Name: Gen Fonksiyonu Çalışmaları için Dilimlenmiş İnsan Kortikal Organoidlerinin Elektroporasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Keşfedin, dilimlenmiş insan kortikal organoidlerinde elektroporasyon tekniği ile gen fonksiyonlarını incelemeyi. Bu yöntem, nörogelişimsel bozuklukların araştırılmasında güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Elektroporasyon Yoluyla Dilimlenmiş İnsan Kortikal Organoidlerinde CRISPR / Cas9 Gen Nakavtı

<table><tbody><tr><td>15 mL PP Santrifüj Tüpleri, konik</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nükleofektör Çekirdek</td><td>Ünitesi Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4D-Nükleofektör X</td><td>Ünitesi Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL polistiren hücre süzgeç kapaklı yuvarlak tabanlı tüp</td><td>Corning</td><td>Falcon 352235</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka, nunclon ile muamele edilmiş</td><td>hiPSC için Thermo Fisher</td><td>140675</td><td> kültür</td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka, ultra düşük bağlantı</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>Organoid kültür</td></tr><tr><td>için A83-01</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>72022</td><td>Ön beyin ortamı 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Hava kompresörü</td><td>Aerotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Eşek Anti-Tavuk IgY (IgG) (H + L)</td> <td>Jackson İmmüno Araştırma</td><td>703-545-155</td><td>İkincil antikor, RRID: AB_2340375; seyreltme 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L)</td> <td>İnvitrojen</td><td>A-31572</td><td>İkincil antikor, RRID: AB_162543; seyreltme 1:1000</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmol</td><td>Entegre DNA teknolojileri</td><td></td><td>Özel tasarım (2 nmol olarak sipariş edil)</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>Entegre DNA teknolojileri</td><td>1072532</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>Alt-R Sp HiFi Cas9 Nükleaz V3</td><td>Entegre DNA teknolojileri</td><td>1081060</td><td>100 ve mikro; g, Streptococcus pyogenes</td></tr><tr><td>Amfoterisin B'den (Mantar Zonu)</td><td>Gibco</td><td>15290018</td><td>Ön beyin ortamı 2, 3 ve 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15</td></tr><tr><td>Anti-GFP primer antikoru (tavuk, poliklonal)</td> <td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>RRID: AB_300798; seyreltme 1:2000</td></tr><tr><td>Anti-PCGF4 primer antikoru (fare, monoklonal)</td> <td>Millipore</td><td>05-637&nbsp;</td><td>RRID: AB_309865; seyreltme 1:300</td></tr><tr><td>ApoTome floresan mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Askorbik Asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1043003</td><td>Ön beyin ortamı 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15</td></tr> <tr><td>B27 takviyesi (+ A vitamini)</td> <td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Ön beyin ortamı 3, 4 nbsp; &nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Muz - Micrograbber Kablo Kiti</td><td>Harvard Aparatı BTX</td><td>45-0216</td><td></td></tr><tr><td>Biometra TRIO-Thermocycler (PCR makinesi)</td><td>Analytik Jena</td><td>846-2-070-723</td><td></td></tr><tr><td>Kılcal damarlar, filamentli borosilikat cam, OD 1,2 mm; İç çap 0,69 mm; 10 cm uzunluk</td><td>Bilim Ürünleri</td><td>BF120-69-10</td><td>Belirli bir kalınlığa çekilmesi gerekiyor</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ</td><td>72052</td><td>Ön beyin ortamı 2&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15</td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip IV</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>CRTDi004-A</td><td>CMCB DD'deki Kök Hücre Mühendislik