Name: Kantitatif metabolik akı çalışmaları için yıkanmış insan trombositlerinin hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T14:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Öğrenin, yıkanmış insan trombositlerinden hücre içi metabolitlerin izolasyonu için güvenilir bir protokol. Akut östrojen maruziyetinin trombotik risk üzerindeki etkisini metabolik analizlerle araştırın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Çalışma, Colorado Üniversitesi Anschutz Tıp Kampüsü'nden Kurumsal İnceleme Kurulu onayı aldı. Tüm çalışma katılımcılarından yazılı onay alındı. Katılımcılar, önceki 48 saat boyunca alkol veya önceki on gün boyunca steroid olmayan antienflamatuar ilaçlar (NSAID'ler) tüketmediklerini bildirdiler. Bu proje, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü tarafından R61HL141794 numaralı ödülle desteklenmektedir.
1. Kan alma
<ol>
	<li>Kan alımı için ayarlayın. Kan alımının eğitimli bir flebotomist tarafından yapılması önerilir.</li>
	<li>19 G'lik bir iğne kullanarak iç kolda damar delme işlemi yapın.</li>
	<li>İlk ~2 mL'yi katkısız bir vakutainer'a toplayın ve atın. Bu, trombositleri aktive edebilecek hasarlı endotel hücrelerinden kimyasal sinyal moleküllerini çıkarmak içindir. İlk 2 mL toplandıktan sonra, trombositler üzerindeki kayma stresini azaltmak için turnikeyi çıkarın.</li>
	<li>Kanın geri kalanını 14:3 oranında (kan: ACD-A) antiokoagülan sitrat dekstroz (ACD-A) vakutainerlerine toplayın. Kan ve antikoagülanı karıştırmak için kan alımından sonra her bir vakutaineri nazikçe ters çevirin.</li>
</ol>
2. Trombosit Yıkama
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67639/67639fig01.jpg"> 
Şekil 1: Trombosit yıkamada yer alan ardışık santrifüjleme ve yeniden süspansiyon adımları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67639/67639fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
NOT: Hava kabarcığı oluşumunu önleyin. Özellikle santrifüjlemeden önce, kabarcıklar oluştuğunda çıkarmak için transfer pipetleri kullanın. Kan / trombosit tüpleri her açıldığında / kapatıldığında, CO2 seviyesini artırmak için kapağı kapatmadan önce tüpün içine nefes verilmesi önerilir.
<ol>
	<li>Sıcaklık etkilerini azaltmak için santrifüjü 37 °C'ye önceden ısıtın. Protokoldeki her santrifüj adımı arasında, santrifüjü 37 °C'de tutun.</li>
	<li>Su banyosunu 37 °C'ye ısıtın. Modifiye edilmiş Tyrode'un glikozlu tamponunu su banyosuna yerleştirin. NOT: değiştirilmiş Tyrode'un tampon tarifi Ek Dosya 1'de bulunabilir.</li>
	<li>Tüm vakutainerlerden toplanan tam kanı 50 mL polipropilen konik tüplerde birleştirin. 45° açıyla kesilmiş eğimli kesimli bir pipet ucu kullanarak, hücre sayımı yapmak için uygun numune hacmini alın (bkz.</li>
	<li>Dar delikli bir transfer pipeti ile dikkatlice aspire edilerek oluşan kabarcıkları çıkarın.</li>
	<li>Kanı 37 °C'de 25 dakika su banyosunda dinlendirin Bu, geri dönüşümlü olarak aktive edilmiş bir durumdaki trombositlerin (vücuttan çıkarılması, tüpten tüpe aktarılması vb.) dinlenme durumuna geri dönmesini sağlar.</li>
	<li>Santrifüjleme sırasında aktivasyonu önlemek için, tam kana 500 nM prostaglandin I2 (PGI2) ve 0.02 U / mL apiraz ekleyin ve bir kez ters çevirerek hafifçe karıştırın.  Dar delikli bir transfer pipeti kullanılarak oluşan kabarcıkları çıkarın. NOT: Uygun PGI2 ve apyraz tarifi için talimatlar Ek Dosya 1'de bulunabilir.</li>
	<li>Trombositten zengin plazma (PRP) (42 mL tam kan için 250 x g'da 15 dakika) elde etmek için tam kanı frensiz (37 °C) santrifüjleyin.</li>
	<li>PRP'yi (buffy coat ve kırmızı kan tabakasının üzerindeki üst sarı tabaka) geniş delikli bir transfer pipeti kullanarak 50 mL'lik yeni bir konik tüpe nazikçe toplayın.</li>
	<li>Aktarırken temiz bir konik tüpü eğin ve PRP'yi tüpün yanından nazikçe geçirin. Hava kabarcıklarından kaçının.</li>
