Miyelin Kalıntılarının Mikroglial Fagositozunun Değerlendirilmesi in vitro Tekrarlanan Manyetik Stimülasyon Altında

Mevcut protokol, tekrarlayan manyetik stimülasyonun mikroglia'nın miyelin kalıntılarını fagositoz etme yeteneği üzerindeki etkisini değerlendirmek için tasarlanmıştır. Bunu yapmak için bir in vitro mikroglia ve miyelin kalıntı ko-kültür sistemi kurulmuştur.

[Öğretim Görevlisi] Çalışmamızın kapsamı nöro-rehabilitasyon ve manyetik simülasyon terapisi alanındaki araştırmalara odaklanmaktadır. Bu protokol, net bir işlevi nasıl etkilediğini araştırmak için manyetik stimülasyon için yeni fikirler sağlayabilir. Gelecekte nöro-rehabilitasyon ve manyetik stimülasyon tedavisine odaklanacağız.

[Öğretim Görevlisi] Başlamak için, dişi bir farenin kafası kesilmiş bir kafasını alın. Kafayı buz üzerinde inceleyin. Bir makasla, beyni tamamen açığa çıkarmak ve tamamen çıkarılmasını kolaylaştırmak için kafatasını ikiye bölün. Zarları, beyinciği ve hipokampusu titizlikle ve aseptik olarak çıkarmak için makas ve forseps kullanın. Kalan kan veya dokuyu çıkarmak için beyni PBS ile üç kez temizleyin. Temizlenmiş beyni 10 mililitre 0.32 molar steril sükroz çözeltisine aktarın. Bir çift mikrocerrahi makasla, beyin dokusu-sükroz karışımı elde etmek için beyin dokusunu parçalara ayırın. Daha sonra, beyin dokusu-sükroz karışımını 50 mililitrelik steril bir homojenizatöre aktarın. 30 mililitre 0.32 molar steril sükroz çözeltisi ekleyin. Dokuyu iki dakika boyunca öğütmek için 50 mililitrelik bir cam homojenizatör kullanın. Pürüzsüz bir beyin dokusu homojenatı elde etmek için. Beyin dokusu homojenatını 0.32 molar steril sükroz çözeltisi ile 90 mililitreye seyreltin ve iyice karıştırın. Altı steril, ince duvarlı polipropilen ultrasantrifüj tüpüne 20 mililitre 0.83 molar steril sükroz çözeltisi ekleyin. Daha sonra 15 mililitre beyin karışımını yavaşça tüplerin üst kısmına dağıtın. Hacimleri 0.32 molar steril sükroz çözeltisi ile düzleştirin. Ham miyelin kalıntılarını toplamak için önce ön soğutma ve ultra santrifüj rotorunu dört santigrat derecede çalıştırın. Numuneyi 75.000 G'de 45 dakika santrifüjleyin, ardından steril bir mera pipeti kullanarak iki sükroz yoğunluğu arasındaki arayüzden miyelin kalıntılarını toplayın. İlk izotonik ayırma ve saflaştırma için, toplanan miyelin kalıntı çözeltisini 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Önceden soğutulmuş steril PBS ile hacmi 35 mililitreye ayarlayın ve yeni bir homojenizatör tüpüne aktarın. Üç dakika homojenize ettikten sonra, miyelin kalıntıları homojenatını altı adet 38,5 mililitrelik steril, ince duvarlı, polipropilen ultrasantrifüj tüpe eşit olarak dağıtın. Hacmi steril PBS ile doldurun ve ardından santrifüjleyin. İkinci izotonik ayırma ve saflaştırma için, bir miyelin kalıntısı süspansiyonu elde etmek için katı beyaz peleti 10 mililitre önceden soğutulmuş steril PBS'de yeniden süspanse edin. Süspansiyonu daha önce olduğu gibi ultrasantrifüj tüplerine dağıtın ve santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın. Katı beyaz peleti altı mililitre steril PBS'de yeniden süspanse edin. Miyelin kalıntı süspansiyonunu altı adet 1.5 santrifüj tüpüne bölün ve tekrar santrifüjleyin. Son olarak, süpernatanı attıktan sonra peleti 100 mikrolitre önceden soğutulmuş