Kantitatif metabolik akı çalışmaları için yıkanmış insan trombositlerinin hazırlanması

Akut östrojen maruziyetinin trombosit merkezi karbon metabolizması ve istirahat ve trombin ile aktive olan trombositler üzerindeki etkisini inceledim. Trombositler üzerinde akut östrojen maruziyetinin oral kontraseptif kullanımının neden olduğu trombotik riskteki artışa katkıda bulunup bulunmadığını belirlemeye çalışıyoruz. Kadın sağlığı araştırmaları büyük ölçüde yetersiz finanse edilmektedir.

Bu proje, NIH'nin kadın sağlığı ile ilgili bilgi boşluklarını ele almak için yaptığı daha büyük bir çağrının parçasıydı. Kontraseptiflerin 50 yıldan daha uzun süredir mevcut olmasına rağmen, daha yüksek trombotik riske neden olan kesin mekanizmayı hala bilmiyoruz. Biyolojik değişkenlik.

Geleneksel hücre kültürleme teknikleri trombositler için geçerli değildir, yani trombositler farklı genotiplere sahip donörlerden gelir. Tekrarlanabilir bir trombosit izolasyon prosedürüne duyulan ihtiyacı vurgulayan büyük numune boyutlarına ihtiyaç vardır. Mevcut trombosit yıkama protokolleri, trombosit biyolojisi alanındaki uzmanlar için yazılmıştır.

Protokolümün acemi trombosit araştırmacısı için vurguladığı trombositler üzerinde çalışmakla ilgili bir dizi benzersiz zorluk var. Başlamak için, su banyosunu önceden 37 santigrat dereceye ısıtın ve modifiye edilmiş Tyrode'un glikoz içeren tamponunu içine yerleştirin. Tüm vakutainerlerden toplanan tam kanı 50 mililitrelik polipropilen konik bir tüpte birleştirin.

Eğimli kesimli bir pipet ucu kullanarak, hücre sayımı yapmak için uygun bir numune hacmi alın. Oluşan kabarcıkları gidermek için dar delikli bir transfer pipeti ile dikkatlice aspire edin. Daha sonra kanı 37 derecelik bir su banyosunda 25 dakika dinlendirin.

Santrifüjleme sırasında aktivasyonu önlemek için, tam kana prostaglandin I2 ve apyraz ekleyin ve numuneyi karıştırmak için tüpü bir kez ters çevirin. Daha sonra, tam kanı 250G'de 37 santigrat derecede ara vermeden 15 dakika santrifüjleyin. Buffy ceket ve kırmızı kan tabakasının üzerinde en üst sarı tabaka olarak görünen PRP'yi, duvar boyunca yeni eğimli 50 mililitrelik konik bir tüpe toplayın.

PRP'yi 37 santigrat derecede 10 dakika dinlendirin. İnkübasyondan sonra, PRP'yi 500 nanomolar prostaglandin I2 ve mililitre apyrase başına 0.02 ünite ile karıştırın. Karışımı 1.000G'de 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede hızlanma ve kırılma olmadan santrifüjleyin.

Şimdi plastik geniş delikli bir transfer pipeti kullanarak, süpernatanı yığın hacmi için aspire edin ve ardından peletin yakınında kalan sıvıyı aspire etmek için kesilmemiş uçlu bir mililitrelik pipet kullanın. Daha sonra prostaglandin I2 ve apyrase içeren Tyrode tamponunu konik tüpün yan tarafından aşağı doğru pelete ekleyin. Eğimli kesimli bir uç ve bir mililitrelik pipet ucu kullanarak, peleti birkaç kez nazikçe yeniden süspanse edin.

Pelet yeniden süspanse edildikten sonra, yeni bir konik tüpe aktarmak için geniş delikli bir transfer pipeti kullanın ve geride kırmızı hücreler veya gözle görülür şekilde kümelenmiş hücreler bırakın. Ardından, eğimli kesimli bir pipet ucu kullanarak akış sitometrisi için bir numune alın. İnhibitörlerin yıpranmasını sağlamak için trombositlerin geri kalanını 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, numuneyi geniş delikli bir pipetle nazikçe karıştırın ve numuneleri akış sitometrisi için ayırın. Tam kandan ortalama trombosit geri kazanımı %52 civarındaydı ve yıkama işleminden sonra beyaz kan hücresi kontaminasyonu %0.1'in altında kaldı. P-selektin maruziyeti yıkama işlemi boyunca düşüktü, ancak trombin tedavisinden sonra önemli ölçüde arttı.

Bağlı fibrinojen seviyeleri başlangıçta ilk 1.000G dönüşten sonra yükseldi, ancak ikinci dönüşten sonra% 5'in altına düştü ve trombin tedavisinden sonra tekrar önemli ölçüde arttı. Trombositler, aktivasyon belirteçleri ölçülmeden önce boyut, singletler ve CD42a pozitifliği için başarılı bir şekilde kapılandı. Trombin tedavisi, kontrole kıyasla P-selektin ve fibrinojen ekspresyonunda önemli bir artışa yol açtı.

Başlamak için, yıkanmış trombositleri insan kan örneklerinden alın. Mikrosantrifüjü sıfır santigrat dereceye kadar önceden soğuttuktan sonra, trombosit süspansiyonunu 1: 6 oranında kısmen donmuş normal salin içinde toplayın. Karışımı 16.000G'de sıfır santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı ayrı bir mikrosantrifüj tüpüne aspire edin. Daha sonra, 0,5 mililitre önceden soğutulmuş metanol ekleyin: söndürülmüş pelete eksi 20 santigrat derecede su ve bir dakika boyunca kuvvetlice girdap. Numuneyi sıvı nitrojen içinde dondurun ve sıfır santigrat derecede çözdürün.

Süspansiyonu dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 16.000G'de tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Süpernatanı gece boyunca kuruttuktan sonra, kuru ekstraktı 150 mikrolitre LC / MS dereceli suda tekrar süspanse edin ve dört santigrat derecede 15 dakika karıştırın. Hücre kalıntılarını gidermek için özü kısaca girdaplayın ve 0.22 mikrometrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Numuneyi 16.000G ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Santrifüjleme sonrası, filtreye 50 mikrolitre daha su pipetleyin ve 16.000G ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. Son olarak, analiz için süzüntüyü toplayın.

Tüm donör örneklerinde laktat üretimi pozitifken, glikoz ve asetat sürekli olarak tüketildi ve trombin bu akıları arttırdı.