Name: Diseke Larva Zebra Balığının Nöromüsküler Kavşağında Sinaptik Vezikül Geri Dönüşümünün Canlı Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Öğrenin, Danio rerio larvalarında sinaptik vezikül geri dönüşümünü canlı görüntülemeyi. Bu maliyet-etkin pHluorin tabanlı yöntem, nöromüsküler kavşak dinamiklerini ve sinaptik iletim mekanizmalarını incelemek için güçlü bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle.</a> Ann Rev Neurosci. 27, 509-547 (2004).</li>
<li>Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+presynaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualizing presynaptic function.</a> Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+ph-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+phluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The use of phluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li>
<li>Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle+revisited%3A+New+insights+into+the+modes+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms.</a> J Neurosci. 39 (42), 8209-8216 (2019).</li>
<li>Egashira, Y., Takase, M., Takamori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vacuolar-type+h%2B+atpase-mediated+proton+influx+into+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vacuolar-type h+ atpase-mediated proton influx into synaptic vesicles.</a> J Neurosci. 35 (8), 3701-3710 (2015).</li>
<li>Egashira, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+ph+dynamics+in+gabaergic+synaptic+vesicles+illuminates+the+mechanism+and+kinetics+of+gaba+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unique ph dynamics in gabaergic synaptic vesicles illuminates the mechanism and kinetics of gaba loading.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10702-10707 (2016).</li>
<li>Schoch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snare+function+analyzed+in+synaptobrevin%2Fvamp+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Snare function analyzed in synaptobrevin/vamp knockout mice.</a> Science. 294 (5544), 1117-1122 (2001).</li>
<li>Takamori, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+anatomy+of+a+trafficking+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular anatomy of a trafficking organelle.</a> Cell. 127 (4), 831-846 (2006).</li>
<li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).</li>
<li>Fernandez-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicles+interchange+their+membrane+proteins+with+a+large+surface+reservoir+during+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling.</a> Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).</li>
<li>Kwon, S. E., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptophysin+regulates+the+kinetics+of+synaptic+vesicle+endocytosis+in+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptophysin regulates the kinetics of synaptic vesicle endocytosis in central neurons.</a> Neuron. 70 (5), 847-854 (2011).</li>
<li>Voglmaier, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+endocytic+pathways+control+the+rate+and+extent+of+synaptic+vesicle+protein+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct endocytic pathways control the rate and extent of synaptic vesicle protein recycling.</a> Neuron. 51 (1), 71-84 (2006).</li>
<li>Balaji, J., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-vesicle+imaging+reveals+that+synaptic+vesicle+exocytosis+and+endocytosis+are+coupled+by+a+single+stochastic+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-vesicle imaging reveals that synaptic vesicle exocytosis and endocytosis are coupled by a single stochastic mode.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (51), 20576-20581 (2007).</li>
<li>Santos, M. S., Park, C. K., Foss, S. M., Li, H., Voglmaier, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+of+the+vesicular+gaba+transporter+to+functional+vesicle+pools+by+an+atypical+dileucine-like+motif%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sorting of the vesicular gaba transporter to functional vesicle pools by an atypical dileucine-like motif.</a> J Neurosci. 33 (26), 10634-10646 (2013).</li>
<li>Wen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+and+asynchronous+modes+of+synaptic+transmission+utilize+different+calcium+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synchronous and asynchronous modes of synaptic transmission utilize different calcium sources.</a> Elife. 2, e01206(2013).</li>
<li>Wen, H., Hubbard, J. M., Wang, W. C., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatigue+in+rapsyn-deficient+zebrafish+reflects+defective+transmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fatigue in rapsyn-deficient zebrafish reflects defective transmitter release.</a> J Neurosci. 36 (42), 10870-10882 (2016).</li>
