 (2), e0149002(2016).</li>
<li>Dranka, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+bioenergetic+function+in+response+to+oxidative+stress+by+metabolic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling.</a> Free Radic Biol Med. 51 (9), 1621-1635 (2011).</li>
<li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets%2C+lymphocytes%2C+monocytes%2C+and+neutrophils%2C+and+the+oxidative+burst+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).</li>
<li>Tyrrell, D. J., Bharadwaj, M. S., Jorgensen, M. J., Register, T. C., Molina, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+cell+respirometry+is+associated+with+skeletal+and+cardiac+muscle+bioenergetics%3A+Implications+for+a+minimally+invasive+biomarker+of+mitochondrial+health%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Blood cell respirometry is associated with skeletal and cardiac muscle bioenergetics: Implications for a minimally invasive biomarker of mitochondrial health.</a> Redox Biol. 10, 65-77 (2016).</li>
<li>Shah-Simpson, S., Pereira, C. F., Dumoulin, P. C., Caradonna, K. L., Burleigh, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profiling+of+Trypanosoma+cruzi+life+stages+using+Seahorse+extracellular+flux+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profiling of Trypanosoma cruzi life stages using Seahorse extracellular flux technology.</a> Mol Biochem Parasitol. 208 (2), 91-95 (2016).</li>
<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J Vis Exp. 46, e2511(2010).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+I.+Kinetics+of+oxygen+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization.</a> J Biol Chem. 217 (1), 383-393 (1955).</li>
<li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Anal Chem. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li>
<li>Yeligar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARgamma+regulates+mitochondrial+structure+and+function+and+human+pulmonary+artery+smooth+muscle+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">PPARgamma regulates mitochondrial structure and function and human pulmonary artery smooth muscle cell proliferation.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 58 (5), 648-657 (2018).</li>
<li>Yeligar, S., Tsukamoto, H., Kalra, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-induced+expression+of+ET-1+and+ET-BR+in+liver+sinusoidal+endothelial+cells+and+human+endothelial+cells+involves+hypoxia-inducible+factor-1alpha+and+microrNA-199%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ethanol-induced expression of ET-1 and ET-BR in liver sinusoidal endothelial cells and human endothelial cells involves hypoxia-inducible factor-1alpha and microrNA-199.</a> J Immunol. 183 (8), 5232-5243 (2009).</li>
<li>Yeligar, S. M., Harris, F. L., Brown, L. A. S., Hart, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+reversal+of+post-transcriptional+alterations+implicated+in+alcohol-induced+alveolar+macrophage+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological reversal of post-transcriptional alterations implicated in alcohol-induced alveolar macrophage dysfunction.</a> Alcohol. 106, 30-43 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>15 mL konik tüp&nbsp;</td><td>VWR Uluslararası, Inc.</td><td>21008-670</td><td>Mitokondri ile ilgili reaktiflerin stok konsantrasyonlarını hazırlamak için kullanılır.</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol ve nbsp;</td><td>Sigma Aldrich A.Ş.</td><td>M6250</td><td>MH-S hücrelerini kültürlemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Hücre kazıyıcı</td><td>Dot Scientific, Inc.</td><td>70-1180</td><td>T-75 şişelerinden MH-S hücrelerini kazımak için kullanılır.</td></tr><tr><td>Kontes 3 FL Enstrüman: hücre sayacı</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>AMQAF2000</td><td>Deneyler için plakaya MH-S hücrelerinin sayısını saymak için kullanılır.</td></tr><tr><td>D-glikoz&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich A.Ş.</td><td>G8270</td><td>Hücre dışı akı baz ortamı için kullanılır.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific Company</td><td></td><td>4355720 MH-S hücreleri için deneysel tedavi.</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Sciencell Araştırma Laboratuvarları</td><td>500</td><td>MH-S hücrelerini kültürlemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma Aldrich A.Ş.</td><td>G1397</td><td>MH-S hücrelerini kültürlemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Hücre dışı akı baz ortamı için kullanılır.</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 10.2.3</td><td>GraphPad Yazılımı</td><td>N/A</td><td>İstatistiksel analiz için yazılım. https://www.graphpad.com/features'dan satın alındıktan sonra indirilebilir.</td></tr><tr><td>MH-S hücreleri</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>CRL-2019</td><td>Fare alveolar makrofaj hücre hattı.</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpü &nbsp;</td><td>ABD Bilimsel, Inc.</td><td>4036-3212</td><td>Mitokondri ile ilgili reaktiflerin çalışma konsantrasyonlarını hazırlamak için kullanılır.</td></tr><tr><td>Microsoft 365 Excel: bilgisayar elektronik tablo programı</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>Veri organizasyonu ve mitokondriyal biyoenerjetik hesaplamaları için yazılım. https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel'dan satın alındıktan sonra indirilebilir.</td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>15140122</td><td>MH-S hücrelerini kültürlemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su</td><td>VWR International, Inc.</td><td>45000-446</td><td>MH-S hücrelerini yıkamak için kullanılır.</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>VWR Uluslararası, Inc.</td><td>45000-396</td><td>MH-S hücrelerini kültürlemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Seahorse Wave Pro Software: tahlil tasarımı ve analizi için bilgisayar yazılım programı</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>N/A</td><td>Bilgisayar, Seahorse XF Pro Analyzer cihazına bağlıdır. Şuradan indirilebilir&nbsp; https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/software-download-for-seahorse-wave-pro-software?productURL=https%3A%2F%2Fwww.agilent.com%2Fen%2Fproduct%2Fcell-analysis%2Freal-time-cell-metabolic-analysis%2Fxf-software%2Fseahorse-wave-pro-software-2007523.</td></tr><tr><td>Denizatı XF Baz Ortamı: hücre dışı akı baz ortamı, pH 7.4</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>103334-100</td><td>Deneysel çalışmalardan önce mitokondri ile ilgili reaktiflerin stok ve çalışma konsantrasyonlarını hazırlamak ve MH-S hücrelerini kültürlemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Denizatı XF Glutamin Oksidasyon Stres Test Kiti</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>103674-100</td><td>Stok BPTES, oligomisin, FCCP ve rotenon / antimisin A içerir.</td></tr><tr><td>Seahorse XF Pro Analyzer: hücre dışı akı biyoanalizörü</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>N/A</td><td>Hücre dışı akı biyoanalizörü.</td></tr><tr><td>Denizatı XFe96 FluxPak: 96 oyuklu hücre dışı akı pak kartuşları, 96 oyuklu hücre dışı akı mikrokültür plakaları ve kalibrant çözeltisi</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>102416-100</td><td>Hücre dışı akı biyoanalizörü kullanarak tahliller için MH-S hücrelerini hazırlamak için kullanılır.</td></tr><tr><td>Serolojik pipet&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji A.Ş.</td><td>sc-550678</td><td>MH-S hücrelerinden ortamı çıkarmak için kullanılır.</td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>S6014</td><td>MH-S hücrelerini kültürlemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Sodyum piruvat&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich A.Ş.</td><td>P4562</td><td>Hücre dışı akı baz ortamı için kullanılır.</td></tr><tr><td>T-75 şişeleri</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji A.Ş.</td><td>sc-200263</td><td>MH-S hücrelerini kültürlemek için kullanılır.</td></tr></tbody></table>

