Name: Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus Heterojen Fenotiplerinin Hızlandırılmış Epifloresan Mikroskobu Görüntülemesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Öğrenin, Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus'ta persister hücrelerinin antibiyotik direncini zaman atlamalı epifloresan mikroskopi ile görüntülemeyi. Bu yöntem, enfeksiyon tedavilerini geliştirmek için bakteri sağkalım stratejilerini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Bakteriyel Patojenlerde Antibiyotik Kalıcılığının Görselleştirilmesi

<ol><li>Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+between+resistance%2C+tolerance+and+persistence+to+antibiotic+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment.</a> Nat Rev Microbiol. 14, 320-330 (2016).</li>
<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitions+and+guidelines+for+research+on+antibiotic+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence.</a> Nat Rev Microbiol. 17 (7), 441-448 (2019).</li>
<li>Conlon, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+chronic+and+relapsing+infections%3A+evidence+of+a+role+for+persister+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus chronic and relapsing infections: evidence of a role for persister cells.</a> Bioessays. 36 (10), 991-996 (2014).</li>
<li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+strains+producing+high+levels+of+persister+cells+in+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis.</a> J Bacteriol. 192 (23), 6191-6199 (2010).</li>
<li>Verstraete, L., Van den Bergh, B., Verstraeten, N., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+and+evolution+of+antibiotic+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ecology and evolution of antibiotic persistence.</a> Trends Microbiol. 30 (5), 466-479 (2021).</li>
<li>Sett, A., Dubey, V., Bhowmik, S., Pathania, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+bacterial+persistence%3A+Mechanisms+and+strategies+for+effective+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Decoding bacterial persistence: Mechanisms and strategies for effective eradication.</a> ACS Infect Dis. 10 (8), 2525-2539 (2024).</li>
<li>Mempin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+extracellular+ATP+by+bacteria+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Release of extracellular ATP by bacteria during growth.</a> BMC Microbiol. 13, 301(2013).</li>
<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+cells%2C+dormancy+and+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nat Rev Microbiol. 5 (1), 48-56 (2006).</li>
<li>Fauvart, M., De Groote, V. N., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+persister+cells+in+chronic+infections%3A+clinical+relevance+and+perspectives+on+anti-persister+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Role of persister cells in chronic infections: clinical relevance and perspectives on anti-persister therapies.</a> J Med Microbiol. 60 (pt 6), 699-709 (2011).</li>
<li>Van den Bergh, B., Fauvart, M., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation%2C+physiology%2C+ecology%2C+evolution+and+clinical+importance+of+bacterial+persisters%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Formation, physiology, ecology, evolution and clinical importance of bacterial persisters.</a> FEMS Microbiol Rev. 41, 219-251 (2017).</li>
<li>Levin, B. R., Rozen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-inherited+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Non-inherited antibiotic resistance.</a> Nat Rev Microbiol. 4 (7), 556-562 (2006).</li>
<li>Davis, K. M., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+heterogeneity+within+bacterial+populations+via+single+cell+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Defining heterogeneity within bacterial populations via single cell approaches.</a> Bioessays. 38 (8), 782-790 (2016).</li>
<li>Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+to+study+phenotypic+heterogeneity+and+bacterial+persisters%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters.</a> Microorganisms. 9 (11), 2277(2021).</li>
<li>de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+automated+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy.</a> J Vis Exp. 53, e3145(2011).</li>
<li>Hare, P. J., Gonzalez, J. R., Quelle, R. M., Wu, Y. I., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+and+transcriptional+activities+underlie+stationary-phase+Pseudomonas+aeruginosa+sensitivity+to+levofloxacin%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Metabolic and transcriptional activities underlie stationary-phase Pseudomonas aeruginosa sensitivity to levofloxacin.</a> Microbiol Spectr. 12 (1), e0356723(2024).</li>
<li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).</li>
<li>Pang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((agr-Dependent+interactions+of+Staphylococcus+aureus+USA300+with+human+polymorphonuclear+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">agr-Dependent interactions of Staphylococcus aureus USA300 with human polymorphonuclear neutrophils.</a> J Innate Immun. 2 (6), 546-559 (2010).</li>
<li>Bose, J. L., Fey, P. D., Bayles, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+tools+to+enhance+the+study+of+gene+function+and+regulation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic tools to enhance the study of gene function and regulation in Staphylococcus aureus.</a> Appl Environ Microbiol. 79 (7), 2218(2013).</li>
<li>Schenk, S., Laddaga, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+electroporation+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus.</a> FEMS Microbiol Lett. 73, 133-138 (1992).</li>
<li>Grosser, M. R., Richardson, A. R. Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGrosser%2C+MR+%22The+Genetic+Manipulation+of+Staphylococci.+Methods+Molecular+Biology%22">The Genetic Manipulation of Staphylococci. Methods Molecular Biology</a>. , Humana Press. New York, NY. (2016).</li>
<li>Krausz, K. L., Bose, J. L. Bacteriophage Transduction in Staphylococcus aureus: Broth-Based Method. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKrausz%2C+KL+%22The+Genetic+Manipulation+of+Staphylococci.+Methods+Molecular+Biology%22">The Genetic Manipulation of Staphylococci. Methods Molecular Biology</a>. , Humana Press. New York, NY. (2016).</li>