<li>Wyatt, R. M., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+synaptic+vesicle+release+at+neuromuscular+synapses+of+mice+expressing+synaptophluorin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in synaptic vesicle release at neuromuscular synapses of mice expressing synaptophluorin.</a> J Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).</li>
<li>Tabares, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+synaptic+function+at+the+neuromuscular+junction+of+a+mouse+expressing+synaptophluorin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monitoring synaptic function at the neuromuscular junction of a mouse expressing synaptophluorin.</a> J Neurosci. 27 (20), 5422-5430 (2007).</li>
<li>Odermatt, B., Nikolaev, A., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+of+luminance+and+contrast+by+linear+and+nonlinear+synapses+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Encoding of luminance and contrast by linear and nonlinear synapses in the retina.</a> Neuron. 73 (4), 758-773 (2012).</li>
<li>Almeida, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+induces+axonal+hotspots+of+synaptic+vesicle+fusion+that+promote+sheath+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Myelination induces axonal hotspots of synaptic vesicle fusion that promote sheath growth.</a> Curr Biol. 31 (17), 3743-3754.e5 (2021).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+silent+sensory+hair+cells+in+zebrafish+are+recruited+after+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage.</a> Nat Comm. 9 (1), 1388(2018).</li>
<li>Vaithianathan, T., Henry, D., Akmentin, W., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+dynamics+of+synaptic+vesicle+trafficking+and+fusion+at+the+presynaptic+active+zone%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Nanoscale dynamics of synaptic vesicle trafficking and fusion at the presynaptic active zone.</a> eLife. 5, e13245(2016).</li>
<li>Vaithianathan, T., Wollmuth, L. P., Henry, D., Zenisek, D., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+newly+released+synaptic+vesicle+proteins+at+ribbon+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Tracking newly released synaptic vesicle proteins at ribbon active zones.</a> iScience. 17, 10-23 (2019).</li>
<li>Shrestha, A. P., Vaithianathan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+dynamics+of+single+fused+synaptic+vesicle+proteins+from+a+single+ribbon+active+zone+in+zebrafish+retinal+bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tracking the dynamics of single fused synaptic vesicle proteins from a single ribbon active zone in zebrafish retinal bipolar cells.</a> STAR Protoc. 3 (1), 101107(2022).</li>
<li>Egashira, Y., Zempo, B., Sakata, S., Ono, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+neuromuscular+junction+research+prompted+by+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opinion+Physiol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in neuromuscular junction research prompted by the zebrafish model.</a> Curr Opinion Physiol. 4, 70-75 (2018).</li>
<li>Egashira, Y., Kumade, A., Ojida, A., Ono, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneously+recycling+synaptic+vesicles+constitute+readily+releasable+vesicles+in+intact+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneously recycling synaptic vesicles constitute readily releasable vesicles in intact neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 42 (17), 3523-3536 (2022).</li>
<li>Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+synaptic+plasticity+in+acute+hippocampal+slices+maintained+in+a+small-volume+recycling-%2C+perfusion-%2C+and+submersion-type+chamber+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Recording synaptic plasticity in acute hippocampal slices maintained in a small-volume recycling-, perfusion-, and submersion-type chamber system.</a> J Vis Exp. (131), e55936(2018).</li>
<li>Myers, P. Z., Eisen, J. S., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+axonal+outgrowth+of+identified+motoneurons+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development and axonal outgrowth of identified motoneurons in the zebrafish.</a> J Neurosci. 6 (8), 2278-2289 (1986).</li>
<li>Westerfield, M., Mcmurray, J. V., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+motoneurons+and+their+innervation+of+axial+muscles+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish.</a> J Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).</li>
<li>Brehm, P., Wen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+neuromuscular+junction%3A+The+power+of+n%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Zebrafish neuromuscular junction: The power of n.</a> Neurosci Lett. 713, 134503(2019).</li>
<li>Ben Fredj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+and+activity-dependent+competition+regulates+axon+arbor+maturation%2C+growth+arrest%2C+and+territory+in+the+retinotectal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection.</a> J Neurosci. 30 (32), 10939-10951 (2010).</li>
<li>Mandal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+mitochondrial+transport+is+essential+for+organelle+distribution+and+health+in+zebrafish+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retrograde mitochondrial transport is essential for organelle distribution and health in zebrafish neurons.</a> J Neurosci. 41 (7), 1371-1392 (2021).</li>
<li>Wong, H. C., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescent+indicators+for+in+vivo+quantification+of+spontaneous+or+evoked+motor+neuron+presynaptic+activity+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using fluorescent indicators for in vivo quantification of spontaneous or evoked motor neuron presynaptic activity in transgenic zebrafish.</a> STAR Protoc. 3 (4), 101766(2022).</li>
<li>Truckenbrodt, S., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+vesicle+recycling+in+the+synaptic+bouton%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous vesicle recycling in the synaptic bouton.</a> Front Cell Neurosci. 8, 409(2014).</li>
<li>Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensors+and+regulators+of+intracellular+ph%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sensors and regulators of intracellular ph.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 50-61 (2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>40x suya daldırma objektifi</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>4ch yerçekimi akışı perfüzyon sistemi</td><td>ALA</td><td>VCPlus-4G</td><td></td></tr><tr><td>5x objektif</td><td>Olympus</td><td>NPLN5X</td><td></td></tr><tr><td>Custum yapımı görüntüleme odası</td><td>Physiotech</td><td>custum yapımı</td><td>Siyah akrilik plaka (10,7 cm çapında, 3 mm kalınlığında) ve kuyulu (altta 1 cm çapında, üstte 1,5 cm çapında) yaklaşık 0.5 ml perfüzat.&nbsp;</td></tr><tr><td>Dijital G/Ç cihazı</td><td>Arduino</td><td>Uno Rev3</td><td></td></tr><tr><td>D-Tubokurarin diklorür pentahidrat</td><td>Sigma</td><td>93750</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Office Professional Plus 2016</td><td></td></tr><tr><td>Fiji / imageJ</td><td>https://imagej.net/</td> <td>imageJ 1.54f</td><td></td></tr><tr><td>İnce forseps</td><td>AsOne</td><td>7-562-05 (Dumont # 5)</td><td></td></tr><tr><td>Cam Pasteur pipet</td><td>IWAKI</td><td>IK-PAS-5P</td><td>Uç, son çap 1.5&ndash olana kadar kesilmeli ve ateşle parlatılmalıdır; 2 mm.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cam Petri kabı</td><td>AsOne</td><td>1-4564-06</td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics</td><td>Ver. 6.37</td><td></td></tr><tr><td>Hat içi çözelti ısıtıcısı</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>LED aydınlatma sistemi</td><td>X-cyte</td><td>XYLIS</td><td></td></tr><tr><td>Metilen mavisi</td><td>Wako</td><td>133-06962</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Manager</td><td>https://micro-manager.org/</td> <td>Ver. 2.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Perfüzyon tüpü için mini manyetik kelepçe</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1553</td><td></td></tr><tr><td>Motorlu mikromanipülatör</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>Motorlu hareketli numune plakası</td><td>Scientifica</td><td>MMSP</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tutucu</td><td>Narishige</td><td>H-13</td><td></td></tr><tr><td>Pipet çektirme</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Platin tel (&phi; 0,1 mm)</td> <td>Nilaco</td><td>PT-351165</td><td></td></tr><tr><td>Platin tel (&phi; 0,5 mm)</td><td>Niaco</td><td>PT-351381</td><td></td></tr><tr><td>Neşter</td><td>AsOne</td><td>8-3086-02 (Tüy #11)</td><td></td></tr><tr><td>Bilimsel cMOS kamera</td><td>Thorlabs</td><td>CC215MU</td><td></td></tr><tr><td>Deniz tuzu</td><td>NAPQO</td><td>Anında Okyanus</td><td></td></tr><tr><td>Stereo mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Uyaran izolater</td><td>AMPI</td><td>ISO-FLEX</td><td></td></tr><tr><td>Emme borusu</td><td>Warner Instruments</td><td>ST-3, 64-1406</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık kontrolörü</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>Teta cam kılcal</td><td>Sutter Aleti</td><td>BT-150-10</td><td></td></tr><tr><td>Trikain (MS-222)</td><td>TCI</td><td>T0941</td><td></td></tr><tr><td>Dik mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr></tbody></table>