	<li>Buffy coat (PRP ile kırmızı kan arasındaki beyaz kan hücresi tabakası) rahatsız etmemek için yaklaşık 3 mm PRP'yi geride bırakın. Rahatsız edilirse, bu, transfer pipetinde ani bir beyaz girdap gibi görünecektir.</li>
	<li>Bir sonraki yıkama adımı için yeniden süspansiyon hacmini belirlemek için hücre sayımı yapın (Bkz. Trombosit Sayma).</li>
	<li>37 °C'de 10 dakika dinlendirin.</li>
	<li>Eğimli kesimli bir pipet ucu kullanarak akış sitometrisi için numune alın (bkz.</li>
	<li>PRP'ye 500 nM PGI2 ve 0.02 U/mL apyraz ekleyin ve bir kez hafifçe ters çevirerek karıştırın.</li>
	<li>37 °C'de 1000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin (hızlanma:0, fren: 0). Fren kullanmayın. Pelet kompakt değildir ve ani fren yeniden karıştırmaya neden olabilir.</li>
	<li>Santrifüjleme sırasında, yeniden süspansiyon hacmini belirleyin. u iyileşme olduğunu varsayalım. Hücre yoğunluğunu yaklaşık 3x105 hücre/μL yapın.</li>
	<li>Yığın hacmi için plastik geniş delikli bir transfer pipeti ve peletin yakınındaki sıvının geri kalanı için 1 mL'lik bir pipet (kesilmemiş uç) kullanarak süpernatanı aspire edin. Tüpün altındaki pelete dokunmaktan kaçının.</li>
	<li>Modifiye Tyrode'un tamponuna 500 nM PGI2 ve 0.02 U/mL apiraz ekleyin. Konik borunun yan tarafından damlatarak 16. adımdan itibaren hesaplanan tampon miktarını yavaşça ekleyin.</li>
	<li>Eğimli kesim ucu ve 1 mL pipet ucu kullanarak, birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti nazikçe yeniden süspanse edin.<ol>
		<li>Hacmi 300 μL'ye ayarlayın, sıvı hattının üzerindeyken pistonu sonuna kadar bastırın, ardından pipeti sıvının altına yerleştirin ve ilk durana kadar gelin. Bu, bilim adamının yanlışlıkla trombositleri aktive edebilecek hava kabarcıkları oluşturmadan peleti yeniden askıya almasına izin verecektir.</li>
		<li>Bazen, peletin dibinde görünür kırmızı kan hücrelerinden oluşan bir halka vardır. Bunu yeniden askıya almaktan kaçının.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pelet yeniden süspanse edildikten sonra, yeniden süspanse edilmiş peleti yeni bir konik tüpe aktarmak için geniş delikli bir transfer pipeti kullanın ve geride herhangi bir kırmızı hücre veya gözle görülür şekilde kümelenmiş hücreler bırakın.</li>
	<li>11-20 arasındaki adımları tekrarlayın. Modifiye Tyrode'un tamponuna yeni bir alikottan 500 nM PGI2 ve 0.02 U/mL eklediğinizden emin olun (18. adımdan itibaren modifiye edilmiş Tyrode'un tamponunu tekrar kullanmayın, PGI2 çok kararsızdır).</li>
	<li>Hücre sayımı için bir örnek alın. Modifiye edilmiş Tyrode tamponu ile trombosit konsantrasyonunu gerektiği gibi ayarlayın.</li>
	<li>Akış sitometrisi için bir örnek almak için eğimli kesimli bir pipet ucu kullanın.</li>
	<li>İnhibitörlerin yıpranması için zaman tanımak ve geri dönüşümlü olarak aktive edilmiş trombositlerin dinlenme durumuna dönmesine izin vermek için trombositlerin 37 ° C'de 1 saat dinlenmesine izin verin.</li>
	<li>Geniş delikli bir pipetle yavaşça karıştırın. Akış sitometrisi için örnekler alın.</li>
	<li>Yıkanmış, dinlendirilmiş trombositler artık metabolik analiz için kullanılmaya hazırdır.</li>
</ol>
3. Trombositlerin sayımı
<ol>
	<li>Trombositler, otomatik bir kan hücresi sayacı (üreticinin talimatlarına uyun) veya bir hemositometre33 kullanılarak sayılabilir.</li>
</ol>
4. Akış Sitometrisi
<ol>
	<li>Hazırlık<ol>
		<li>Antikor karışımlarının ayarlanması ve trombosit aktivasyonunu ölçmek için akış sitometresinin hazırlanması için ayrıntılı protokoller ve en iyi uygulamaların gözden geçirilmesi başka bir yerde bulunabilir34,35.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Örnekleme<ol>
		<li>Akış sitometrisi için bir numune alırken, eğimli kesilmiş bir pipet ucu kullanarak trombosit süspansiyonunu toplayın. Bunu yavaşça antikorlu mikrosantrifüj tüpüne ekleyin, ardından karıştırmak için hafifçe vurun. 30 saniye inkübe edilmesine izin verin.</li>