Tesisi</td><td>https://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-A</td><td>Sağlıklı donör DAPI Roche'dan tek hücreli uyarlanmış hiPSC hattı</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>10236276001 1 mg / mL stok, IF Dibutiril-cAMP için seyreltilmiş 1:1000 kullanın</td></tr><tr><td></td><td>KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ</td><td>73884</td><td>Ön beyin ortamı 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15</td></tr> <tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F-12, HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>31330095</td><td>Ön beyin ortamı 1, 2 ve 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dorsomorfin</td><td>KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ</td><td>72102</td><td>Ön beyin ortamı 1&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dumont #55 Forseps, straigth, 11 cm</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 Kare Dalga Elektroporasyon Sistemi</td><td>Harvard Aparatı BTX</td><td>45-2052</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32205-1L-M</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Yeşil FCF Sigma</td><td>Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>SH30070.03&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alevli/Kahverengi Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>Mikro kılcal damarların çekilmesi için</td></tr><tr><td>Geneious Prime</td><td>GraphPad Software LLC d.b.a Geneious</td><td>Software sürüm 2024.0.5</td><td></td></tr><tr><td>gLACZ</em</td><td>>Kalebic ve diğerleri, 2016; Platt ve diğerleri, 2014</td><td></td><td>5'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; altı çizili nükleotidler = PAM</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050038</td><td>Ön beyin ortamı 1, 2, 3 ve 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>gPCGF4 KO1</td><td>bu kağıt</td><td></td><td>5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (Şekil 3I+J'deki KO görüntülerine karşılık gelir)</td></tr><tr><td>gPCGF4 KO2</td><td>bu kağıt</td><td></td><td>5'-ACAAATAATAATACTTGCTGG (KO'ya karşılık gelir) Şekil 3I+J)</td></tr><tr><td>Evde</td><td></td> yapılan <td>HEPES</td><td>1 M stok</td></tr><tr><td>At Serumu, ısıyla inaktive edilmiş</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>İnsan GDNF Rekombinant Protein</td><td>Thermo Fisher</td><td>450-10</td><td>Ön beyin ortamı 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15</td></tr><tr><td>İnsan / Fare / Sıçan BDNF Rekombinant Protein</td><td>Thermo Fisher</td><td>450-02</td><td>Ön beyin ortamı 4 &nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit (HCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>258148</td><td>TrisHCl</td></tr><tr><td>ImmEdge (balmumu) yapmak</td> için <td>Kalem Vektör Laboratuvarları</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin çözeltisi insan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp; I9278</td><td>Ön beyin ortamı 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt Serum Değiştirme</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10828-010</td><td>Ön beyin ortamı 1&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Lazer Taramalı Konfokal 980 Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Düşük Erime Noktalı Agaroz, vibratom</td><td>kesitleme sırasında hCO'ların gömülmesi için</td>ultra saf <td>Thermo Fisher</td><td>16520100</td></tr><tr><td>Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bazal Membran Matrisi, LDEV içermeyen</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Organoid kültür için</td></tr><tr><td>Matrigel hESC Nitelikli Matris, LDEV içermeyen</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>hiPSC kültürü için</td></tr><tr><td>MgCl2, 1 M</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjektör PicoPump + Ayak