diseke larva zebra balığının nöromüsküler kavşağında sinaptik vezikül geri dönüşümünün canlı görüntülenmesi

Live Imaging of Synaptic Vesicle Recycling in the Neuromuscular Junction of Dissected Larval Zebrafish

Diseke edilen örnek ciddi doku hasarı olmadan hazırlanırsa ve stimülasyon elektrodu omuriliğe uygun şekilde yerleştirilirse, yüksek frekanslı elektrik stimülasyonu ile sağlam bir pHluorin yanıtı ortaya çıkarılabilir (Şekil 4D, E). Uyaran öncesi başlangıç floresansı, muhtemelen presinapsın yüzeyinde bulunan probdan kaynaklanıyordu. Stimülasyon sırasında floresanstaki artış, probun yüzeye ekzositotik salınımını yansıtır. Sonraki bozunma, prob içeren SV'lerin endositozunu ve ye...

Diseke Larva Zebra Balığının Nöromüsküler Kavşağında Sinaptik Vezikül Geri Dönüşümünün Canlı Görüntülenmesi

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) ...

Larva zebra balığının nöromasküler kavşağını model sistem olarak kullanarak sinaptik iletimin moleküler ve hücre mekanizmasını inceliyoruz. Çeşitli fizyolojik ve patolojik durumlara yanıt olarak sinapsisin düzenleyici moderasyonunu açıklığa kavuşturmakla ilgileniyoruz. Bu protokol, larva zebra balığı nöromüsküler kavşağında aksiyon potansiyeli ile indüklenen yeni iletimi gelişmiş hassasiyetle görselleştirmemizi sağlar.Daha önce test edilmemiş olan orta derecede stimülasyonun ortaya çıkardığı sinaptik fonksiyonu izleyebiliriz. Bu görüntüleme protokolü, geleneksel bir epifloresan mikroskobu altında gerçekleştirilebilir ve mutlaka konfokal bir lazer tarama mikroskobu gerektirmez. Başka bir deyişle, bu yöntem, diğer deney düzeneklerine kıyasla nöromüsküler fonksiyonu görüntülemek için uygun maliyetli bir platform sağlar.200 mililitre hücre dışı çözelti hazırlamak için, 6.4 mililitre 3.5 molar sodyum klorür, 0.4 mililitre bir molar potasyum klorür, 1 mililitre bir molar HEPES, 0.4 mililitre bir molar kalsiyum klorür, 0.2 mililitre bir molar magnezyum klorür ve 360 miligram glikoz. Ardından toplam hacmi 200 mililitreye çıkarmak için ultra saf su ekleyin. 3 mikromolar D-tubokurarin ile 100 mililitre hücre dışı çözelti hazırlamak için 20 mikrolitre 15 milimolar D-tubokurarin stok çözeltisi ekleyin.% 0.02 tricaine içeren hücre dışı çözeltinin 25 mililitresini hazırlamak için, 25 mililitre çözeltiye 0.5 mililitre% 1 tricaine stok çözeltisi ekleyin. Bir mikro pipet çektirmesi kullanarak, teta cam kılcal damarları, uç çapı 3 ila 10 mikrometre aralığında olana kadar çekin. Pipeti hücre dışı solüsyonla doldurun.Kılcal damarın her bir açıklığına ince bir platin tel yerleştirin ve teta cam pipet elektrodunu motorlu mikro manipülatörün pipet tutucusuna tutun. Ardından her bir kablonun arka ucunu uyaran izolatörüne bağlayın. Bir cam Petri kabına% 0.02 tricaine içeren 25 mililitre hücre dışı çözelti için, bir zebra balığı larvalarını diseksiyon için Petri kabına aktarın.Larvaların derisini soymak için iki ince forseps kullanın. Larvaları yerinde tutmak için ilk forsepsleri kullanın ve diğer forseps ile yüzme kesesinin sırt tarafındaki cildi sıkıştırın. Daha sonra neşter kullanarak yüzme kesesini, iç organları ve başı çıkarın.Diseke zebra balığı örneğini görüntüleme odasına aktarmak için ateşle parlatılmış uçlu bir cam pastör pipeti kullanın. Numuneyi, uyarıcı elektroda yaklaşık olarak paralel bir açıyla yönlendirmek için C şeklinde bir platin tele yapıştırılmış bir naylon iplikle mekanik olarak sabitleyin. Numuneyi, 3 mikromolar D-tubokurarin içeren hücre dışı bir çözelti ile dakikada 1 mililitre hızında bir yerçekimi akış sistemi kullanarak perfüze edin.Ardından, stimülasyon elektrodunu omuriliğe yerleştirin. Elektrot ucunu, omuriliğin ventral tarafında bulunan TagRFP pozitif nöronlar olarak tanımlanan spinal motor nöronlarının yakınına dikkatlice yerleştirin. Elektrodu, bitişik segmentten hedef konuma eğik bir açıyla ilerletin.Bir bilgisayarda başlamak için, TagRFP floresansının canlı görüntüsüne dayalı olarak görüntüleme bölgesini seçin. Seçilen bölgenin birden fazla bouton içerdiğinden ve vücut segmenti sınırına yakın olanları hariç tuttuğundan emin olun. Görüntüleme için floresan filtre ünitesi GFP flor floresansını değiştirin.Ardından, doygunluk olmadan 1 hertz hızlandırılmış modda parlak bir görüntü elde etmek için ışık kaynağının yoğunluğunu ayarlayın. Mikro yönetici penceresinin pozlama milisaniye alanına pozlama süresini 100 olarak girin. Görüntü alımını elektriksel stimülasyon ile senkronize etmek için görüntü alma yazılımını ve dijital giriş çıkış cihazını yapılandırın.Ardından, Arduino komut dosyasında stimülasyon frekansını, aksiyon potansiyellerinin sayısını ve görüntü alımının başlangıcı ile stimülasyon iletimi arasındaki zaman gecikmesini belirleyin. Bu ayarlara bağlı olarak, alım için gereken toplam görüntü sayısını hesaplayın ve bu değeri micromanager'daki çok boyutlu alım penceresinin sayı alanına girin. 1 hertz zaman atlamalı görüntüleme için aralık alanında 1 saniyelik bir aralık ayarlayın.Elektriksel stimülasyon için, uyaran izolatörünü 70 milivoltluk 1 milisaniyelik sabit voltaj darbeleri verecek şekilde yapılandırın. Görüntü alımını başlatmak için sayısallaştırıcı komutunu yürütün. Kabul edilemez bir görüntü kayması olmadığını ve flor ile yanıtların gözlemlenebilir olduğunu doğrulamak için işlemi izleyin.Darbe sayısındaki frekans gibi stimülasyon yoğunluğunu değiştirin veya sıcaklığı deneysel amaca göre ayarlayın. Zaman atlamalı görüntüleri TIFF zaman serisi yığını olarak kaydedin. Analiz için büyük sinyal artışlarına sahip sinapslar seçildi, ancak tüm butonlar 20 hertz 100 aksiyon potansiyeli durumunda saptanabilir değişiklikler gösterdi, Stimülasyon sırasında ekzositozu ve müteakip bozunmayı gösteren floresan değişiklikleri ile yüksek frekanslı elektrik stimülasyonu üzerine sağlam flor tepkileri gözlendi, endositozu ve sinaptik veziküllerin yeniden asitlenmesini yansıtıyor.Floresan bozunma zaman sabitleri, 16.6 saniyede 20 hertz 25 aksiyon potansiyeli, 56.8 saniyede 20 hertz 100 aksiyon potansiyeli ve 62.7 saniyede 50 hertz 500 aksiyon potansiyeli ile uyaran, yoğunluk ve sıcaklığa göre değişiyordu.