		<li>Eğimli kesilmiş pipet ucunu kullanarak, trombosit süspansiyonu / antikor karışımını 96 oyuklu plaka üzerindeki uygun kuyuya aktarın.</li>
		<li>Hücreleri sabitlemek için hemen kuyuya sabitleyici ekleyin.</li>
		<li>Fiksasyondan sonraki 8 saat içinde akış sitometresi üzerinde çalıştırın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Agonist duyarlılık testleri<ol>
		<li>Yıkadıktan sonra, biri dinlenme kontrolü ve diğeri trombin aktive edici kontrol için olmak üzere 2 adet 15 mL'lik konik tüpü bir kenara koyun.</li>
		<li>Eğimli kesimli bir pipet ucu kullanarak her bir konik tüpe 100 μL trombosit süspansiyonunu nazikçe pipetleyin. 37 °C'de 1 saat dinlendirin.</li>
		<li>Bir saatlik dinlenmeden sonra, bir tüpe 0.1 U / mL trombin ekleyin (trombin hazırlama talimatları Ek Dosya 1'de bulunabilir) ve diğerine araç. 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Agoniste trombosit duyarlılığını belirlemek için her tüpün bir akış sitometrisi örneğini alın.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Kantitatif Metabolik Akı Analizi için Numune Alma
<ol>
	<li>Söndürme NOT: Metabolizmayı söndürmek, doğru metabolik akışları ölçmek için gerekli bir adımdır. Hücrelerin hızla soğutulması ve sıcaklıklarının 4 ° C'de veya altında tutulması, metabolizmayı, örneklenen hücrelerin toplu hücrelerin metabolizmasını doğru bir şekilde yansıtması için esasen durdurulduğu varsayılabilecek kadar yavaşlatır. Kullanılabilecek çeşitli yöntemler vardır, ancak hızlı soğutma ihtiyacını dengelemek ve sızıntıyı en aza indirmek için soğuk (-4 °C) normal tuzlu su36 kullanın. Tuz sonraki analize müdahale edecekse, başka bir sıvı kullanılabilir (metanol/su, etanol vb.)37.<ol>
		<li>Normal tuzlu su alikotlarını hazırlayın ve dondurun. Her bir salin alikotunu istenen numunenin hacminin 6 katı kadar yapın. NOT: normal tuzlu su tarifi Ek Dosya 1'de bulunabilir.</li>
		<li>Mikrosantrifüjü 0 °C'ye kadar önceden soğutun.</li>
		<li>Trombosit süspansiyonunu kısmen donmuş normal salin içinde (&lt; -4 ° C) 1: 6 oranında toplayın (örneğin, mikrosantrifüj tüplerinde 750 μL salin içine 150 μL trombosit süspansiyonu toplayın). NOT: Trombosit / salin solüsyonunu 15 dakikadan fazla buz üzerinde bırakmayın.</li>
		<li>16.000 x g'da, 0 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.</li>
		<li>Süpernatanı harici metabolit analizi için ve peleti hücre içi metabolit ekstraksiyonu ve ölçümü için saklayın. Her ikisini de analize hazır olana kadar -20 °C'de saklayın.</li>
		<li>Bu işlemi istenen zaman aralığında ve numune zaman noktası sayısında tekrarlayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hücre İçi Metabolit Ekstraksiyonu<ol>
		<li>Söndürülmüş pelete -20 °C'de 0,5 mL önceden soğutulmuş 7:3 metanol su ekleyin. 1 dakika boyunca kuvvetlice girdap.</li>
		<li>Sıvı nitrojen içinde dondurun, 0 °C'de çözdürün, ardından 2 döngü daha tekrarlayın.</li>
		<li>Süspansiyonları 16.000 x g'da -4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.</li>
		<li>Süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın.</li>
		<li>3. adımdaki peleti kullanın ve ekstraksiyon protokolünü (1-3. adımlar) 50:50 metanol:su ile tekrarlayın. Toplanan ikinci özü birinciye ekleyin. Gece boyunca kurutun.</li>
		<li>Kurutulmuş ekstraktı 150 μL LC-MS dereceli suda (veya amaçlanan analiz için uygun başka bir çözücüde) tekrar süspanse edin. 4 °C'de 15 dakika karıştırın. Hücre kalıntılarını gidermek için kısaca girdap yapın ve 0.22 μm mikrosantrifüj tüplerine aktarın. 16.000 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
		<li>Santrifüjden çıkarın, filtreye 50 μL daha optimum su pipetleyin ve filtreyi durulamak için tekrar santrifüjleyin (5 dakika, 16.000 x g ve 4 °C). Analiz için toplayın.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Metabolik Araştırmalar için Hareketsiz Trombositlerin İzole Edilmesi