hücre dışı akı biyoanalizörü kullanılarak kronik etanole maruz kalan alveolar makrofajlar için yakıt kaynağı olarak glutaminin değerlendirilmesi

Assessment of Glutamine as a Fuel Source for Alveolar Macrophages Exposed to Chronic Ethanol Using an Extracellular Flux Bioanalyzer

Kronik EtOH maruziyeti, MH-S hücrelerinde glutamin bağımlılığını azaltır. Glutaminoliz, mitokondriyal solunum için kritik bir yoldur ve glutamini hücresel biyoenerjetik için önemli bir yakıt kaynağı olarak destekler. EtOH'ye kronik maruz kalmanın, MH-S hücrelerinin mitokondriyal solunum için bir yakıt kaynağı olarak glutamin üzerindeki bağımlılığını değiştirip değiştirmediğini belirlemek için, MH-S hücreleri EtOH kontrolü (Con) veya EtOH olmadan tedavi edildi ve OCR, mitokondriyal solunum ile ilişkili reaktiflerin seri enjeksiyonlarına yanıt olarak zaman içinde ölçüldü. Oligomisin (ATP sentaz inhibitörü), FCCP (proton birleştirici) ve R/A'nın (sırasıyla mitokondriyal kompleks I ve kompleks III inhibitörleri) seri enjeksiyonlarına yanıt olarak OCR biyoenerjetik profilleri, ATP'ye bağlı solunum, maksimal solunum ve yedek solunum kapasitesi gibi diğer mitokondriyal biyoenerjetik parametrelerini hesaplamak için kullanılır. Gösterilen tüm veriler, Crotty ve ark.11'de yayınlanan Con + media, Con + BPTES ve EtOH + media, EtOH + BPTES MH-S hücre deney gruplarının ek biyolojik kopyalarıdır. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, oligomisin, kompleks V'nin inhibisyonu nedeniyle OCR'yi azalttı, FCCP, membran potansiyelinin mitokondriyal ayrışması ve mitokondriye bağımlı ATP nesil12 nedeniyle OCR'yi artırdı ve R/A, mitokondriye bağlı OCR'yi etkili bir şekilde kapattı. Seri enjeksiyonlara verilen OCR biyoenerjetik yanıtlarının bu profilleri, hücre dışı akı biyoanalizörü13,14 kullanılarak mitokondriyal stresi değerlendirmek için kullanıcı kılavuzu ile tutarlıdır.
Con- ve EtOH ile muamele edilen MH-S hücrelerinde bazal OCR ölçüldükten sonra, bir glutaminaz 1 inhibitörü olan bir medya kontrolü veya BPTES enjeksiyonu yüklendi. Con + media versus Con + BPTES MH-S hücreleri ve EtOH + media vs EtOH + BPTES MH-S hücreleri OCR biyoenerjetik profillerinde farklılık göstermedi (Şekil 2A). EtOH + BPTES MH-S hücreleri, Con + BPTES'e kıyasla glutamine bağımlı bazal solunumda bir azalma gösterdi ( Şekil 2A ve Şekil 2B'deki ölçüm #3 ile karşılaştırıldığında ölçüm #4), EtOH'nin MH-S hücrelerinin bazal glutamin oksidasyonunu azalttığını ve mitokondriyal solunuma katkıda bulunduğunu düşündürmektedir. EtOH + BPTES MH-S hücreleri, Con + BPTES ile karşılaştırıldığında glutamine bağımlı ATP'ye bağlı mitokondriyal solunum kaybı sergiledi (Şekil 2C). EtOH + BPTES MH-S hücreleri, Con + BPTES ile karşılaştırıldığında glutamine bağımlı maksimal solunumda künt bir kayıp göstermesine rağmen (Şekil 2D), EtOH + BPTES MH-S hücreleri, Con + BPTES ile karşılaştırıldığında glutamine bağımlı yedek solunum kapasitesinde azalma göstermiştir (Şekil 2E). Bu sonuçlar, EtOH MH-S hücrelerinin, FCCP ile strese girdiğinde olduğu gibi, solunum için glutamine daha fazla bağımlı olma yeteneğine sahip olduğunu, ancak glutamin biyoyararlanımındaki bir azalmadan daha ağır basan glutamin talebindeki bir artış nedeniyle bunu yapamayabileceklerini göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67579/67579fig01.jpg"> 
