Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus Heterojen Fenotiplerinin Hızlandırılmış Epifloresan Mikroskobu Görüntülemesi

Laboratuvarımızın araştırması, antibiyotiklerin neden başarısız olduğuna odaklanmaktadır. Özellikle, antibiyotik tarafından öldürülmesi gereken bakteri popülasyonlarında kalıcı olarak adlandırılan birkaç hücreyle ilgileniyoruz, ancak antibiyotik tedavisinden kurtulabilirler. Ve bu inatçıların antibiyotik tedavisi bittikten sonra enfeksiyonların nüksetmesine neden olduğu düşünülmektedir.

Bu yüzden, hayatta kalma stratejilerini daha iyi anlamak için bu kalıcıların gen ekspresyonuna ve metabolizmasına bakmakla ilgileniyoruz. Kalıcı alan için mevcut zorluk, verimi tek hücre duyarlılığı ile dengelemektir. Tek bir hücrenin tedaviden sonra bölünme yeteneğini, onu kalıcı olarak nitelendirecek ve hücrenin iç işleyişini anlamamıza yardımcı olabilecek bazı ölçülebilir fenotiplerle eşleştirmemiz gerekiyor.

Ve bunu binlerce hücrenin tek bir kalıcıyı bile yakalaması için yapmamız gerekebilir. Protokolümüz, teknik olarak zor olabilen kesin olmayan agar sandviç yöntemlerine veya mikroakışkan cihazların imalatına kıyasla kolayca uygulanabilecek şekilde geliştirilmiştir. Protokolümüzün minimum malzemeyle zaman içinde tekrarlanabilir ve kararlı görüntüleme sağladığını gördük, bu da hem uygun maliyetli hem de kaliteli veri toplama için minimum israf anlamına geliyor.

Gelecekteki araştırmamız, patojenlerin farklı antibiyotik sınıflarıyla tedaviye nasıl yanıt verdiğini ve tedaviden nasıl kurtulduğunu incelemek için omik ve tek hücre yaklaşımlarının bir kombinasyonunu kullanacaktır. Nihai hedefimiz, klinik enfeksiyonların tedavisini iyileştirmek için yeni stratejiler geliştirmek için bu anlayıştan yararlanmaktır. Başlamak için, değiştirilebilir bir kapak kayar kabının paslanmaz çelik tabanının altına 30 milimetrelik steril bir kapak fişi yerleştirin.

Polikarbonat eki yavaşça tabana geçirin, kapak kaymasının haznenin tabanını oluşturduğundan emin olun ve takılı silikon O-ringi sıkıştırarak yerine kapatın. Modal hücrelerin çapraz kontaminasyonunu önlemek için 30 milimetrelik kapak kaymasına karşı özel bir 3D baskılı bölücü yerleştirin. Tercih edilen ortamı kullanarak 50 mililitrelik konik bir tüpte% 1.5 agaroz hazırlayın ve karıştırmak için hafifçe döndürün.

Konik borunun kapağını gevşetin ve cam kabın veya mikrodalgaya dayanıklı bir tutucunun içine yerleştirin. Agaroz karışımını yüksekte mikrodalgada ısıtın, köpürmeyi önlemek için her üç ila dört saniyede bir döndürmek ve karıştırmak için durun. Bir dakika sonra, karışımda erimemiş agaroz kalıp kalmadığını kontrol edin.

Düzgün bir şekilde berraksa, agarozun kısa bir süre yaklaşık 60 santigrat dereceye kadar soğumasına izin verin. İlgili antibiyotikleri veya kalıpları ekleyin ve kabarcık oluşumunu önleyerek karıştırmak için hafifçe döndürün. İki mililitre agarozu 30 milimetrelik kapak kayma ile hazneye pipetleyin.

Üst hazne açıklığındaki agarozun üzerine 25 milimetrelik steril bir kapak kızağını nazikçe yerleştirin. Pedin bir ila iki saat katılaşmasına izin verin. Ped katılaştığında, 25 milimetrelik kapak kızağı üzerindeki her bir numunenin konumlarını ve kimliklerini işaretlemek için ince uçlu bir kalıcı işaretleyici kullanın.