Pedalı</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Yükleyici Pipet Uçları 0,5 ila 20 & mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Cam kılcal damarların yüklenmesi için</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>85850</td><td>Kök hücre ortamı</td></tr><tr><td>N-2 takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>Ön beyin ortamı 2 ve 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NEB Sonraki Yüksek Sadakat 2x PCR Mastermix&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541S</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer sayma odası</td><td>Marka</td><td>718605</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Ön beyin ortamı 4 &nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitler</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11140050</td><td>Ön beyin ortamı 1, 2, 3 ve 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>nükleaz içermeyen çift yönlü tampon</td><td>Entegre DNA teknolojileri</td><td>1072570</td><td></td></tr><tr><td>OCT Bileşik</td><td>Doku-Tek</td><td>4583</td><td>Donmuş doku örneği için gömme ortamı</td></tr><tr><td>P3 Birincil Hücre 4D-Nükleofektör X Kiti S</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Fisher Kimyasal</td><td>P/0840/53</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>Soyulabilir-A-Way Gömme Kalıp KesilmişT12</td><td>Polysciences Inc.</td><td>18986-1</td><td>Vibratom ve kriyo-kesit için hCO'ların gömülmesi için</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Ön beyin ortamı 1, 2, 3 ve 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 ve nükleofeksiyon sonrası kök hücre ortamı için</td></tr><tr><td>Petri Kabı 60 mm x 15 mm, Havalandırmasız, Steril</td><td>Corning</td><td>BP50-02</td><td></td></tr><tr><td>Petri Kabı Platin Elektrot Odası, 5 mm boşluk</td><td>Harvard Aparatı BTX</td><td>45-0504</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td> <td>evde</td><td></td><td></td>üretilmiştir</tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2308</td><td>Titrachium albümünden; 10 mg/mL stok</td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>RHO/ROCK yolağı inhibitörü (Y-27632)</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>72308</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ</td><td>72232</td><td>Ön beyin ortamı 2&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15 </td></tr> <tr><td>Sodyum Sitrat Dihidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W302600-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus yapışma kızakları</td><td></td> KL 300 LED Olympus SZX10 Veya alternatif stereoskop ile <td>Fisher Scientific</td> 10149870 <td></td></tr><tr><td></td><td>SZX10</td><td>Veya alternatif stereoskop</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Shaker</td><td>Grant bio</td><td>PSC24N</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td>a.k.a. Okoksinol 9</td></tr><tr><td>Trizma tabanı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td>TrisHCl</td></tr><tr><td>Tripan Mavi Çözeltisi yapmak için,% 0.4</td> <td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzim (1x)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>12604021</td><td>Tek hücreli süspansiyonlar yapmak için ayrışma enzimi</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>a.k.a. Polisorbat 20</td></tr><tr><td>Tyrode tuzu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2145-10x1l</td><td></td></tr><tr><td>Titreşimli Mikrotom (vibratom)</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>Geniş Çaplı 1000 & L Evrensel Fit Filtre Uçları</td><td>Corning</td><td>TF-1005-WB-R-S</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21985-023</td><td>Ön beyin ortamı 1, 3 ve 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr></tbody></table>