<ol><li>Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fundamentals+in+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">New fundamentals in hemostasis.</a> Physiol Rev. 93 (1), 327-358 (2013).</li>
<li>Webera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+platelet+aggregation+with+trap-6+and+collagen+in+platelet+aggregometry+in+patients+with+venous+thromboembolism%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced platelet aggregation with trap-6 and collagen in platelet aggregometry in patients with venous thromboembolism.</a> Thromb Res. 107, 325-328 (2002).</li>
<li>Herbert, J. M., Bernat, A., Maffrand, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+platelets+in+experimental+venous+thrombosis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Importance of platelets in experimental venous thrombosis in the rat.</a> Blood. 80 (9), 2281-2286 (1992).</li>
<li>Puurunen, M. K., Hwang, S. J., O'donnell, C. J., Tofler, G., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+function+as+a+risk+factor+for+venous+thromboembolism+in+the+framingham+heart+study%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Platelet function as a risk factor for venous thromboembolism in the framingham heart study.</a> Thromb Res. 151, 57-62 (2017).</li>
<li>Montoro-Garcia, S., Schindewolf, M., Stanford, S., Larsen, O. H., Thiele, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+platelets+in+venous+thromboembolism%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">The role of platelets in venous thromboembolism.</a> Semin Thromb Hemost. 42 (3), 242-251 (2016).</li>
<li>Koupenova, M., Kehrel, B. E., Corkrey, H. A., Freedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombosis+and+platelets%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Thrombosis and platelets: An update.</a> Eur Heart J. 38 (11), 785-791 (2017).</li>
<li>Yeung, J., Li, W., Holinstat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+signaling+and+disease%3A+Targeted+therapy+for+thrombosis+and+other+related+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Platelet signaling and disease: Targeted therapy for thrombosis and other related diseases.</a> Pharmacol Rev. 70 (3), 526-548 (2018).</li>
<li>Ferreiro, J. L., Gomez-Hospital, J. A., Angiolillo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+abnormalities+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diab+Vasc+Dis+Res%22%5BJournal%5D)">Platelet abnormalities in diabetes mellitus.</a> Diab Vasc Dis Res. 7 (4), 251-259 (2010).</li>
<li>Buergy, D., Wenz, F., Groden, C., Brockmann, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-platelet+interaction+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor-platelet interaction in solid tumors.</a> Int J Cancer. 130 (12), 2747-2760 (2012).</li>
<li>Gkaliagkousi, E., Passacquale, G., Douma, S., Zamboulis, C., Ferro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+activation+in+essential+hypertension%3A+Implications+for+antiplatelet+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Platelet activation in essential hypertension: Implications for antiplatelet treatment.</a> Am J Hypertens. 23 (3), 229-236 (2010).</li>
<li>Fidler, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+GLUT1+and+GLUT3+reveals+multiple+roles+for+glucose+metabolism+in+platelet+and+megakaryocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Deletion of GLUT1 and GLUT3 reveals multiple roles for glucose metabolism in platelet and megakaryocyte function.</a> Cell Rep. 20 (4), 881-894 (2017).</li>
<li>Fidler, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+is+required+for+platelet+hyperactivation+in+a+murine+model+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism is required for platelet hyperactivation in a murine model of type 1 diabetes.</a> Diabetes. 68 (5), 932-938 (2019).</li>
<li>Kulkarni, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerobic+glycolysis+fuels+platelet+activation%3A+Small-molecule+modulators+of+platelet+metabolism+as+anti-thrombotic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Aerobic glycolysis fuels platelet activation: Small-molecule modulators of platelet metabolism as anti-thrombotic agents.</a> Haematologica. 104 (4), 806-818 (2019).</li>
<li>Ghatge, M., Flora, G. D., Nayak, M. K., Chauhan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+metabolic+profiling+reveals+glycolytic+and+1-carbon+metabolites+are+essential+for+gp+vi-stimulated+human+platelets-brief+report%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Platelet metabolic profiling reveals glycolytic and 1-carbon metabolites are essential for gp vi-stimulated human platelets-brief report.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (2), 409-416 (2024).</li>
<li>Ravera, S., Signorello, M. G., Panfoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+metabolic+flexibility%3A+A+matter+of+substrate+and+location%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Platelet metabolic flexibility: A matter of substrate and location.</a> Cells. 12 (13), (2023).</li>
<li>Hechler, B., Dupuis, A., Mangin, P. H., Gachet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+preparation+for+function+testing+in+the+laboratory+and+clinic%3A+Historical+and+practical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Pract+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Platelet preparation for function testing in the laboratory and clinic: Historical and practical aspects.</a> Res Pract Thromb Haemost. 3 (4), 615-625 (2019).</li>
<li>Mustard, J. F., Perry, D. W., Ardille, N. G., Packham, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+suspensions+of+washed+platelets+from+humans%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Preparation of suspensions of washed platelets from humans.</a> British Journal of Haematology. 22, 193-204 (1972).</li>
<li>Cazenave, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+washed+platelet+suspensions+from+human+and+rodent+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood.</a> Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).</li>