<li>Olson, M. E. Bacteriophage Transduction in Staphylococcus aureus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOlson%2C+ME+%22The+Genetic+Manipulation+of+Staphylococci.+Methods+Molecular+Biology%22">The Genetic Manipulation of Staphylococci. Methods Molecular Biology</a>. , Humana Press. New York, NY. (2016).</li>
<li>Fey, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+resource+for+rapid+and+comprehensive+phenotype+screening+of+nonessential+Staphylococcus+aureus+genes%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">A genetic resource for rapid and comprehensive phenotype screening of nonessential Staphylococcus aureus genes.</a> mBio. 4 (1), e00537-e00612 (2013).</li>
<li>Coe, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-strain+Tn-Seq+reveals+common+daptomycin+resistance+determinants+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Multi-strain Tn-Seq reveals common daptomycin resistance determinants in Staphylococcus aureus.</a> PLoS Pathog. 15 (11), e1007862(2019).</li>
<li>Figurski, D. H., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+an+origin-containing+derivative+of+plasmid+RK2+dependent+on+a+plasmid+function+provided+in+trans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (4), 1648(1979).</li>
<li>Shee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+proteins+detect+spontaneous+DNA+breakage+in+human+and+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Engineered proteins detect spontaneous DNA breakage in human and bacterial cells.</a> eLife. 2, e01222(2013).</li>
<li>Kowalska-Krochmal, B., Dudek-Wicher, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+inhibitory+concentration+of+antibiotics%3A+methods%2C+interpretation%2C+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">The minimum inhibitory concentration of antibiotics: methods, interpretation, clinical relevance.</a> Pathogens. 10 (2), 165(2021).</li>
<li>Robinson, J. L., Jaslove, J. M., Murawski, A. M., Fazen, C. H., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+network+analysis+reveals+that+nitric+oxide+reductase+prevents+metabolic+cycling+of+nitric+oxide+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">An integrated network analysis reveals that nitric oxide reductase prevents metabolic cycling of nitric oxide by Pseudomonas aeruginosa.</a> Metab Eng. 41, 67-81 (2017).</li>
<li>Wolff, J. A., MacGregor, C. H., Eisenberg, R. C., Phibbs, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+catabolite+repression+control+mutants+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of catabolite repression control mutants of Pseudomonas aeruginosa PAO.</a> J Bacteriol. 173 (15), 4700-4706 (1991).</li>
<li>Batchelder, J. I., Taylor, A. J., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolites+augment+oxidative+stress+to+sensitize+antibiotic-tolerant+Staphylococcus+aureus+to+fluoroquinolones%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Metabolites augment oxidative stress to sensitize antibiotic-tolerant Staphylococcus aureus to fluoroquinolones.</a> mBio. , e0271424(2024).</li>
<li>Power, A. D., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar+and+agarose+used+for+Staphylococcus+aureus+biofilm+cultivation+impact+fluoroquinolone+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Agar and agarose used for Staphylococcus aureus biofilm cultivation impact fluoroquinolone tolerance.</a> J Appl Microbiol. 135 (8), lxae191(2024).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Peng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BaSiC+tool+for+background+and+shading+correction+of+optical+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images.</a> Nat Commun. 8, 14836(2017).</li>
<li>Ducret, A., Quardokus, E., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicrobeJ%2C+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nat Microbiol. 1 (7), 16077(2016).</li>
<li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oufti%3A+an+integrated+software+package+for+high-accuracy%2C+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Mol Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li>
<li>Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-cell+chemostat%3A+an+agarose-based%2C+microfluidic+device+for+high-throughput%2C+single-cell+studies+of+bacteria+and+bacterial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities.</a> Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>BaSiC</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/marrlab/BaSiC</td><td></td></tr><tr><td>Sertifikalı Moleküler Biyoloji Agaroz</td><td>Biorad</td><td>1613101</td><td></td></tr><tr><td>Fiji-ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td></td></tr><tr><td>Değiştirilebilir Kapak Camı Tabağı</td><td>Bioptechs</td><td>190310-35</td><td>Agaroz pedleri hazırlamak için 35 mm ICD; 30 mm (# 1.5) lamel</td></tr> <tr><td>ile birlikte gelirLumencor Spectra 7 LED ışık motoru</td><td>Lumencor</td><td>https://lumencor.com/products/spectra-light-engine</td><td>Spectra 7 LED ışık motoru</td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Premier sürüm 7.10.5</td><td></td></tr><tr><td>pco.edge 4.2 bi sCMOS kamera</td><td>Excelitas</td><td>https://www.excelitas.com/product/pcoedge-42-bi-usb-scmos-camera</td><td>sCMOS kamera</td></tr><tr><td>PeCon canlı hücre kuluçka odası</td><td>peCon</td><td>https://www.pecon.biz/</td><td></td></tr> <tr><td>Thomas Scientific Yuvarlak kapak camı, #1,5 kalınlık, 25 mm, 100 paket</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1272770</td><td>25 mm (#1,5) lamel</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200M mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/widefield-microscopes/axiovert-for-materials.html</td><td>Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil Ph3 M27 objektif, Lumencor Spectra 7 LED ışık motoru ve pco.edge 4.2 bi sCMOS kamera (6.5 mm piksel boyutu) ile ters mikroskop</td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa ve staphylococcus aureus heterojen fenotiplerinin hızlandırılmış epifloresan mikroskobu görüntülemesi

