Diseke Larva Zebra Balığının Nöromüsküler Kavşağında Sinaptik Vezikül Geri Dönüşümünün Canlı Görüntülenmesi

Larva zebra balığının nöromasküler kavşağını model sistem olarak kullanarak sinaptik iletimin moleküler ve hücre mekanizmasını inceliyoruz. Çeşitli fizyolojik ve patolojik durumlara yanıt olarak sinapsisin düzenleyici moderasyonunu açıklığa kavuşturmakla ilgileniyoruz. Bu protokol, larva zebra balığı nöromüsküler kavşağında aksiyon potansiyeli ile indüklenen yeni iletimi gelişmiş hassasiyetle görselleştirmemizi sağlar.

Daha önce test edilmemiş olan orta derecede stimülasyonun ortaya çıkardığı sinaptik fonksiyonu izleyebiliriz. Bu görüntüleme protokolü, geleneksel bir epifloresan mikroskobu altında gerçekleştirilebilir ve mutlaka konfokal bir lazer tarama mikroskobu gerektirmez. Başka bir deyişle, bu yöntem, diğer deney düzeneklerine kıyasla nöromüsküler fonksiyonu görüntülemek için uygun maliyetli bir platform sağlar.

200 mililitre hücre dışı çözelti hazırlamak için, 6.4 mililitre 3.5 molar sodyum klorür, 0.4 mililitre bir molar potasyum klorür, 1 mililitre bir molar HEPES, 0.4 mililitre bir molar kalsiyum klorür, 0.2 mililitre bir molar magnezyum klorür ve 360 miligram glikoz. Ardından toplam hacmi 200 mililitreye çıkarmak için ultra saf su ekleyin. 3 mikromolar D-tubokurarin ile 100 mililitre hücre dışı çözelti hazırlamak için 20 mikrolitre 15 milimolar D-tubokurarin stok çözeltisi ekleyin.

% 0.02 tricaine içeren hücre dışı çözeltinin 25 mililitresini hazırlamak için, 25 mililitre çözeltiye 0.5 mililitre% 1 tricaine stok çözeltisi ekleyin. Bir mikro pipet çektirmesi kullanarak, teta cam kılcal damarları, uç çapı 3 ila 10 mikrometre aralığında olana kadar çekin. Pipeti hücre dışı solüsyonla doldurun.

Kılcal damarın her bir açıklığına ince bir platin tel yerleştirin ve teta cam pipet elektrodunu motorlu mikro manipülatörün pipet tutucusuna tutun. Ardından her bir kablonun arka ucunu uyaran izolatörüne bağlayın. Bir cam Petri kabına% 0.02 tricaine içeren 25 mililitre hücre dışı çözelti için, bir zebra balığı larvalarını diseksiyon için Petri kabına aktarın.

Larvaların derisini soymak için iki ince forseps kullanın. Larvaları yerinde tutmak için ilk forsepsleri kullanın ve diğer forseps ile yüzme kesesinin sırt tarafındaki cildi sıkıştırın. Daha sonra neşter kullanarak yüzme kesesini, iç organları ve başı çıkarın.

Diseke zebra balığı örneğini görüntüleme odasına aktarmak için ateşle parlatılmış uçlu bir cam pastör pipeti kullanın. Numuneyi, uyarıcı elektroda yaklaşık olarak paralel bir açıyla yönlendirmek için C şeklinde bir platin tele yapıştırılmış bir naylon iplikle mekanik olarak sabitleyin. Numuneyi, 3 mikromolar D-tubokurarin içeren hücre dışı bir çözelti ile dakikada 1 mililitre hızında bir yerçekimi akış sistemi kullanarak perfüze edin.

Ardından, stimülasyon elektrodunu omuriliğe yerleştirin. Elektrot ucunu, omuriliğin ventral tarafında bulunan TagRFP pozitif nöronlar olarak tanımlanan spinal motor nöronlarının yakınına dikkatlice yerleştirin. Elektrodu, bitişik segmentten hedef konuma eğik bir açıyla ilerletin.

Bir bilgisayarda başlamak için, TagRFP floresansının canlı görüntüsüne dayalı olarak görüntüleme bölgesini seçin. Seçilen bölgenin birden fazla bouton içerdiğinden ve vücut segmenti sınırına yakın olanları hariç tuttuğundan emin olun. Görüntüleme için floresan filtre ünitesi GFP flor floresansını değiştirin.

Ardından, doygunluk olmadan 1 hertz hızlandırılmış modda parlak bir görüntü elde etmek için ışık kaynağının yoğunluğunu ayarlayın. Mikro yönetici penceresinin pozlama milisaniye alanına pozlama süresini 100 olarak girin. Görüntü alımını elektriksel stimülasyon ile senkronize etmek için görüntü alma yazılımını ve dijital giriş çıkış cihazını yapılandırın.

Ardından, Arduino komut dosyasında stimülasyon frekansını, aksiyon potansiyellerinin sayısını ve görüntü alımının başlangıcı ile stimülasyon iletimi arasındaki zaman gecikmesini belirleyin. Bu ayarlara bağlı olarak, alım için gereken toplam görüntü sayısını hesaplayın ve bu değeri micromanager'daki çok boyutlu alım penceresinin sayı alanına girin. 1 hertz zaman atlamalı görüntüleme için aralık alanında 1 saniyelik bir aralık ayarlayın.

Elektriksel stimülasyon için, uyaran izolatörünü 70 milivoltluk 1 milisaniyelik sabit voltaj darbeleri verecek şekilde yapılandırın. Görüntü alımını başlatmak için sayısallaştırıcı komutunu yürütün. Kabul edilemez bir görüntü kayması olmadığını ve flor ile yanıtların gözlemlenebilir olduğunu doğrulamak için işlemi izleyin.

Darbe sayısındaki frekans gibi stimülasyon yoğunluğunu değiştirin veya sıcaklığı deneysel amaca göre ayarlayın. Zaman atlamalı görüntüleri TIFF zaman serisi yığını olarak kaydedin. Analiz için büyük sinyal artışlarına sahip sinapslar seçildi, ancak tüm butonlar 20 hertz 100 aksiyon potansiyeli durumunda saptanabilir değişiklikler gösterdi, Stimülasyon sırasında ekzositozu ve müteakip bozunmayı gösteren floresan değişiklikleri ile yüksek frekanslı elektrik stimülasyonu üzerine sağlam flor tepkileri gözlendi, endositozu ve sinaptik veziküllerin yeniden asitlenmesini yansıtıyor.

Floresan bozunma zaman sabitleri, 16.6 saniyede 20 hertz 25 aksiyon potansiyeli, 56.8 saniyede 20 hertz 100 aksiyon potansiyeli ve 62.7 saniyede 50 hertz 500 aksiyon potansiyeli ile uyaran, yoğunluk ve sıcaklığa göre değişiyordu.