gen fonksiyonu Çalışmaları için dilimlenmiş İnsan kortikal organoidlerinin elektroporasyonu

Electroporation of Sliced Human Cortical Organoids for Studies of Gene Function

CRISPR/Cas9 aracılı gen ablasyonu, gRNA'ların tasarımını gerektirir. Genel olarak, ilgilenilen bir genin ilk ekzonlarından birini, 7-11 bp aralıklı bir çift gRNA ile hedeflemek (3 bp'nin katlarından kaçınarak) iyi sonuç verir (Şekil 1A). İlk test olarak, gRNA'lar tarafından şablon tanımanın etkinliği, bir PCR şablonu 26,40,62 kullanılarak in vitro olarak sorgulanabilir. Etkili hedefleme ve Cas9 aracılı kesme, şablon DNA'nın indirgenmesinde ve parçalanmış DNA ürünlerinin bir agaroz jel üzerinde görünümünde görülebilir (Şekil 1B). Kortikal organoid üretimi için kullanılan iPSC hattında daha fazla gRNA testi yapılabilir. Bu, başarılı floresan raportör ekspresyonu ile görselleştirilebilen iPSC'lerin nükleofeksiyonunu gerektirir (Şekil 1C). İlgilenilen lokusun verimli bir şekilde hedeflenmesi, Sanger dizilemesi ile doğrulanabilir, bu da hedefleme bölgesinin etrafında aniden biten veya üst üste binen bir kromatogram ile sonuçlanır (Şekil 1D), homolog olmayan uç birleştirme66 ile çift iplikli kopma onarımından elde edilen bir indel spektrumundan kaynaklanır. İn vitro ve iPSC hücrelerinde kılavuz RNA verimlilik testleri, kortikal organoidlerde gen ablasyonu için verimli gRNA çiftlerinin seçimine yardımcı olur.
Elektroporasyondan önce, kortikal organoidler dilimlenir, bu da elektroporasyon karışımının enjeksiyonu için ventrikül lümenlerinin tanımlanmasını destekler (Şekil 2A-C). Enjekte edilen organoidler daha sonra elektroporasyon odasına aktarılır (Şekil 2D). Elektroporasyon için iyi gelişmiş ventrikül benzeri yapılara sahip kortikal organoidler kullanılmalı (Şekil 2E), görünür yapıları olmayan kortikal organoidler atılmalıdır (Şekil 2F). Elektroporasyon karışımı, prosedür sırasında enjekte edilen ventriküllerin görselleştirilmesine izin veren bir boya içerir (Şekil 2G). Kültürde 1-3 gün sonra, başarılı bir şekilde hedeflenen ventriküller, floresan mikroskop altında doğal GFP sinyali ile görülebilir (Şekil 2H).
Derinlemesine histolojik analiz için kriyoseksiyonların immünohistokimyası yapılabilir. İdeal olarak, elektroporasyonlu kortikal organoid içinde çoklu hedefli ventriküller bulunur (Şekil 3A,B). En optimal elektroporasyonlar, organoidin dışarıya bakan dış bölgesindeki ventrikül benzeri yapıları hedefler (Şekil 3C), çünkü bunlar tipik olarak en genişlemiş ventriküllerdir. Bazı durumlarda, elektroporasyon aşırı hücre ölümüne yol açabilir (Şekil 3D, E), örneğin, plazmit konsantrasyonları çok yüksek olduğunda veya elektroporasyon ayarları yetersiz olduğunda. Organoidin iç kısmına bakan elektroporasyonlar (Şekil 3F) genellikle ventrikül benzeri yapıların dış kısımlarına kıyasla daha az genişlemiş bölgelerini içerir. Deneyimlerimize göre, değişkenliği azaltmak için kantitatif analizin organoidin tanımlanmış bölgelerine odaklanmak faydalı olacaktır. Bazen, elektroporasyon apikal yüzeyin bozulmasına neden olabilir (Şekil 3G), örneğin, enjeksiyon hacmi çok yüksek olduğunda, ventriküllerin yırtılmasına neden olduğunda veya elektrik darbeleri çok güçlü olduğunda, hücre delaminasyonuna yol açabilir. Son olarak, iki bitişik ventrikül hedeflendiğinde (Şekil 3H), kortikal bölgelerin sınırlarını ve hedeflenen hücrelerin kökenini atamak zor olabilir.