Time-Lapse Epifluorescence Microscopy Imaging of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Heterogeneous Phenotypes

Raportör plazmitlerin P. aeruginosa ve S. aureus'a başarılı bir şekilde dahil edilmesi, doğru seçici antibiyotiklerde büyüme ile gösterilir ve koloni PCR ve/veya dizileme ile doğrulanabilir. Modifiye edilmiş suşlar, ilgilenilen genin indüklendiğinin bilindiği koşullara tabi tutularak fenotipik raportörler olarak doğrulanmalıdır ve ortaya çıkan floresan, akış sitometrisi, spektrofotometri veya epifloresan mikroskobu ile ölçülebilir (Şekil 1).
Sonraki deneyler için kullanılacak bir antibiyotik dozunun (dozlarının) seçimini kolaylaştırmak için, ilgilenilen P. aeruginosa veya S. aureus suşları için konsantrasyona bağlı antibiyotik kalıcı testler yapın. Konsantrasyona bağlı tahliller tipik olarak, daha düşük antibiyotik konsantrasyonlarında dik bir başlangıç eğimi ve daha yüksek konsantrasyonlarda bir plato veya daha az dik eğim ile iki fazlı bir eğri ile sonuçlanır. Bununla birlikte, bazı antibiyotik-tür çiftleri için, belirgin bir bifazik eğri ortaya çıkmayabilir. Örneğin, S. aureus delafloxacin eğrisi için eğri açıkça iki fazlıdır (Şekil 3A), ancak P. aeruginosa levofloksasin eğrisi değildir (Şekil 3B)15. Bu senaryoda, MIC'nin en az 10 katı olan bir konsantrasyon seçeriz (örneğin, 5 μg / mL, bu da P. aeruginosa için MIC'nin yaklaşık 15 katıdır)15. Bununla birlikte, 15x levofloksasin MİK sadece ~% 0.001 P. aeruginosa ile sonuçlandığından, hücreleri antibiyotik içermeyen agaroz pedlerinde iyileşirken görüntülerken kalıcıları görmek istiyorsak 1 μg / mL levofloksasin tedavisi kullanıyoruz (Ek Video 6); Aksi takdirde, birden çok kalıcıyı görüntülemek için gereken görüş alanı sayısı engelleyici hale gelir.
Görüntülemenin başlangıcında, ideal numune ve agaroz ped hazırlığı, görüş alanı boyunca düzlemsel görünmeli, büyük döküntüler, kırışıklıklar veya hava kabarcıkları içermemeli ve eşit olarak dağılmış tek hücrelerle görünmelidir. İyi dağılmış tek hücrelerin elde edilmesi, numune seyreltmesinin veya yeniden süspansiyonunun optimizasyonunu gerektirebilir. S. aureus için, hücreler küçük kümeler oluşturma eğilimindedir ve agaroz pedine tohumlanmadan önce iyice girdaplanmaları gerekir (Şekil 4 ve Şekil 5). P. aeruginosa için hücreler, süspansiyon halinde yapışkan bir hücre dışı matris ile kaplanmış agregalar oluşturabilir; Tek hücreleri görüntülemek için bu numuneleri iyice pipetlemek ve agregaları parçalamak gerekir. 
Bir görüntüleme deneyinin sona ermesinden sonra, görüntülerin başarılı bir zaman atlamalı görüntüsü odakta, sabit bir şekilde aydınlatılmış ve deney boyunca xy düzleminde minimum sapma ile görünecektir. Ek Video 7 , optimum bir görüntü alımını temsil eder: t, Ek Video 4'ün gölge veya sapma düzeltmesinden önceki faz kanalıdır. Yoğuşma (aşırı nemlendirme veya yetersiz numune ısınmasından kaynaklanan) üst 25 mm'lik lamel üzerinde su damlacıklarının oluşmasına neden olarak ışığı bozar ve odak düzlemini otomatik odaklama algoritmasının maksimum arama aralığının dışına iterse odak kaybı meydana gelebilir (Ek Video 8). Aydınlatmadaki değişiklik genellikle görüntüleme sırasında yetersiz daldırma yağını