Şekil 1: Bir fare alveolar makrofaj hücre hattı olan MH-S hücrelerinde glutamine bağımlı mitokondriyal solunum ve biyoenerjetik ölçümü için iş akışına genel bakış. Hücre dışı akı mikrokültür plakası kuyucuklarında (adım 3.1) kültürlenen MH-S hücrelerinin tek tabakaları, 37 ° C'de CO2 olmayan nemlendirilmiş bir inkübatörde 30 dakika boyunca hücre dışı akı baz ortamı ile inkübe edildi (adım 3.4). Takviyeler eklenmiş hücre dışı akı baz ortamı (adım 3.2), ortam kontrolü olarak ve glutamin oksidasyon inhibitörü BPTES'in çalışma konsantrasyonlarını 3 μM nihai konsantrasyona, mitokondriyal kompleks V inhibitörü oligomisin (Oligo) 0.5 μM nihai konsantrasyona, mitokondriyal uncoupler karbonil siyanür-p-triflorometoksifenilhidrazon (FCCP) 0.5 μM nihai konsantrasyona ve mitokondriyal kompleks I ve kompleks III inhibitörleri rotenon / antimisin A (R / A) ila 0.5 μM'ye seyreltmek için kullanıldı üst hücre dışı akı pak kartuşundaki AD portlarını yüklemek için son konsantrasyon (adım 3.7). Hücre dışı akı biyoanalizörü kullanılarak deneysel çalışma için karıştırma, bekleme ve ölçüm süreleri için enjeksiyon stratejisi şuydu: 3 dakikalık karıştırma süresi, 0 dakikalık bekleme süresi ve Port A (medya kontrolü veya BPTES) için 3 dakikalık ölçüm süresinin 6 ölçümü; Port B (Oligo) için 3 dakikalık karıştırma süresi, 0 dakikalık bekleme süresi ve 3 dakikalık ölçüm süresinde 3 ölçüm; 3 dk karıştırma süresi, 6 dk bekleme süresi ve Port C (FCCP) için 3 dk ölçüm süresi; ve 3 dakikalık karıştırma süresi, 0 dakikalık bekleme süresi ve Port D (R/A) için 3 dakikalık ölçüm süresinde 3 ölçüm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67579/67579fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67579/67579fig02.jpg"> 
Şekil 2: Kronik etanol (EtOH), bir fare alveolar makrofaj hücre hattı olan MH-S hücrelerinde glutamine bağımlı mitokondriyal solunumu azaltır. MH-S hücreleri tedavi edilmedi (Con) veya EtOH ile tedavi edildi (% 0.08, 72 saat) ve zaman içinde oksijen tüketim oranı (OCR), medya kontrolü veya bir glutamin (GLN) oksidasyon inhibitörü (3 μM BPTES) ile enjeksiyondan önce ve sonra hücre dışı akı biyoanalizörü kullanılarak ölçüldü, ardından seri mitokondriyal kompleks V inhibitörü enjeksiyonları (0.5 μM oligomisin, Oligo), mitokondriyal birleştirici (0.5 μM karbonil siyanür-p-triflorometoksifenilhidrazon, FCCP) ve mitokondriyal kompleks I ve kompleks III inhibitörleri (0.5 μM rotenon/0.5 μM antimisin A, R/A). (A) Glutamine bağımlı (B) bazal solunum, (C) ATP'ye bağlı solunum, (D) maksimal solunum ve (E) yedek solunum kapasitesini hesaplamak için OCR biyoenerjetik profilleri kullanıldı. Doğrusal noktalar ortalamaları ± SEM'i temsil eder (n = 4, #p &lt; 0.05'e karşı Con + media ve *p &lt; 0.05'e karşı Con + BPTES, Tukey'in post hoc ile tek yönlü ANOVA). Çubuklar ± SEM ortalamalarını temsil eder (n = 4, *p &lt; 0.05'e karşı Con + BPTES, Öğrencinin t-testi). Sunulan veriler, Crotty ve ark.11'de yayınlanan, tedavi edilmemiş kontrol ve kronik EtOH'ye maruz kalan MH-S hücrelerinin medya kontrolü ve BPTES ile tedavi edilen deney grupları için ek biyolojik kopyalardır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67579/67579fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Hücre Dışı Akı Biyoanalizörü Kullanılarak Kronik Etanole Maruz Kalan Alveolar Makrofajlar için Yakıt Kaynağı Olarak Glutaminin Değerlendirilmesi