İmmünohistokimya, ilgilenilen hücrelerde protein seviyesinde başarılı CRISPR / Cas9 aracılı nakavtı doğrulamak için kullanılabilir (Şekil 3I), burada Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1) proteini PCGF467'yi hedefleyerek örneklenmiştir. Sinyal yoğunluğu, deneysel koşullara karşı kontrol koşullarında GFP pozitif hücrelerde analiz edilebilir (Şekil 3J). Alternatif olarak, uygun bir antikor mevcut değilse, hedeflenen hücreler FACS ile kortikal organoidlerden60 izole edilebilir ve Sanger veya Yeni Nesil Dizileme36 ile daha fazla analiz edilebilir. Ayrıca, protein seviyelerinin azaltılması Western blotlama kullanılarak da analiz edilebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig1v5.jpg"> 
Şekil 1: Akut CRISPR/Cas9 aracılı gen nakavtı için kılavuz RNA tasarımı ve doğrulaması. (A) İlgilenilen bir genin eksonunu hedefleyen iki gRNA ile kılavuz RNA (gRNA) tasarım stratejisinin şematik gösterimi. Siyah oklar, gRNA validasyonu için kullanılan şablon hazırlama için PCR primerlerini gösterir. (B) gRNA verimliliğinin in vitro olarak doğrulanması. PCR ile güçlendirilmiş şablonlar RNP kompleksleri ile sindirildi. Başarılı bir bölünmeden sonra, jel elektroforezinden sonra farklı boyutlarda iki bant görünür (solda), oysa düşük verimli gRNA'lar için şablon kesilmeden kalır (sağda). (C) RNP kompleksi ve bir GFP plazmidi ile nükleofeksiyondan 3 gün sonra insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler) parlak alan görüntüsü (solda), GFP floresansı (ortada) ve birleştirilmiş görüntüleri (sağda). Ölçek çubukları: 350 μm. (D) GFP pozitif hücrelerden amplifiye edilmiş DNA'nın Sanger dizilimi ile hiPSC'lerde gRNA verimliliğinin doğrulanması. Çift sarmallı DNA'nın başarılı bir şekilde bölünmesi üzerine, dizileme izleri, gRNA hedef bölgesinden (üstte, KO1) başlayan üst üste binmiş sinyalleri gösterir. Başarısız hedefleme durumunda, DNA dizisi izi, LACZ kontrolüne kıyasla değişmeden kalır (altta, KO2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig2v5.jpg"> 
Şekil 2: Dilimlenmiş insan kortikal organoidlerinin elektroporasyonu. (A) İnsan kortikal organoidlerinin (hCO'lar) elektroporasyonu için iş akışını gösteren şematik çizim. İlk olarak, hCO'lar 500 μm kalınlığında dilimler halinde bölümlere ayrılır. İki gün sonra, bir GFP ekspresyon plazmidi ve Fast Green içeren RNP karışımı, tercihen hCO'ların dış bölgesinde, ventrikül benzeri yapıların lümenlerine enjekte edilir. Elektroporasyon için, hCO'lar elektroporasyon odasına yerleştirilir. Birkaç günlük kültürden sonra, elektroporasyonlu alanlarda bir GFP sinyali tespit edilebilir. (B) HCI'lerin vibratom kesit alma görüntüleri. Organoidler, bir blokta (solda) bir ortamda% 3 düşük erime noktalı agaroz içine gömülür. Blok, 500 μm kalınlığında dilimler halinde (ortada) bölümlere ayrılır. Dilimlenmiş organoidler, geniş delikli bir pipet ucu (sağda) ile kültür kabına geri aktarılır. (C) RNP, PCAG-GFP ve% 0.1 Fast Green içeren karışımın organoidlerin ventrikül benzeri yapılarına enjeksiyonunu gösteren görüntüler. Organoidler Tyrode'un çözeltisine batırılır ve ince cam kılcal damar, ventrikül benzeri yapıların merkezinin lümenine yerleştirilir (solda). Forseps, organoidleri (sol ve orta) stabilize etmek için kullanılır. Organoidlerin dışındaki ventriküller hedeflenir (ortada). Enjekte edilen organoidler, geniş delikli pipet uçları (sağda) ile elektroporasyon odasına veya daha sonra kültür kabına aktarılır. (D) Bir cam Petri kabı ve cama yapıştırılmış iki metal bıçaktan oluşan elektroporasyon odasının görüntüleri. Metal bıçaklar elektrot görevi görür ve elektroporatöre bağlanmak için kabloları bağlamak için delikler içerir. Yeşil bir gölgeden görülebilen hCO'nun enjekte edilen tarafı anoda (pozitif kutup, kırmızı kablo) (sağda) bakmalıdır. (E) İyi gelişmiş ventrikül benzeri yapıları gösteren hCO'ların temsili görüntüleri. Daha hafif