gösterir. Sahne alanı çok hızlı hareket ederse, objektif üzerindeki yağ geriye doğru sürüklenebilir ve görüntüler elde edildiğinde hala yetişiyor olabilir. Bu, hareket hızını yavaşlatmak için alım kontrollerini ayarlayarak veya bir sonraki konuma hareket ile görüntü alımı arasında bir duraklama ekleyerek azaltılabilir. Büyük örnek kayması, bazıları yerinde kalırken görüş alanı boyunca çizgi çizen birçok hücre gibi görünecektir (Ek Video 9). Bu tipik olarak deneylerde daha sonra ortaya çıkar, çünkü agaroz ped yetersiz nem kontrolü nedeniyle susuz kalmıştır. Bu belgede sunulan agaroz ped hazırlığı, numune stabilitesini kolaylaştırmak için tasarlanmıştır, ancak optimum görüntü elde etmek için numunenin ve çevresindeki ortamın uygun şekilde ısıtılması/nemlendirilmesi gereklidir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig1.jpg"> 
Şekil 1: Floresan raportör suşları, ilgilenilen bir genin ifadesini aydınlatır. (A) S. aureus , Protokol 1'e göre ilgilenilen bir gen için bir GFP transkripsiyonel raportörü ile transdüksiyona tabi tutuldu. Raportör suşu 24 saat boyunca antibiyotikle muamele edildi, PBS ile yıkandı ve daha sonra iyileşme sırasında görüntüleme için CA-MHB artı propidyum iyodür (1.6 μM) ve kloramfenikolden (raportör plazmid bakımı için 10 μg / mL) yapılmış bir agaroz ped üzerine ekildi (Ek Video 1). (B) P. aeruginosa , ilgilenilen bir protein için mScarlet'e bağlı bir translasyonel raportör taşıyan bir plazmit ile dönüştürüldü26. Raportör suşu 5 saat boyunca antibiyotikle muamele edildi, PBS ile yıkandı ve daha sonra iyileşme sırasında görüntüleme için BSM artı Tet'ten (75 μg / mL; muhabir plazmid bakımı için) yapılmış bir agaroz ped üzerine ekildi (Ek Video 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig2.jpg"> 
Şekil 2: Bakteriyofajın çoğaltılması ve hasat edilmesi. (A) Altı plaka, S. aureus RN4220'nin çimleri üzerinde altı farklı miktarda seyreltilmiş faj stoğunu göstermektedir. Kırmızı ana hatlar, en açık olan plakadan (koyu kırmızı anahat; 1 x109 PFU/mL) sonraki iki seyreltmeye (1 x108 ve 1 x 107 PFU/mL) kadar hasat edilecek üç plakayı gösterir. Siyah oklar tek tek plaklara işaret ediyor. (B) Plakalardan faj elde etmek için, yumuşak agar tabakasını kazıyın (solda), bulamacı bir sonraki seyreltme plakasına (ortada) aktarın ve her üç plakadan yumuşak agarı bir araya getirdikten sonra, santrifüjleme için konik bir tüpte birleştirin (sağda). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig3.jpg"> 
Şekil 3: Temsili konsantrasyona bağlı kalıcı deneyler. Konsantrasyona bağlı florokinolon kalıcılığı durağan fazda değerlendirildi (A) S. aureus (delafloksasine karşı) ve (B) P. aeruginosa (levofloksasine karşı). Daha sonraki deneylerde 5 μg/mL delafloksasin (kırmızı daire) kullanılır, çünkü S. aureus öldürme bu konsantrasyonda plato haline gelmiştir. P. aeruginosa ile sonraki deneyler için en az 1 μg / mL levofloksasin (kırmızı daire) bir dozaj kullanılacaktır. Bakteri öldürmenin P. aeruginosa için plato yapmadığını, ancak kalıcı bir alt popülasyonu gösteren bifazik eğrinin daha az dik bir "ikinci aşaması" olduğunu unutmayın. Panel 3B, Hare ve ark.15'in izniyle uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig4.jpg"> 