Hazneyi, paslanmaz çelik taban halkası yukarı bakacak şekilde ters çevirin ve tabanı açarken polikarbonat eki dikkatlice altında tutun. Paslanmaz çelik tabanı bir kenara koyun. 30 milimetrelik kapak kayışını agaroz pedinden kaydırın ve atın.

PBS'deki Pseudomonas aeruginosa veya Staphylococcus aureus hücre kültürlerini, tek hücreleri görselleştirmek için uygun seyrek bir yoğunluğa seyreltin. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyin. Seyreltilmiş hücre süspansiyonlarının beş mikrolitresini agaroz pedi üzerindeki işaretli yerlerde tespit edin.

Lekeler kuruduktan sonra, pedin üzerine yeni bir steril 30 milimetrelik örtü yerleştirin. Ardından polikarbonat eki bir elinizle tutun ve paslanmaz çelik tabanı kapak kızağının üzerinden yavaşça yeniden geçirin. Hazne kapatıldıktan sonra, agarozun 30 milimetrelik kapak kaymasının yüzeyi ile temas edip etmediğini kontrol edin.

Cımbızın kör ucunu kullanarak, agaroz 30 milimetrelik kapak kızağına yüzeyi boyunca eşit şekilde temas edene kadar 25 milimetrelik kapak kızağına hafifçe bastırın. Başlamak için, sahne üstü inkübatörü ve büyük hazneli inkübatör sıcaklıklarını 37 santigrat dereceye ayarlayarak mikroskop ve görüntüleme odası çevre kontrollerini hazırlayın. Ardından, hazne nemlendiricisini açın.

Bir agaroz ped preparatını sahne üstü inkübatöre yerleştirin ve dengeyi sağlamak için hazneyi kapatın. Yerleşik otomatik odaklama algoritmasını çok boyutlu alım sırasında faz kanalını kullanacak şekilde yapılandırarak MetaMorph yazılımını görüntü alımı için hazırlayın. Sahne Alanı sekmesinde, her örnek için birden fazla sahne alanı konumu ayarlayın ve görüş alanlarını eşit olarak dağıtılmış hücre yoğunluğuyla hedefleyin.

Ardından Hızlandırılmış Çekim sekmesinde, görüntü alma süresini ve sıklığını yapılandırın. Dalga boyları sekmesinde, alım için istenen kanalları ayarlayın ve örneğin sinyal yoğunluğuna göre maruz kalma sürelerini ayarlayın. Agaroz pedi haznede ısındıktan sonra, nemlendirme kapağını sahne üstü inkübatöre yerleştirin.

Ardından, mikroskopta faz kontrastından diferansiyel girişim kontrast moduna geçin. Uygun Kohler aydınlatmasını elde etmek için kondansatörü ve diyaframı ayarlayın. Ayarlamaları tamamladıktan sonra faz kontrast moduna geri dönün.

Her aşama konumuna gidin, odağı ayarlayın ve sahne konumunu yeni odak düzlemine sıfırlayın. Çok boyutlu edinimi başlatmak için Edin'e tıklayın. Alımdan sonra, görüntüleri derlemek için MetaMorph'u açın ve istenen kanalları veya dalga boylarını seçmek ve her aşama konumu için tüm zaman noktalarını dahil etmek için Çok Boyutlu Verileri İnceleme uygulamasını kullanın.

Görüntüleri Yükle'ye tıklayın ve her derlemeyi ilgili kanal adıyla bir TIFF dosyası olarak kaydedin. Staphylococcus aureus hücrelerinin hızlandırılmış görüntülemesi, antibiyotik tedavisi ilerledikçe propidyum iyodür boyamasını göstererek yapıldı ve bu da membran hasarını gösterdi. Antibiyotik tedavisi sırasında yapılan görüntülemede propidyum iyodür boyamasının eşlik ettiği sferoplast oluşumu, filamentasyon ve sitoplazmik kondensasyon geçiren hücreler görüldü.

Başarılı agaroz ped hazırlama ve görüntüleme koşulları, antibiyotik tedavisinden iyileşen Staphylococcus aureus'un ve antibiyotik tedavisinden iyileşen Pseudomonas aeruginosa'nın tek hücrelerden türetilen büyük kümeler oluşturmak üzere gözlenmesini sağlamıştır.