<li>Fine, K., Ashbrook, P., Brigden, L., Maldonado, J., Didishelm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-filtered+human+platelets.+Ultrastructure%2C+function%2C+and+role+of+proteins+in+inhibition+of+aggregation+by+aspirin%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Gel-filtered human platelets. Ultrastructure, function, and role of proteins in inhibition of aggregation by aspirin.</a> Am J Pathol. 84 (1), (1976).</li>
<li>Weiss, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+to+isolate+quiescent+washed+platelets+from+human+whole+blood+and+generate+platelet+releasate+under+clinical+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol to isolate quiescent washed platelets from human whole blood and generate platelet releasate under clinical conditions.</a> STAR Protoc. 4 (2), 102150(2023).</li>
<li>Burzynski, L. C., Pugh, N., Clarke, M. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+isolation+and+activation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Platelet isolation and activation assays.</a> Bio Protoc. 9 (20), e3405(2019).</li>
<li>Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+collection%2C+platelet+isolation+and+measurement+of+platelet+count+and+size+in+mice-a+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide.</a> Platelets. 30 (6), 698-707 (2018).</li>
<li>Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+platelets+from+mouse+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of platelets from mouse blood.</a> J Vis Exp. (147), (2019).</li>
<li>Aibibula, M., Naseem, K. M., Sturmey, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+and+metabolic+flexibility+in+blood+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism and metabolic flexibility in blood platelets.</a> J Thromb Haemost. 16 (11), 2300-2314 (2018).</li>
<li>Ravi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+plasticity+in+resting+and+thrombin-activated+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Metabolic plasticity in resting and thrombin-activated platelets.</a> PLoS One. 10 (4), e0123597(2015).</li>
<li>Nayak, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((an+inhibitor+of+pyruvate+dehydrogenase+kinases%2C+inhibits+platelet+aggregation+and+arterial+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">an inhibitor of pyruvate dehydrogenase kinases, inhibits platelet aggregation and arterial thrombosis.</a> Blood Advances. 2, (2018).</li>
<li>Hadley, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormones%2C+age%2C+and+sex+affect+platelet+responsiveness+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Hormones, age, and sex affect platelet responsiveness in vitro.</a> Transfusion. 62 (9), 1882-1893 (2022).</li>
<li>Paglia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+metabolomic+study+of+platelets+reveals+the+expression+of+discrete+metabolic+phenotypes+during+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Comprehensive metabolomic study of platelets reveals the expression of discrete metabolic phenotypes during storage.</a> Transfusion. 54 (11), 2911-2923 (2014).</li>
<li>Sake, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopically+nonstationary+%2813%29c+metabolic+flux+analysis+in+resting+and+activated+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">Isotopically nonstationary (13)c metabolic flux analysis in resting and activated human platelets.</a> Metab Eng. 69, 313-322 (2022).</li>
<li>Antoniewicz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+metabolic+flux+analysis+in+metabolic+engineering%3A+Methods%2C+tools+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">A guide to metabolic flux analysis in metabolic engineering: Methods, tools and applications.</a> Metab Eng. 63, 2-12 (2021).</li>
<li>Larsen, M. T., Kuhlmann, M., Hvam, M. L., Howard, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albumin-based+drug+delivery%3A+Harnessing+nature+to+cure+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Ther%22%5BJournal%5D)">Albumin-based drug delivery: Harnessing nature to cure disease.</a> Mol Cell Ther. 4 (3), (2016).</li>
<li>Balduini, C. L., Noris, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((latelet+count+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">latelet count and aging.</a> Haematologica. 9 (6), 953-955 (2014).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Using+a+hemacytometer+to+count+cells%22">Using a hemacytometer to count cells</a>. , (2023).</li>
<li>Spurgeon, B. E. J., Naseem, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+flow+cytometry%3A+Instrument+setup%2C+controls%2C+and+panel+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+B+Clin+Cytom%22%5BJournal%5D)">Platelet flow cytometry: Instrument setup, controls, and panel performance.</a> Cytometry B Clin Cytom. 98 (1), 19-27 (2020).</li>
<li>Van Velzen, J. F., Laros-Van Gorkom, B. A., Pop, G. A., Van Heerde, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+flow+cytometry+for+evaluation+of+platelet+surface+antigens+and+activation+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Multicolor flow cytometry for evaluation of platelet surface antigens and activation markers.</a> Thromb Res. 130 (1), 92-98 (2012).</li>
<li>Sake, C. L., Newman, D. M., Boyle, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quenching+methods+for+metabolite+recovery+in+photoautotrophic+synechococcus+sp.+Pcc+7002%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quenching methods for metabolite recovery in photoautotrophic synechococcus sp. Pcc 7002.</a> Biotechnol Prog. 36 (5), e3015(2020).</li>
<li>Sapcariu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+extraction+of+proteins+and+metabolites+from+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Simultaneous extraction of proteins and metabolites from cells in culture.</a> MethodsX. 1, 74-80 (2014).</li>
<li>Rana, A., Westein, E., Niego, B., Hagemeyer, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-dependent+platelet+aggregation%3A+Mechanisms+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Shear-dependent platelet aggregation: Mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Front Cardiovasc Med. 6, 141(2019).</li>