Alveolar macrophages (AMs) are the first line of cellular defense in the lower airway against pathogens. However, chronic and excessive alcohol use ...

assessment-glutamine-as-fuel-source-for-alveolar-macrophages-exposed

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kararlı izotop profil aracı metabolik akı gaz kromatografisi kütle spektrometrik analizi, nematod...

Kararlı İzotopik Profil geliştirilmesi ve Yetişkin Sahne Aracı Metabolik Akı Caenorhabditis elegans</em

Bu protokol, hücre dışı akı testi ile primer lösemik hücrelerin hücre dışı asitlenme oranını (ECAR) ve oksijen tüketim oranını (OCR) ölçmek için biyokimyasal bir yaklaşım sağlar. Bu hücrelerin metabolik profilinin değerlendirilmesi, taleplerinin karakterize edilmesine yardımcı olarak kişiselleştirilmiş tedaviye yol açar.

Hücre Dışı Akı Deneyi: Hücrelerin Metabolik Profilini Ölçmek İçin Bir Yöntem

In situ metabolik profilleme için Förster Rezonans Enerji Transferi entegre biyolojik sensörler (FIBS) kalibre nasıl bir açıklama sunulmuştur. FIBS invaziv olmayan metabolik modelleri ve biyoproses koşullarının yüksek miktarda madde taraması gelişiminde yardım metabolitlerin hücre içi seviyelerini ölçmek için kullanılabilir.

Noninvaziv metabolik profil FIBS etkin

Metabolik yeniden programlama, M1 ve M2 makrofaj polarizasyonu için bir özellik ve önkoşuldur. Bu el yazması, fare kemik iliği türevli makrofajlarda glikoliz ve mitokondriyal fonksiyonun temel parametrelerinin ölçümü için bir testi açıklamaktadır. Bu araç, belirli faktörlerin makrofajın metabolizmasını ve fenotipini nasıl etkilediğini araştırmak için uygulanabilir.

Gerçek zamanlı Ekstrasellüler Flux Analizi Polarize M1 ve M2 Kemik İliği-türevli Makrofagların Metabolik Karakterizasyonu

Glikoliz, çoklu biyolojik sistemlerde tanımlayıcı bir metabolik belirteçtir. H + hücre dışı akışını ölçerek glikolizin izlenmesi yaygındır, ancak kantitatif ve açık olması için düzeltme gerektirir. Burada, hücre dışı asitlenmenin solunum ve glikolitik kaynaklarını ayırt etmek için hücre dışı akı verilerinin nasıl toplanacağını ve düzeltileceğini gösteriyoruz.

Ekstraselüler Asit Üretim Ölçüm ve Analiz Glikolitik Hızı belirleme

Burada, mitokondrial solunum ve Candida Albicans glycolytic işlevinde araştırmak için kademeli bir protokol bir ilave akı çözümleyicisini kullanarak mevcut.

Candida albicans kullanarak gerçek zamanlı ekstraselüler akı analiz biyo-enerji incelenmesi

Protokoller, karmaşık lisat bazlı hücre içermeyen sistemlerde metabolik reaksiyonları incelemek için kırma indeksi veya kütle spektrometrik tespiti ile birleştiğinde yüksek performanslı sıvı kromatografi yöntemlerini açıklar.

Sıvı Kromatografisi, Lysate Tabanlı Hücre içermeyen Sistemlerde Metabolit Profilleme için Kırılma İndeksi veya Kütle Spektrometrik Algılaması ile Birleştirilmiştir

Gerçek zamanlı hücre metabolik akısı testi, pH ve oksijen sensörlerini kullanarak mitokondriyal ve glikolitik adenozin trifosfat üretimine karşılık gelen oksijen tüketim oranını ve hücre dışı asitleşme oranını ölçer. Bu yazıda osteoblastların enerji durumunu ve hücresel biyoenerjetik durumun karakterizasyonu ve yorumlanmasını anlamak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Osteoblast Biyoenerjetik Teknolojilerini İzlemek için Gerçek Zamanlı Hücre Metabolik Akı Analizörünü Kullanma

Burada, kemik iliği, dalak ve enfarktüslü kalpten makrofajların çıkarılması ve ardından canlı hücrelerdeki metabolik akışın değerlendirilmesi için yöntemleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Dalak ve Kardiyak Makrofajlarda ve Kemik İliği Monositlerinde Ex Vivo Metabolik Akının Analizi

Bu protokol, birincil fare mikrogliasında metabolik yeniden programlamayı niceliklendirmek için glikoliz stres testi yapmanın maliyet etkin bir yolunu tanımlar. İzolasyon ve inflamatuar uyarımdan sonra, taze hazırlanmış, pH-ayarlanmış reaktiflerle hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) ölçülür, ardından protein normalizasyonu uygulanarak glikolitik değişimlerin doğru ve tekrarlanabilir değerlendirilmesini sağlar.

Birincil mikrogliada glikolizin ekstraselüler akı testi kullanılarak araştırılması

Keşfedin, kronik etanol maruziyetinin alveoler makrofajlarda mitokondriyal metabolizmayı ve glutamin oksidasyonunu nasıl etkilediğini. Bu yöntem immün fonksiyon bozukluklarını anlamak için güvenilir bir protokol sunar.

Hücre Dışı Akı Biyoanalizörü Kullanılarak Kronik Etanole Maruz Kalan Alveolar Makrofajlar için Yakıt Kaynağı Olarak Glutaminin Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal

Hücre Dışı Akı Biyoanalizörü Kullanılarak Kronik Etanole Maruz Kalan Alveolar Makrofajlar için Yakıt Kaynağı Olarak Glutaminin Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet