Fare Kaynaklı Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin Saflaştırılması, Genişletilmesi ve Akış Sitometrisi Tabanlı Fenotiplendirilmesi

Araştırmamız, homojen fare kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini saflaştırmak ve genişletmek için düşük maliyetli bir yöntem sağlar. Bu, araştırmacıların güçlü büyüme ve farklılaşma yeteneklerine sahip yeterli miktarda yüksek kaliteli hücre elde etmelerine yardımcı olur. Kemik iliği kök hücre araştırmalarındaki önemli bir zorluk, kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini izole etmek için basit ve etkili bir protokol geliştirmektir. Bu yöntem, kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin rahatsızlığı önleyerek yanal olarak büyümesini sağlar. Üçüncü geçişi kullanır, ek büyüme etkilerinden kaçınır ve kök hücrelerin sağlığını ve işlevini desteklemek için hematopoietik hücreleri etrafta tutar.

[Eğitmen] Başlamak için, ötenazi yapılmış fareyi beş dakika boyunca% 75, etanol içinde bekletin. Steril diseksiyon makası kullanarak, Aşil tendonunun yakınında, arka bacakta yaklaşık bir santimetrelik bir kesi yapın. Ardından, distal tibiayı ortaya çıkarmak için arka bacak çevresinde dairesel bir kesi yapın. Cildi her iki arka bacaktan çıkarmak için cildi kesi bölgesinden kalçaya doğru soyun. Femur başını kalça kemiğinden ayırmak için iliak kemik boyunca kesin. Steril bir neşter kullanarak, daha sonra kızarmayı kolaylaştırmak için tibia ve fibuladan mümkün olduğunca fazla tendon ve kas çıkarın. Temizlenmiş kemikleri steril bir başlığa taşımadan önce% 2 penisilin ve streptomisin içeren PBS içeren kaba geri koyun. 50 mililitrelik bir şırınga alın ve şırıngayla birlikte gelen iğneyi takın. Şırıngayı 20 mililitre alfa MEM ortamıyla doldurun ve iğneyi bir mililitrelik şırıngayla birlikte gelenle değiştirin. Steril başlıkta, ayrılmış femur veya tibianın her iki ucunu kesmek için makas kullanın. Şimdi, iğneyi kesik kenardan kemiğe sokun ve kemik iliğini tam alfa MEM ortamı içeren 100 milimetrelik bir hücre kültürü kabına yıkayın. Kemik gözle görülür şekilde soluklaşana kadar yıkamaya devam edin, bu da başarılı kemik iliği ekstraksiyonunu gösterir. Herhangi bir hücre agregatını dağıtmak için bir mililitrelik pipet ucu kullanarak 40 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Şimdi, kalıntıları, doku parçalarını ve dağılmamış kümeleri çıkarmak için hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne süzün. Tam alfa MEM ortamı ile toplam hacmi 15 mililitreye ayarlayın ve filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 100 milimetrelik bir kültür kabına aktarın. Çanağı iki elinizle tutun ve hücreleri tabağa eşit olarak dağıtmak için sekiz şeklinde hareketlerle 15 kez hafifçe döndürün. Son olarak, kültür kabını 37 santigrat derece, %5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin ve beş gün boyunca kültürleyin. Bu şekil, kemik iliği stromal hücrelerinin ilk ekstraksiyondan kültürdeki üçüncü geçişe kadar morfolojik ilerlemesini göstermektedir. Yeni çıkarılan kemik iliği hücreleri, alan boyunca görülebilen dağınık yağ damlacıkları ile ağırlıklı olarak mononükleer görünüyordu. Kültürün beşinci gününde, iğ şeklindeki hücreler ortaya çıkmaya başladı ve yaklaşık %60 ila %80 birleşmeye ulaştı ve yedinci günde yoğunluk artmaya devam etti. Birinci pasajdan üçüncü pasaja kadar, kemik iliği stromal hücreleri bir iğ veya fusiform morfolojisini korudu, birbirine bağlı kolonilerle berrak bir tek tabaka oluşturdu ve sitoplazmik granülerlik veya nükleer parçalanma gibi hiçbir apoptoz belirtisi göstermedi. Akış sitometrisi, CD29, CD44 ve Sca-1'in kemik iliği stromal hücrelerinde yüksek oranda eksprese edildiğini doğruladı. Endotelyal ve hematopoietik soyların CD31 ve CD45 belirteçlerinin ekspresyonu ihmal edilebilir düzeydeydi. Belirteç ölçümü ayrıca CD31 ve CD45'e kıyasla CD29, CD44 ve Sca-1'in yüksek ekspresyon seviyelerini doğruladı.