<li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+shear-induced+platelet+activation%3A+High+shear+stresses+for+short+exposure+time%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">Quantification of shear-induced platelet activation: High shear stresses for short exposure time.</a> Artif Organs. 39 (7), 576-583 (2015).</li>
<li>Ardlie, N., Perry, D., Packham, M., Mustard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+apyrase+on+stability+of+suspensions+of+washed+rabbit+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Influence of apyrase on stability of suspensions of washed rabbit platelets.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 136 (4), (1971).</li>
<li>Rao, G. H. R., Reddy, K. R., Hagert, K., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+ph+on+the+prostacyclin+%28pg12%29+mediated+inhibition+of+platelet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Medicine%22%5BJournal%5D)">Influence of ph on the prostacyclin (pg12) mediated inhibition of platelet function.</a> Prostaglandins Medicine. 4, 263-273 (1980).</li>
<li>Navred, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+flow+cytometric+method+for+detection+of+inherited+platelet+disorders-a+comparison+to+the+gold+standard+light+transmission+aggregometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A simplified flow cytometric method for detection of inherited platelet disorders-a comparison to the gold standard light transmission aggregometry.</a> PLoS One. 14 (1), e0211130(2019).</li>
<li>Aldrighi, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+activation+status+decreases+after+menopause%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Platelet activation status decreases after menopause.</a> Gynecol Endocrinol. 20 (5), 249-257 (2005).</li>
<li>Bausset, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulation+and+storage+of+platelet-rich+plasma+homemade+product%5BTitle%5D)+AND+%22Biores+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Formulation and storage of platelet-rich plasma homemade product.</a> Biores Open Access. 1 (3), 115-123 (2012).</li>
<li>Nayak, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolic+enzyme+pyruvate+kinase+m2+regulates+platelet+function+and+arterial+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The metabolic enzyme pyruvate kinase m2 regulates platelet function and arterial thrombosis.</a> Blood. 137 (12), 1658-1668 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.22 ve mikro; M filtre Spin-X tüpleri</td><td>Millapore-Sigma</td><td>CLS8160</td><td>Reaktif hazırlığı</td></tr><tr><td>19 G x 3/4" iğne</td><td>McKesson Corporation</td><td>448406</td><td>Flebotomi</td></tr><tr><td>21 G Luer kilitli 1,5 inç iğne</td><td>Amazon</td><td>B0C39PJD23</td><td>Reaktif hazırlığı</td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka, yarım alan</td><td>Greiner Bio-One</td><td>675101</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>ACD-A vakkülatörleri&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>364606</td><td>Flebotomi</td></tr><tr><td>Adaptörü</td><td>McKesson Corporation</td><td>609</td><td>Flebotomi</td></tr><tr><td>Alkol çubuğu</td><td>VWR</td><td>15648-916</td><td>Patateslerden Flebotomi</td></tr><tr><td>Apiraz</td><td>Sigma</td><td>A6410-100UN</td><td>Reaktif hazırlama</td></tr><tr><td>CD42a Monoklonal Antikor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0428-42</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>Soğutulmuş mikrosantrifüj ve nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002441</td><td>Söndürme</td></tr><tr><td>D-Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>Reaktif hazırlama</td></tr><tr><td>FITC Anti-Fibrinojen antikoru</td><td>Abcam</td><td>4217</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>Akış sitometresi</td><td>Beckman Coulter</td><td>82922828</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>Gazlı bez</td><td>VWR</td><td>76049-110</td><td>Flebotomi</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>Reaktif hazırlığı</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>Reaktif hazırlığı</td></tr><tr><td>İnsan alfa-trombin</td><td>Prolytix</td><td>HCT-0020</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td>Reaktif hazırlığı</td></tr><tr><td>KH2P<O>sub4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>Reaktif hazırlığı</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td>Reaktif hazırlığı</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri</td><td>VWR</td><td>87003-292</td><td>Genel</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td>Reaktif hazırlığı</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Reaktif hazırlığı</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>Reaktif hazırlığı</td></tr><tr><td>Dar delikli transfer pipeti</td><td>VWR</td><td>16001-176</td><td>Trombosit yıkama</td></tr><tr><td>Paraformaldehit çözeltisi, PBS</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-281692'de %4</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>PECy5 Fare Anti-İnsan CD62P</td><td>BD Pharmingen</td><td>551142</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>Plaka kapağı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0626</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>Polipropilen 15 mL konik tüpler</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td>Reaktif hazırlığı</td></tr><tr><td>Polipropilen 50 mL konik tüpler</td><td>VWR</td><td>352070</td><td>Trombosit yıkama</td></tr><tr><td>Prostaglandin I2 (sodyum tuzu)</td> <td>Cayman Chemical</td><td>18220</td><td>Reaktif hazırlama</td></tr><tr><td>SKC Inc. C-Chip Tek Kullanımlık Hemositometreler</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-100</td><td>Hücre sayma</td></tr><tr><td>Şırıngası</td><td>BD Pharmingen</td><td>14-823-41</td><td>Reaktif hazırlama</td></tr><tr><td>Turnike</td><td>VWR</td><td>76235-371</td><td>Flebotomi</td></tr><tr><td>Vacutainer iğne tutucu</td><td>BD</td><td>364815</td><td>Flebotomi</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>VWR</td><td>102091-234</td><td>Reaktif hazırlama</td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP02</td><td>Trombosit yıkama</td></tr><tr><td>Geniş delikli transfer pipeti</td><td>VWR</td><td>76285-362</td><td>Trombosit yıkama</td></tr></tbody></table>

kantitatif metabolik akı çalışmaları için yıkanmış insan trombositlerinin hazırlanması

Preparation of Washed Human Platelets for Quantitative Metabolic Flux Studies

Şekil 2'deki temsili sonuçlar, 3 erkek ve 3 kadın olmak üzere 6 farklı kan bağışçısını temsil etmektedir. Tam kana göre trombosit verimi Şekil 2A'da gösterilmiştir. Son trombosit iyileşmesi ortalama R ± %3 idi (standart sapma, n=6). Beyaz kan hücresi kontaminasyonuna kıyasla son trombosit sayısı, otomatik bir hematoloji analizörü kullanılarak ölçüldü. Beyaz kan hücresi sayıları toplam hücrelerin %0.1'inden azdı (Şekil 2B). Yıkama iş...

Kantitatif metabolik akı çalışmaları için yıkanmış insan trombositlerinin hazırlanması

Platelets are blood cells that play an integral role in hemostasis and the innate immune response. Platelet hyper- and hypoactivity have been implicated ...

preparation-washed-human-platelets-for-quantitative-metabolic-flux

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, megakaryositlerin farklılaşması ve trombosit oluşumu için bir teknik göstermektedir. İnsan göbek kordonu kanından izole edilen hematopoietik kök progenitör hücreler, trombopoietin varlığında olgun megakaryositlere farklılaşır. Olgun megakaryositler, tek tek trombositlere yol açan proplateletler adı verilen sitoplazmik uzantılar üretir.

Megakaryositlerin Farklılaşması ve Trombosit Oluşumu için İn Vitro Yöntem

Bu video, önceden işlenmiş, yıkanmış insan trombositlerinde kollajen kaynaklı trombosit agregasyonunu değerlendirmek için türbidimetrik analizi göstermektedir. Kontrol kuyuları kollajen kaynaklı agregasyon gösterirken, yüksek konsantrasyonda inhibitörler Pannexin-1 kanallarını bloke eder, böylece değişmemiş bulanıklıktan belirgin olan kollajen kaynaklı trombosit agregasyonunu inhibe eder.