halka, ventriküler bölge benzeri alanı temsil eder. Ventrikül benzeri yapının ortasındaki daha koyu daire lümeni temsil eder ve enjeksiyon için hedeflenmelidir. (F) Daha sonraki deneyler için dahil edilmemesini önerdiğimiz, iyi gelişmiş ventrikül benzeri yapılardan yoksun hCO'ların temsili görüntüleri. (G) Elektroporasyon karışımının enjeksiyonundan sonra, hedeflenen alanların Hızlı Yeşil (turuncu oklar) ile görülebildiği hCO'ların temsili görüntüleri. (H) Elektroporasyondan 24 saat sonra doğal GFP sinyalini gösteren hCO'nun temsili görüntüsü. Ölçek çubukları: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig3v5.jpg"> 
Şekil 3: Elektroporasyonlu dilimlenmiş insan kortikal organoidlerinin immünohistokimyasal analizi. (A) Yeşil floresan sinyalli elektroporasyonlu bir insan kortikal organoidini (hCO) temsil eden şematik. (B) Elektroporasyondan 7 gün sonra, çoklu elektroporasyonlu ventriküllü kriyoseksiyonel bir hCO'nun GFP (yeşil) için DAPI boyaması (gri) ve immünofloresansı. (C-H) GFP (yeşil) ve çekirdekler (DAPI, gri) için boyanmış farklı elektroporasyon sonuçlarının örnek görüntüleri. (C) Sağlam çekirdekler (bkz. ek 1, D), bozulmamış ventrikül benzeri bir yapı ve organoidin dışına bakan alanda genellikle en çok genişlemiş olan elektroporasyonlu hücreler ile optimal bir elektroporasyon. (E) Küçük, DAPI yoğun ve çarpık çekirdeklerle karakterize edilen, elektroporasyonlu alanda büyük hücre ölümü gösteren hCO örneği (ayrıca bkz. ek 2, D). (F) Organoidin içine doğru yönlendirilen başarılı bir elektroporasyon, bitişik ventriküllerle birleşen kortikal plaka benzeri alanlar nedeniyle yorumlanması genellikle daha zordur. (G) Elektroporasyonlu alanın merkezinde bozulmuş ventrikül benzeri yapılar (turuncu ok). (H) Kısmen birleşmiş ve bu nedenle ölçülmesi zor olan çok sayıda küçük ventrikül içeren bir hCO örneği. (I) CRISPR / Cas9 aracılı nakavt için LACZ (gLACZ KO, solda) veya PCGF4'ü (gPCGF4 KO, sağda) hedefleyen bir RNP kompleksinin elektroporasyonundan 7 gün sonra GFP (yeşil) ve PCGF4 (macenta) için DAPI boyama (gri) ve immünofloresan . Daire içine alınmış hücreler, başarılı gen ablasyonunu gösteren PCGF4'ün azaltılmış yoğunluğunu vurgular. LACZ kontrolünde (solda) tek tip bir sinyal görülebilir. (J) Grafik, kontrol için GFP pozitif hücrelerde immünofloresan sonrası niceliksel PCGF4 yoğunluğunu (gLACZ KO) ve gLACZ koşulundaki medyan PCGF4 ekspresyonuna göre PCGF4'ün KO'sunu (gPCGF4 KO) gösterir. Her nokta bir hücreyi temsil eder. Aynı hiPSC hattının iki farklı partisinden (gri ve siyah) 3-4 organoidden elde edilen veriler. p &lt; 0.0001, Mann-Whitney testi. Tüm görüntüler lazer taramalı konfokal (B, C) veya floresan (E-I) mikroskop ile elde edildi. Görüntüler, 10-15 μm kalınlığındaki z yığınlarının maksimum yoğunluk projeksiyonlarını temsil eder. Beyaz kesikli çizgiler, ventrikül lümenine bakan apikal yüzeyi ve hCO'ların dış yüzeylerini gösterir. Turuncu kesikli çizgiler, birleştirilmiş ventriküllerdeki VZ/SVZ sınırını gösterir. Ölçek çubukları: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antikor/Boya</td>
			<td>Seyreltme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tavuk anti-GFP</td>
			<td>1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fare anti-PCGF4</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Eşek Anti-Tavuk</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Eşek Anti-Tavşan</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (DAPI)</td>
			<td>1 mg/mL stok; 1:1,000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: İmmünofloresan boyama için kullanılan antikorların ve boyaların listesi ve bunların seyreltilmesi.