Şekil 4: Antibiyotik tedavisi sırasında bakteri fenotiplerinin görüntülenmesi. Sabit faz (A) S. aureus ve (B) P. aeruginosa hücreleri, florokinolon antibiyotikler içeren agaroz pedlerine ekildi ve tedavi sırasında izlendi: S. aureus için 5 μg / mL delafloksasin (Ek Video 3) ve P. aeruginosa için 5 μg / mL levofloksasin (Ek Video 4) 15. Propidium iyodür (PI; P. aeruginosa için 16 μM, S. aureus için 1.6 μM) ölü veya ölmekte olan hücreleri işaretlemek için pedlere eklendi. S. aureus hücreleri, FQ varlığında büyük ölçüde sağlam ve canlı kalırken, çoğu P. aeruginosa hücresi, parçalanmadan ve ölmeden önce yuvarlak sferoplast oluşturmak da dahil olmak üzere ciddi morfolojik değişikliklere uğrar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig5.jpg"> 
Şekil 5: Kurtarma sırasında kalıcıların izlenmesi. (A) S. aureus ve (B) P. aeruginosa popülasyonları, florokinolonlarla ( S. aureus için 5 μg/mL delafloksasin ve P. aeruginosa için 1 μg/mL levofloksasin) muamele edildikten sonra taze ortam içeren agaroz pedlerine ekildi ve tedavi sonrası iyileşmeleri sırasında izlendi (Ek Video 5 ve Ek Video 6). Görülen perisisterlar her panelde ilk iki karede yeşil oklarla belirtilmiş ve antibiyotik tedavisi sırasında sağlam ve canlı kalmıştır. İlk gecikme döneminden sonra, ısrarcılar bölünmeye başladı ve yeni döllere yol açtı (yeşil dairelerle gösterilir). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig6.jpg"> 
Şekil 6: Mikroskop numunesi hazırlama. (A) Değiştirilebilir bir lamel kabı ("hazne") kullanılarak numune hazırlama iş akışının şeması. (B) Demonte edilen haznenin ve tek tek bileşenlerinin resmi. (C) Tamamen monte edilmiş odanın resmi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Video 1: S. aureus persister. Şekil 1A'daki görüntüleri içeren video dosyası. Kısaca, ilgilenilen bir gen için GFP transkripsiyonel raportörü taşıyan S. aureus , 24 saat boyunca antibiyotik ile tedavi edildi, PBS ile yıkandı, daha sonra iyileşme sırasında görüntüleme için CA-MHB artı propidyum iyodür (1.6 μM) ve kloramfenikol (10 μg/mL) ile yapılan bir agaroz ped üzerine tohumlandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS1_S-aureus_persister_video.avi" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Video 2: P. aeruginosa kalıcı. Şekil 1B'deki görüntüleri içeren video dosyası. Kısaca, ilgilenilen bir protein için mScarlet'e bağlı bir translasyonel raportör taşıyan P. aeruginosa, 5 saat boyunca antibiyotikle muamele edildi, PBS ile yıkandı, daha sonra iyileşme sırasında görüntüleme için BSM artı Tet (75 μg/mL) ile yapılan bir agaroz pedine ekildi26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS2_Paeru-fluorescent-persister.avi" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Video 3: Antibiyotik tedavisi sırasında S. aureus. Kimyasal olarak tanımlanmış zengin ortamlarda yetiştirilen durağan fazlı bir S. aureus kültürü, kültürün hücresiz şartlandırılmış ortamından propidyum iyodür (1.6 μM) ve delafloksasin (5 μg/mL) ile yapılan agaroz pedlerine tohumlandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS3_S-aureus_treatment.avi" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Video 4: Antibiyotik tedavisi sırasında P. aeruginosa. BSM'de yetiştirilen durağan fazlı bir P. aeruginosa kültürü, paralel olarak BSM'de yetiştirilen bir P. aeruginosa kültüründen hücresiz şartlandırılmış ortamdan yapılan agaroz pedlerine tohumlandı; agaroz pedi ayrıca propidyum iyodür (16 μM) ve levofloksasin (5 μg/mL) içeriyordu. Bu video Hare ve ark.15'in izniyle uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS4_P-aeruginosa_treatment.avi" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Video 5: S. aureus antibiyotik sonrası iyileşme sırasında. S. aureus , kimyasal olarak tanımlanmış zengin besiyerlerinde durağan faza büyütüldü. Sabit faz kültürleri, 24 saat boyunca test tüplerinde 5 μg / mL delafloksasin ile muamele edildi, PBS ile yıkandı ve daha sonra görüntüleme için propidyum iyodür (1.6 μM) içeren antibiyotik içermeyen CA-MHB agaroz pedlerine tohumlandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS5_S-aureus_recovery.avi" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Video 6: P. aeruginosa antibiyotik sonrası iyileşme sırasında. BSM'de yetiştirilen durağan fazlı bir P. aeruginosa kültürü, 7 saat boyunca test tüplerinde 1 μg / mL levofloksasin ile muamele edildi, PBS ile yıkandı, daha sonra görüntüleme için propidyum iyodür (16 μM) içeren antibiyotik içermeyen BSM agaroz pedlerine tohumlandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS6_P-aeruginosa_recovery.avi" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Video 7: Optimum görüntü elde etme örneği. Bu video, optimum zaman atlamalı çekimin bir örneği olarak görüntü işlemeden önceki Ek Video 4'ün faz kanalıdır. Deney boyunca minimum kaymaya, sabit aydınlatmaya ve odak bakımına dikkat edin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS7_uncorrected-Paeru.avi" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Video 8: Yoğuşma nedeniyle optimal olmayan görüntü elde etme örneği. Bu video, büyük olasılıkla numunenin yanlış ısıtılması ve/veya görüntüleme ortamının aşırı nemlendirilmesi nedeniyle hazne üzerindeki yoğuşma nedeniyle, görüntü alımının zayıf odaktan etkilendiği bir deneyin bir bölümünü göstermektedir. Görüntülenen örnek, bir BSM agaroz pedi üzerinde antibiyotik sonrası geri kazanım sırasında levofloksasin ile muamele edilen P. aeruginosa idi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS8_Suboptimal_Imaging_Condensation.avi" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Video 9: Sapma nedeniyle optimal olmayan görüntü elde etme örneği. Bu video, muhtemelen dehidrasyon ve agaroz pedin lamel üzerinden büzülmesi/kaldırılması nedeniyle, görüntü elde etmenin numune kaymasından etkilendiği bir deneyin bir bölümünü göstermektedir. Görüntülenen örnek, levofloksasin ve propidyum iyodür içeren bir agaroz ped üzerinde P. aeruginosa idi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS9_Suboptimal_Drift.avi" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: 25mm-3D-divider-for-35mmBioptechs.stl <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/25mm-3D-divider-for-35mmBioptechs.stl" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus Heterojen Fenotiplerinin Hızlandırılmış Epifloresan Mikroskobu Görüntülemesi

Antibiotic persistence is a phenomenon in which a small number of bacterial cells in a genetically susceptible population survive antibiotic treatment ...

time-lapse-epifluorescence-microscopy-imaging-pseudomonas-aeruginosa

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Protokolü Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (CLSM) mikrobiyal biyofilm büyüyen ve analiz etmek için bir akış hücresi sistemi uygulama nitelendirdi.

Pseudomonas aeruginosa ve Saccharomyces cerevisiae Biyofilm Akış Hücreler

Bu protokol, otomatik floresan zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak zaman farklı bakteriler tek hücre davranışlarını izlemek için bir adım-adım yordam sağlar. Ayrıca, biz nasıl mikroskobu görüntüleri analiz etmek için yönergeler sağlar.

Canlı Hücre Görüntüleme Bacillus subtilis Ve Streptococcus pneumoniae Otomatik Zaman atlamalı Mikroskopi

Kaynak: Chetrit, D. ve diğerleri.  Legionella pnömofila nokta/icm salgı sisteminin mekansal ve zamansal özelliklerini çözmek için canlı hücre görüntüleme ve kriyo-elektron tomografi uygulanıyor. J. Vis. Exp. (2020).Bu video, floresan olarak işaretlenmiş patojenik bakterilerin hazırlanmasını ve görüntülenmesini göstermektedir. Agarose pedleri önce hazırlanır ve yapıştırıcı bir çerçeve içine yerleştirilir. Hücreleri hareketsiz hale getirmek için pedde floresan protein ifade eden genetik olarak...

Flüoresans Etiketlenmiş Bakterilerin Örnek Hazırlanması ve Görüntülemesi

Source: Jackson, L., et al. Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the in situ visualization of Pseudomonas aeruginosa within chemically cleared cystic fibrosis sputum using fluorescent labeling and confocal microscopy to reveal bacterial localization and biofilm structure.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa in Sputum Samples from Cystic Fibrosis Patients

Bu video, antimikrobiyal tedavinin Pseudomonas aeruginosa (Pa) agregatları üzerindeki etkisini incelemek için bir in vitro tekniği göstermektedir. Floresan etiketli Pa hücreleri, enfeksiyon sırasındaki büyüme modelini taklit ederek agregalar halinde büyütülür. Agregalara öldürücü olmayan bir antibiyotik kolistin konsantrasyonu ile meydan okunduktan sonra, bakteri-antibiyotik etkileşiminin gerçek zamanlı değerlendirmesi floresan mikroskobu ile gerçekleştirilir.

Bakteriyel Agregatlar Üzerinde Antimikrobiyal Tedavileri İncelemek İçin İn Vitro Bir Teknik

Biz tarafından salgılanan PSM ve diğer toksinlerin etkisini araştırmak için yöntemler...

Etkileşimi incelenmesi<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Akım Sitometri ve Time Lapse Mikroskopi tarafından Nötrofiller ile

Fiksasyon, parafin katıştırma ve mikrobiyal koloni biyofilmler için ince parça teknikler açıklanmaktadır. Hazır örnekleri, mikroskobu tarafından biyofilm altyapı ve muhabir ifade desenleri görüntülenmeyecektir.

Parafin gömme ve ince mikrobiyal koloni biyofilmler mikroskobik analizlerin yapıldığı için kesit

Bu canlı-bakteriyel hücre görüntüleme protokolü zaman içinde tek hücre düzeyinde birden fazla bakteri türü arasındaki etkileşimlerin görselleştirilmesiiçin izin verir. Hızlandırılmış görüntüleme, tek tek kültür veya ortak kültürdeki her bakteri türünün gözlemlenmesine olanak sağlar ve bireysel hücre hareketliliği ve canlılığı da dahil olmak üzere çok türler arası bakteri topluluklarındaki türler arası etkileşimleri sorgular.

Tek Hücreli Türler Arası Bakteri Etkileşimlerinin Kinetik Görselleştirilmesi

Sentetik kistik fibrozis balgam ortamı (SCFM2), bakteriyel agregaları yüksek çözünürlükte gözlemlemek için hem konfokal lazer tarama mikroskopisi hem de floresan ile aktive hücre sıralama ile birlikte kullanılabilir. Bu makalede, antimikrobiyal tedavi sırasında toplam popülasyonları gelecekteki çalışmalar için bir platform olarak değerlendirme yöntemleri ayrıntılı olarak açıklar.

Pseudomonas aeruginosa Enfeksiyon Modelinin Gerçek Zamanlı Değerlendirilmesi için Araçlar

Antibiyotik kalıcılığı, hassas bir izojenik popülasyondaki küçük alt popülasyonların yüksek dozda bakterisidal antibiyotikleri geçici olarak tolere etme yeteneğini tanımlar. Bu protokol, Escherichia coli'yi ölümcül ofloksasin dozlarına maruz bıraktıktan sonra moleküler ve hücresel seviyelerde antibiyotik kalıcılık fenotipini karakterize etmek için yaklaşımları birleştirmektedir.

Escherichia coli'de Antibiyotik Kalıcılığının Popülasyon ve Tek Hücre Analizi

Öğrenin, Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus'ta persister hücrelerinin antibiyotik direncini zaman atlamalı epifloresan mikroskopi ile görüntülemeyi. Bu yöntem, enfeksiyon tedavilerini geliştirmek için bakteri sağkalım stratejilerini anlamaya yardımcı olur.

Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus Heterojen Fenotiplerinin Hızlandırılmış Epifloresan Mikroskobu Görüntülemesi

Daha fazla video keşfet