Önceden İşlem Görmüş İnsan Trombositlerinin Kollajen Kaynaklı Agregasyonunu İzlemek için Bir Türbidimetrik Analiz

Kan lökositleri ve trombosit bireyin genel bioenergetic sağlığının bir belirteci olarak kullanılır ve bu nedenle patolojik süreçlerin ve tedavilerin etkisini izlemek için bir potansiyele sahip olabilir. Burada mitokondriyal fonksiyonu ve bu hücrelerde oksidatif patlama izole etmek ve ölçmek için bir yöntem tarif eder.

İnsan lökosit ve trombosit İzolasyonu ve Değerlendirme Protokolleri: Biyoenerji ve Oksidatif Burst

Burada izole edilmiş insan trombosit Ben rotenone inhibitör kompleksi cevaben metabolik uyarlamalar incelemek için ex vivo olarak erişilebilir bir şekilde modeli kullanılabilir göstermektedir. Bu yaklaşım, sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi ile izotopik izleme ve nispi miktarını kullanır ve çalışma düzeni, çeşitli uygulanabilir.

Mitokondriyal Metabolizma incelenmesi için Platform olarak İnsan Trombositler LC-MS Analizi

Biz bulanıklık derecesi agonist kaynaklı trombosit agregasyon ölçümleri ile takip insan kanından yıkanıp trombosit izolasyonu için basit bir yöntem tarif eder. Bir örnek olarak, Pannexin1 kanalı inhibitörü Parlak Mavi FCF ile bir ön kuluçkalama sonrası kollajen insan trombosit agregasyon cevap üzerinde çalışma yapılması için bu yöntemi uygulanır.

Kollajen ile indüklenen on Aggregation Pannexin1-inhibitör Parlak Mavi FCF: Türbidimetrik İnsanlar üzerinde Trombositler Yıkanmış

Bu çalışma, trombosit yapışması, yayılması ve akış altında salgı çalışması için bir floresan mikroskopi tabanlı yöntem açıklanmaktadır. Bu çok yönlü platform tromboz ve hemostaz üzerine mekanik araştırma için trombosit fonksiyonunun araştırılmasını sağlar.

Akım altında Trombosit Degranülasyonu ve Salgılamanın Canlı Hücreli Görüntüleme

Bu yazıda, endotel von Willebrand değerlendirmek için bir yöntem tarif faktör yayın ve sonraki trombosit yakalama inflamatuar bizi canlı tutan bir vitro akış odası sistemi kullanarak sıvı kesme oluşuyor.

Soruşturma von Willebrand faktör patofizyolojisi kullanarak bir akışı odası Model von Willebrand faktör-trombosit dize oluşumu

Lökosit heyecanla damar hücreleri ve trombositlerin damar duvar yaralanma sonra veya enflamasyon sırasında etkileşim. Burada, lökosit ve hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize etmek için basit bir laminar akış tabanlı tahlil açıklayın.

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

Burada, fare kanı bir anti-koagulan varlığında toplandı. Trombositler, düşük hızlı santrifüjleme kullanılarak iohexol degrade orta tarafından arındırıldı. Trombositler uygulanabilir olup olmadığını araştırmak için Trombin ile aktive edildi. Arıtılmış trombositlerin kalitesi akış sitometri ve mikroskobu ile incelendi.

Fare kan trombosit arıtma

Prokoagülan trombosit oluşumu, artmış tromboz riski ile ilişkilendirilmiştir. Burada, prokoagülan trombositlerin ayırt edici özellikleri olan fosfatidilserin ve mikrovezikül salınımının maruziyetini ölçmeyi amaçlayan, yıkanmış trombositleri insan kanından izole etmek için kesin bir protokol sunulmaktadır.

İnsan Saflaştırılmış Trombositlerinden Fosfatidilserin Maruziyeti ve Mikrovezikül Salınımının Ölçülmesiyle Prokoagülan Trombosit Karakterizasyonu

Burada, kemik iliği, dalak ve enfarktüslü kalpten makrofajların çıkarılması ve ardından canlı hücrelerdeki metabolik akışın değerlendirilmesi için yöntemleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Dalak ve Kardiyak Makrofajlarda ve Kemik İliği Monositlerinde Ex Vivo Metabolik Akının Analizi

Öğrenin, yıkanmış insan trombositlerinden hücre içi metabolitlerin izolasyonu için güvenilir bir protokol. Akut östrojen maruziyetinin trombotik risk üzerindeki etkisini metabolik analizlerle araştırın.

Kantitatif metabolik akı çalışmaları için yıkanmış insan trombositlerinin hazırlanması

Daha fazla video keşfet