Gen Fonksiyonu Çalışmaları için Dilimlenmiş İnsan Kortikal Organoidlerinin Elektroporasyonu

Human cortical organoids have become important tools for studying human brain development, neurodevelopmental disorders, and human brain evolution. ...

electroporation-sliced-human-cortical-organoids-for-studies-gene

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu prosedür ya da spiral limbus ve spiral ganglion nöronlar Corti fare organ izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanır. Ayrıca elektroporasyon Corti eksplant organ dışsal bir muhabir gen ifadesi için bir yöntem göstermektedir.

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

Utero elektroporasyon nöronal progenitör hücrelerinin in vivo transfecting için değerli bir yöntemdir. Elektrotlar ve elektroporasyon gelişimsel timepoint yerleştirme bağlı kortikal hücrelerin bazı altkümelerini hedeflenebilir. Hedeflenen hücreler daha sonra in vivo veya in vitro genetik değişiminin etkileri analiz edilebilir.

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

Serebral kortekse bir gelişme genlerin işlevine hızlı bir değerlendirme yapmak için, ilgili yöntemler...

Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Mürin Serebral Korteks olarak&gt; RNAi Elektroporasyon

Bu video, bir dizi in vitro hipokampal dilim kültürü boyunca hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlardaki genlerin tek hücreli elektroporasyonu için protokolü göstermektedir. Teknik, hücre otonom mekanizmaları ve transsinaptik protein etkileşimleri dahil olmak üzere nöronların spesifik moleküler ve fizyolojik fonksiyonlarını incelemek için yararlıdır.

Organotipik Beyin Dilimi Kültürlerinde Tek Hücreli Elektroporasyon: Beyin Hipokampal Dilimlerinde Hedeflenen Nöronların İçine Plazmitleri Vermek İçin İn Vitro Bir Teknik

Bu protokol içerir geliştirilmiş bir eksplant yordam...

Eski utero Elektroporasyon ve Tüm Yarımküre Eksplantlarından: Erken Kortikal Kalkınma Çalışmaları İçin Basit Bir Deney Yöntemi

Uteros elektroporasyonda çift mekansal ve zamansal olarak ayrılmış hücre popülasyonları hedefleme sağlar. Bu teknik, bu hücre popülasyonları arasındaki etkileşimleri normal koşullarda floresan proteinler ihsallaştırmak için değil, aynı zamanda fonksiyonel deneylerden sonra ilgi genlerini tedirgin etmek için görselleştirmek için yararlıdır.

Geçici ve Mekansal Olarak Ayrılmış Hücre Popülasyonlarını Hedef lemek için Utero Elektroporasyonunda Çift

Burada sunulan, çeşitli in vitro hipokampal dilim kültürü çağlarında hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlarda genler sağlayabilen tek hücreli elektroporasyon için bir protokoldür. Yaklaşımımız, hücre-otonom ve hücreler arası fonksiyonları incelemek için kullanılabilecek tek tek hücrelerdeki genlerin kesin ve verimli bir şekilde ifade edilmesini sağlar.

Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü inhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültürü boyunca Tek Hücreli Elektroporasyon

Primat serebral organoidlerinin elektroporasyonu, primat (pato) fizyolojik neokorteks gelişimine yakın bir model sistemde farklı progenitör tiplerine ve nöronlara geçici genetik modifikasyonları tanıtmak için kesin ve etkili bir yaklaşım sağlar. Bu, nörogelişimsel ve evrimsel süreçlerin incelenmesine izin verir ve hastalık modellemesi için de uygulanabilir.

Genetik Modifikasyon için Primat Serebral Organoidlerinin Hedefe Yönelik Mikroenjeksiyonu ve Elektroporasyonu

Embriyonik civciv retinal hücre kültürleri fotoreseptör biyoloji çalışma için değerli araçlar oluşturmaktadır. Biz kültür öncesinde retina plazmid elektroporasyon ovo ex dayalı etkin gen transferi tekniğini geliştirdi. Bu teknik önemli ölçüde bu sistem için uygun genetik manipülasyon yaparak, mevcut protokoller üzerinde transfeksiyon verimliliği artırır.

Primer Hücre Kültürü Araştırmaları Chick retina Verimli Gen Transferi: Bir Eski-ovo Elektroporasyon Yaklaşımı

Embriyonik fare iç kulağından koklear eksplantların izolasyonunu ve kültürünü tanımlayan bir yöntem sunuyoruz.  Ayrıca, kare dalga elektroporasyon yoluyla koklear eksplantlara gen transferi için bir yöntem gösteriyoruz. Gen transfer tekniği ile birleştirilmiş in vitro eksplant kültürü, araştırmacıların gelişim sırasında gen ekspresyonunu değiştirmenin etkilerini incelemelerini sağlar.

Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

Keşfedin, dilimlenmiş insan kortikal organoidlerinde elektroporasyon tekniği ile gen fonksiyonlarını incelemeyi. Bu yöntem, nörogelişimsel bozuklukların araştırılmasında güçlü bir araç sunar.

Gen Fonksiyonu Çalışmaları için Dilimlenmiş İnsan Kortikal Organoidlerinin Elektroporasyonu

Daha fazla video keşfet