steril PBS'de yeniden süspanse edin. Gerekli miyelin kalıntılarını dört santigrat derecede veya buzlu suda çözün ve daha önce olduğu gibi 10 dakika santrifüjleyin. Miyelin kalıntılarını 200 mikrolitre 50 mikromolar CFSE çözeltisinde yeniden süspanse edin. Süspansiyonu oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika inkübe edin, ardından tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı atın, ardından numuneleri 500 mikrolitre steril PBS ile üç kez yıkayın. Floresan etiketli miyelin kalıntılarının bir süspansiyonunu elde etmek için miyelin kalıntılarını 100 mikrolitre önceden soğutulmuş steril PBS'de yeniden süspanse edin. Numuneyi daha fazla kullanana kadar -80 santigrat derecede saklayın. İn vitro tekrarlanan manyetik stimülasyon için, tedavi frekansını 20 hertz'e, tedavi yoğunluğunu maksimum çıkış yoğunluğunun% 1'ine ve stimülasyon süresini beş saniyeye ayarlayın. 20 saniyelik bir dinlenme süresi ekleyin ve 2,5 dakikalık tek bir tedavi süresi boyunca 600 darbe uygulayın. Manyetik stimülasyon parametrelerini önceden belirledikten sonra, bobin yönünü yere dik olarak sabitleyin ve yukarı doğru yönlendirin. Hücre kontaminasyonunu önlemek için manyetik stimülasyon bobinini alkolle sterilize edin. 50 mikromolar CFSE ekledikten sonra, 1.000 BV-2 hücresini gece boyunca 24 oyuklu plakaya yerleştirin, ardından eski ortamı bir pipetle aspire edin ve hemen taze serumsuz ortam ekleyin. Ortamı serumsuz ortama değiştirin ve hücreleri 12 saat boyunca mililitre lipopolisakkarit başına bir mikrogram ile tedavi edin. 12 saatlik lipopolisakkarit müdahalesinden sonra, karanlıkta ko-kültür için ortama mililitre miyelin kalıntısı başına 100 mikrogram ekleyin. Hücreleri daha önce gösterildiği gibi tekrarlanan manyetik stimülasyona tabi tutun. Kuluçka makinesine geri koymadan önce sterilize etmek için plakanın üzerine alkol püskürtün. Miyelin fragmanları ile bir ko-kültür döneminden sonra, emilmeyen miyelin kalıntılarını PBS ile nazikçe yıkayın. Hücreleri 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Daha sonra,% 10 eşek serum albümini ve% 0.3 Triton X-100 içeren 150 mikrolitre PBS ekleyin ve inkübe edin. Kuyuları PBS ile yıkadıktan sonra, kuyucuklara 100 ila 200 oranında bir birincil antikor çözeltisi ekleyin ve soğukta inkübe edin. Daha sonra, hücreleri konfokal mikroskopla görüntülemeden önce oda sıcaklığında iki saat boyunca 100 ila 300 oranında ikincil bir antikorda inkübe edin. BV-2 mikroglia hücreleri, lipopolisakkarit tedavisini takiben miyelin kalıntı fagositozunda önemli bir azalma göstermiştir. tekrarlanan manyetik stimülasyon müdahalesi üzerine tersine çevrildi. Kantitatif analiz, lipopolisakkarit grubundaki BV-2 hücreleri içindeki miyelin kalıntı alanında kontrole kıyasla önemli bir azalma olduğunu ve lipopolisakkarit ile tedavi edilen manyetik olarak uyarılmış grupta kayda değer bir artış olduğunu doğruladı. Miyelin döküntüsü ile birlikte lokalize olan IBA-1 pozitif mikroglia yüzdesi, LPS grubunda kontrole kıyasla anlamlı derecede düşükken, manyetik stimülasyon bu yüzdeyi önemli ölçüde artırdı. Grubumuz için lipopolisakkarit ile tedavi edilen manyetik olarak uyarılan grupta mikroglial fagositozda zamana bağlı bir artış gözlendi ve anlamlı derecede daha yüksek miyelin kalıntısı alımı gösterdi.