live-imaging-synaptic-vesicle-recycling-neuromuscular-junction

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol zebrafish embriyolar yaşayan tek tek nöronların veya nöral krest hücreleri görüntüleme açıklar. Bu yöntem, floresan konfokal zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak cep davranışlar ve aktin lokalizasyonu incelemek için kullanılır.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

Bu protokol, canlı diseksiyonu tartışıyor.

Drosophila Larvaların segmental Aksonlar içinde Sinaptik veziküller in vivo Görselleştirme

Larvaların zebrafish spinal motor nöron ve hedef iskelet kası aynı anda yama kelepçe kayıt izin vermek için ilk omurgalı model sistemi temsil eder. Bu video segmental CaP motor nöron ve hedef kas hücrelerinin yanı sıra, her bir hücre tipi kayıt için metodolojiler tanımlamak için kullanılır mikroskobik yöntemler göstermektedir.

Motor-nöron Paired Patch Kelepçe Kayıtlar ve Zebra balığı Hedef İskelet Kası

Aktif Bölgeleri Diseksiyon ve Görüntüleme Drosophila Nöromüsküler Junction

Basit bir mikroakışkan cihaz anestezik ücretsiz gerçekleştirmek için...

Için basit Mikroakışkan Cihazlar<em&gt; In vivo</emVe&gt; Görüntüleme<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve Zebra balığı

Bu video, bir floresan boya kullanarak channelrhodopsin eksprese eden Drosophila larvalarındaki nöromüsküler kavşaklarda sinaptik vezikül geri dönüşümünü incelemek için bir protokolü göstermektedir. Mavi ışık, channelrhodopsinleri aktive ederek kalsiyum akışına ve sinaptik vezikül ekzositozuna neden olur. Boya, nöronal membranlara entegre olur ve endositoz sırasında içselleştirilir, bu da floresanın artmasına neden olur. Daha fazla mavi ışık stimülasyonu, azaltılmış floresan ile gösterilen...

Drosophila Larvalarında Sinaptik Vezikül Geri Dönüşümü ve Floresan Boya Alımının Analizi

Kaynak: Schramm, P.  et al. Uyanık Zebra Balığı Larvalarında ve Yavrularında Tam Aktif Beyin Dokusunun Kafatası ve Deri Çıkarma ile İn vivo Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, Purkinje nöronlarında floresan proteinleri eksprese eden transgenik zebra balığı larvalarındaki serebellar nöronların in vivo görüntülemesini göstermektedir. İşlem, larvaların uyuşturulmasını, agarozda hareketsiz hale getirilmesini ve ışık penetrasyonunu ve floresan yoğunluğunu artırmak için pigmentli cildin...

Serebellar Nöronları Görselleştirmek için Zebra Balığı Larva Beyninin İn Vivo Görüntülenmesi

Kaynak: Lukasz, D., et al. Larva Zebra Balıklarında Lateral Çizgi Tüy Hücrelerinin İn Vivo Kalsiyum Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, felçli bir transgenik zebra balığı larvasının lateral çizgi saç hücrelerindeki kalsiyum akışının konfokal mikroskop kullanılarak canlı olarak görüntülenmesini göstermektedir. Saç demetlerinin sıvı darbeleri yoluyla mekanik olarak uyarılması, floresan göstergeleri kullanılarak gerçek zamanlı olarak görselleştirilen mekanotransdüksiyon kanalları ve voltaj...

Larva Zebra Balıklarının Lateral Çizgi Tüy Hücrelerinde Kalsiyum Dinamiğinin Görüntülenmesi

Zebra balığı optik netlik, hızlı harici diller, dahil olmak üzere birçok değerli özellikleri ve işitme ve denge için belirli önemini, dışarıdan duyu saç hücreleri bulunan bir modeli sistemidir. Bu makalede nasıl transgenik zebra balığı özetlenmektedir saç hücreli mechanosensation ve presynaptic fonksiyonu toto tahlil için kullanılabilir.

Larva zebra balığı sonradan içini kaplamak saç hücrelerinin vivo kalsiyum görüntüleme

Gelişmekte olan zebra balığı optik tektumunda mikroglia hücrelerinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için hızlı taramalı konfokal mikroskopiden yararlanan ve bu hücrelerin dinamiklerinin in vivo analizine olanak tanıyan bir yöntem gösteriyoruz.

Zebra Balığı Embriyosunda Mikroglia Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi ve Karakterizasyonu

Burada, konfokal mikroskopi kullanarak GCaMP kalsiyum göstergelerini eksprese eden transgenik zebra balıklarının beyin bölgelerindeki nöral aktiviteyi incelemek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

In vivo (İn canlı) Kısmen Kısıtlanmış Larva Zebra Balıklarında Duyusal Stimülasyonla İndüklenen Nöral Aktivitenin Konfokal Floresan Görüntülemesi

Öğrenin, Danio rerio larvalarında sinaptik vezikül geri dönüşümünü canlı görüntülemeyi. Bu maliyet-etkin pHluorin tabanlı yöntem, nöromüsküler kavşak dinamiklerini ve sinaptik iletim mekanizmalarını incelemek için güçlü bir platform sunar.

Diseke Larva Zebra Balığının Nöromüsküler Kavşağında Sinaptik Vezikül Geri Dönüşümünün Canlı Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet