Name: Gen Fonksiyonu Çalışmaları için Dilimlenmiş İnsan Kortikal Organoidlerinin Elektroporasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Keşfedin, dilimlenmiş insan kortikal organoidlerinde elektroporasyon tekniği ile gen fonksiyonlarını incelemeyi. Bu yöntem, nörogelişimsel bozuklukların araştırılmasında güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<meta charset="utf8"></head><body>Elektroporasyon Yoluyla Dilimlenmiş İnsan Kortikal Organoidlerinde CRISPR / Cas9 Gen Nakavtı

<table><tbody><tr><td>15 mL PP Santrifüj Tüpleri, konik</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nükleofektör Çekirdek</td><td>Ünitesi Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4D-Nükleofektör X</td><td>Ünitesi Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL polistiren hücre süzgeç kapaklı yuvarlak tabanlı tüp</td><td>Corning</td><td>Falcon 352235</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka, nunclon ile muamele edilmiş</td><td>hiPSC için Thermo Fisher</td><td>140675</td><td> kültür</td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka, ultra düşük bağlantı</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>Organoid kültür</td></tr><tr><td>için A83-01</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>72022</td><td>Ön beyin ortamı 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Hava kompresörü</td><td>Aerotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Eşek Anti-Tavuk IgY (IgG) (H + L)</td> <td>Jackson İmmüno Araştırma</td><td>703-545-155</td><td>İkincil antikor, RRID: AB_2340375; seyreltme 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L)</td> <td>İnvitrojen</td><td>A-31572</td><td>İkincil antikor, RRID: AB_162543; seyreltme 1:1000</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmol</td><td>Entegre DNA teknolojileri</td><td></td><td>Özel tasarım (2 nmol olarak sipariş edil)</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>Entegre DNA teknolojileri</td><td>1072532</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>Alt-R Sp HiFi Cas9 Nükleaz V3</td><td>Entegre DNA teknolojileri</td><td>1081060</td><td>100 ve mikro; g, Streptococcus pyogenes</td></tr><tr><td>Amfoterisin B'den (Mantar Zonu)</td><td>Gibco</td><td>15290018</td><td>Ön beyin ortamı 2, 3 ve 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15</td></tr><tr><td>Anti-GFP primer antikoru (tavuk, poliklonal)</td> <td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>RRID: AB_300798; seyreltme 1:2000</td></tr><tr><td>Anti-PCGF4 primer antikoru (fare, monoklonal)</td> <td>Millipore</td><td>05-637&nbsp;</td><td>RRID: AB_309865; seyreltme 1:300</td></tr><tr><td>ApoTome floresan mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Askorbik Asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1043003</td><td>Ön beyin ortamı 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15</td></tr> <tr><td>B27 takviyesi (+ A vitamini)</td> <td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Ön beyin ortamı 3, 4 nbsp; &nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Muz - Micrograbber Kablo Kiti</td><td>Harvard Aparatı BTX</td><td>45-0216</td><td></td></tr><tr><td>Biometra TRIO-Thermocycler (PCR makinesi)</td><td>Analytik Jena</td><td>846-2-070-723</td><td></td></tr><tr><td>Kılcal damarlar, filamentli borosilikat cam, OD 1,2 mm; İç çap 0,69 mm; 10 cm uzunluk</td><td>Bilim Ürünleri</td><td>BF120-69-10</td><td>Belirli bir kalınlığa çekilmesi gerekiyor</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ</td><td>72052</td><td>Ön beyin ortamı 2&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15</td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip IV</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>CRTDi004-A</td><td>CMCB DD'deki Kök Hücre Mühendislik Tesisi</td><td>https://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-A</td><td>Sağlıklı donör DAPI Roche'dan tek hücreli uyarlanmış hiPSC hattı</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>10236276001 1 mg / mL stok, IF Dibutiril-cAMP için seyreltilmiş 1:1000 kullanın</td></tr><tr><td></td><td>KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ</td><td>73884</td><td>Ön beyin ortamı 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15</td></tr> <tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F-12, HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>31330095</td><td>Ön beyin ortamı 1, 2 ve 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dorsomorfin</td><td>KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ</td><td>72102</td><td>Ön beyin ortamı 1&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dumont #55 Forseps, straigth, 11 cm</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 Kare Dalga Elektroporasyon Sistemi</td><td>Harvard Aparatı BTX</td><td>45-2052</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32205-1L-M</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Yeşil FCF Sigma</td><td>Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>SH30070.03&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alevli/Kahverengi Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>Mikro kılcal damarların çekilmesi için</td></tr><tr><td>Geneious Prime</td><td>GraphPad Software LLC d.b.a Geneious</td><td>Software sürüm 2024.0.5</td><td></td></tr><tr><td>gLACZ</em</td><td>>Kalebic ve diğerleri, 2016; Platt ve diğerleri, 2014</td><td></td><td>5'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; altı çizili nükleotidler = PAM</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050038</td><td>Ön beyin ortamı 1, 2, 3 ve 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>gPCGF4 KO1</td><td>bu kağıt</td><td></td><td>5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (Şekil 3I+J'deki KO görüntülerine karşılık gelir)</td></tr><tr><td>gPCGF4 KO2</td><td>bu kağıt</td><td></td><td>5'-ACAAATAATAATACTTGCTGG (KO'ya karşılık gelir) Şekil 3I+J)</td></tr><tr><td>Evde</td><td></td> yapılan <td>HEPES</td><td>1 M stok</td></tr><tr><td>At Serumu, ısıyla inaktive edilmiş</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>İnsan GDNF Rekombinant Protein</td><td>Thermo Fisher</td><td>450-10</td><td>Ön beyin ortamı 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15</td></tr><tr><td>İnsan / Fare / Sıçan BDNF Rekombinant Protein</td><td>Thermo Fisher</td><td>450-02</td><td>Ön beyin ortamı 4 &nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit (HCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>258148</td><td>TrisHCl</td></tr><tr><td>ImmEdge (balmumu) yapmak</td> için <td>Kalem Vektör Laboratuvarları</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin çözeltisi insan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp; I9278</td><td>Ön beyin ortamı 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt Serum Değiştirme</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10828-010</td><td>Ön beyin ortamı 1&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Lazer Taramalı Konfokal 980 Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Düşük Erime Noktalı Agaroz, vibratom</td><td>kesitleme sırasında hCO'ların gömülmesi için</td>ultra saf <td>Thermo Fisher</td><td>16520100</td></tr><tr><td>Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bazal Membran Matrisi, LDEV içermeyen</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Organoid kültür için</td></tr><tr><td>Matrigel hESC Nitelikli Matris, LDEV içermeyen</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>hiPSC kültürü için</td></tr><tr><td>MgCl2, 1 M</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjektör PicoPump + Ayak Pedalı</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Yükleyici Pipet Uçları 0,5 ila 20 & mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Cam kılcal damarların yüklenmesi için</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>85850</td><td>Kök hücre ortamı</td></tr><tr><td>N-2 takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>Ön beyin ortamı 2 ve 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NEB Sonraki Yüksek Sadakat 2x PCR Mastermix&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541S</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer sayma odası</td><td>Marka</td><td>718605</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Ön beyin ortamı 4 &nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitler</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11140050</td><td>Ön beyin ortamı 1, 2, 3 ve 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>nükleaz içermeyen çift yönlü tampon</td><td>Entegre DNA teknolojileri</td><td>1072570</td><td></td></tr><tr><td>OCT Bileşik</td><td>Doku-Tek</td><td>4583</td><td>Donmuş doku örneği için gömme ortamı</td></tr><tr><td>P3 Birincil Hücre 4D-Nükleofektör X Kiti S</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Fisher Kimyasal</td><td>P/0840/53</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>Soyulabilir-A-Way Gömme Kalıp KesilmişT12</td><td>Polysciences Inc.</td><td>18986-1</td><td>Vibratom ve kriyo-kesit için hCO'ların gömülmesi için</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Ön beyin ortamı 1, 2, 3 ve 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 ve nükleofeksiyon sonrası kök hücre ortamı için</td></tr><tr><td>Petri Kabı 60 mm x 15 mm, Havalandırmasız, Steril</td><td>Corning</td><td>BP50-02</td><td></td></tr><tr><td>Petri Kabı Platin Elektrot Odası, 5 mm boşluk</td><td>Harvard Aparatı BTX</td><td>45-0504</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td> <td>evde</td><td></td><td></td>üretilmiştir</tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2308</td><td>Titrachium albümünden; 10 mg/mL stok</td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>RHO/ROCK yolağı inhibitörü (Y-27632)</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>72308</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ</td><td>72232</td><td>Ön beyin ortamı 2&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15 </td></tr> <tr><td>Sodyum Sitrat Dihidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W302600-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus yapışma kızakları</td><td></td> KL 300 LED Olympus SZX10 Veya alternatif stereoskop ile <td>Fisher Scientific</td> 10149870 <td></td></tr><tr><td></td><td>SZX10</td><td>Veya alternatif stereoskop</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Shaker</td><td>Grant bio</td><td>PSC24N</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td>a.k.a. Okoksinol 9</td></tr><tr><td>Trizma tabanı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td>TrisHCl</td></tr><tr><td>Tripan Mavi Çözeltisi yapmak için,% 0.4</td> <td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzim (1x)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>12604021</td><td>Tek hücreli süspansiyonlar yapmak için ayrışma enzimi</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>a.k.a. Polisorbat 20</td></tr><tr><td>Tyrode tuzu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2145-10x1l</td><td></td></tr><tr><td>Titreşimli Mikrotom (vibratom)</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>Geniş Çaplı 1000 & L Evrensel Fit Filtre Uçları</td><td>Corning</td><td>TF-1005-WB-R-S</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21985-023</td><td>Ön beyin ortamı 1, 3 ve 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr></tbody></table>

gen fonksiyonu Çalışmaları için dilimlenmiş İnsan kortikal organoidlerinin elektroporasyonu

Electroporation of Sliced Human Cortical Organoids for Studies of Gene Function

CRISPR/Cas9 aracılı gen ablasyonu, gRNA'ların tasarımını gerektirir. Genel olarak, ilgilenilen bir genin ilk ekzonlarından birini, 7-11 bp aralıklı bir çift gRNA ile hedeflemek (3 bp'nin katlarından kaçınarak) iyi sonuç verir (Şekil 1A). İlk test olarak, gRNA'lar tarafından şablon tanımanın etkinliği, bir PCR şablonu 26,40,62 kullanılarak in vitro olarak sorgulanabilir. Etkili hedefleme ve ...

Gen Fonksiyonu Çalışmaları için Dilimlenmiş İnsan Kortikal Organoidlerinin Elektroporasyonu

Human cortical organoids have become important tools for studying human brain development, neurodevelopmental disorders, and human brain evolution. ...

electroporation-sliced-human-cortical-organoids-for-studies-gene

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu prosedür ya da spiral limbus ve spiral ganglion nöronlar Corti fare organ izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanır. Ayrıca elektroporasyon Corti eksplant organ dışsal bir muhabir gen ifadesi için bir yöntem göstermektedir.

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

Utero elektroporasyon nöronal progenitör hücrelerinin in vivo transfecting için değerli bir yöntemdir. Elektrotlar ve elektroporasyon gelişimsel timepoint yerleştirme bağlı kortikal hücrelerin bazı altkümelerini hedeflenebilir. Hedeflenen hücreler daha sonra in vivo veya in vitro genetik değişiminin etkileri analiz edilebilir.

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

Serebral kortekse bir gelişme genlerin işlevine hızlı bir değerlendirme yapmak için, ilgili yöntemler...

Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Mürin Serebral Korteks olarak&gt; RNAi Elektroporasyon

Kaynak: Palma-Tortosa, S., et.al. İnsan Kök Hücre Nakli ve Validasyonu için Ex vivo Model Olarak Yetişkin İnsan Korteksinin Organotipik Kültürleri. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, kök hücre kaynaklı nöronal progenitör hücrelerin insan kortikal doku dilimlerine naklini göstermektedir. Prosedür, bir bazal membran matrisinde progenitör hücrelerin izole edilmesini ve yeniden askıya alınmasını, ardından bunların bir transwell düzeneğine yerleştirilen kortikal bir dilime enjekte edilmesini içerir.

Kök Hücre Kaynaklı Nöronal Progenitörlerin İnsan Kortikal Dilimlerine Nakli

Bu video, bir dizi in vitro hipokampal dilim kültürü boyunca hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlardaki genlerin tek hücreli elektroporasyonu için protokolü göstermektedir. Teknik, hücre otonom mekanizmaları ve transsinaptik protein etkileşimleri dahil olmak üzere nöronların spesifik moleküler ve fizyolojik fonksiyonlarını incelemek için yararlıdır.

Organotipik Beyin Dilimi Kültürlerinde Tek Hücreli Elektroporasyon: Beyin Hipokampal Dilimlerinde Hedeflenen Nöronların İçine Plazmitleri Vermek İçin İn Vitro Bir Teknik

Bu protokol içerir geliştirilmiş bir eksplant yordam...

Eski utero Elektroporasyon ve Tüm Yarımküre Eksplantlarından: Erken Kortikal Kalkınma Çalışmaları İçin Basit Bir Deney Yöntemi

Bu yazının tek hücre düzeyinde ve floresan etiketli nöronların eksitabilite nöronların yapısal bağlantı tanımlamak için utero elektroporasyon (İEÜ) kullanmak protokolleri sağlar. Histoloji dendritik ve aksonal projeksiyonlar karakterize etmek için kullanılır. Akut dilim tam hücreli kayıt eksitabilitesini araştırmak için kullanılır.

Rahimde Elektroporasyon Nöronal alt popülasyonlar heyecanlanma ve Tek hücreli Bağlantı Eğitim Yaklaşımları

Burada, electroporated beyin organotypic dilim kültürler fare embriyo confocal mikroskobu ve canlı görüntüleme teknikleri için uygun oluşturmak için düşük maliyetli ve güvenilir bir yöntem sağlamak.

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

Burada sunulan, çeşitli in vitro hipokampal dilim kültürü çağlarında hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlarda genler sağlayabilen tek hücreli elektroporasyon için bir protokoldür. Yaklaşımımız, hücre-otonom ve hücreler arası fonksiyonları incelemek için kullanılabilecek tek tek hücrelerdeki genlerin kesin ve verimli bir şekilde ifade edilmesini sağlar.

Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü inhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültürü boyunca Tek Hücreli Elektroporasyon

Primat serebral organoidlerinin elektroporasyonu, primat (pato) fizyolojik neokorteks gelişimine yakın bir model sistemde farklı progenitör tiplerine ve nöronlara geçici genetik modifikasyonları tanıtmak için kesin ve etkili bir yaklaşım sağlar. Bu, nörogelişimsel ve evrimsel süreçlerin incelenmesine izin verir ve hastalık modellemesi için de uygulanabilir.

Genetik Modifikasyon için Primat Serebral Organoidlerinin Hedefe Yönelik Mikroenjeksiyonu ve Elektroporasyonu

Keşfedin, dilimlenmiş insan kortikal organoidlerinde elektroporasyon tekniği ile gen fonksiyonlarını incelemeyi. Bu yöntem, nörogelişimsel bozuklukların araştırılmasında güçlü bir araç sunar.

Gen Fonksiyonu Çalışmaları için Dilimlenmiş İnsan Kortikal Organoidlerinin Elektroporasyonu

Daha fazla video keşfet