Fare İç Kulak Dokusunun Kriyoseksiyon ve İmmün Boyama: Embriyonik Aşamalardan Yetişkin Aşamalarına

Araştırmam kokleanın nörogelişimine odaklanıyor. Özellikle, koklea içinde SNAPS oluşumunun altında yatan mekanizmaları ortaya çıkarmayı ve Alzheimer hastalığı ile işitme kaybı arasındaki bağlantıyı araştırmayı amaçlıyorum. Canlı görüntüleme ve genetik araçlar, koklear yapıları ve nöral devreleri daha ayrıntılı olarak inceleme yeteneğimizi geliştirerek, denetçi sistemi esnekliği ve işlev bozukluğu hakkında daha derin bilgiler sağlıyor. Bu protokolü yayınlayarak, denetçi biliminde yeni olan araştırmacılara, özellikle de daha önce koklea ile çalışmamış olan araştırmacılara yardımcı olmak istiyoruz. Bu kılavuz, embriyonik, yenidoğan ve yetişkin farelerden iç kulak örneklerinin nasıl hazırlanacağını adım adım açıklamaktadır. Amacımız iç kulak deneylerini kolaylaştırmak, sonuçların güvenilir ve tutarlı olmasını sağlamaktır. Kesit immün boyamanın, tam montajlı immün boyama gibi diğer yöntemlere göre çeşitli avantajları vardır. Proteinleri ve nükleik asitleri iyi korur ve ölçümleri daha doğru ve tutarlı hale getiren ince, neredeyse 2 boyutlu bölümler oluşturur. Bu yöntem aynı zamanda tüm koklear hücre tiplerini sağlam ve görünür tutarak immün boyama kültünü geliştirir. Tam montajlı preparatların aksine, kesit spiral ligament, stria vascularis, Reissner membranı ve tektoryal membran gibi önemli yapıları korur.

[Öğretim Görevlisi] Başlamak için, genç ötenazi fareyi cerrahi bir platforma yerleştirin. İnce diseksiyon makası kullanarak, boyundan başlayıp buruna doğru uzanan kafa derisi boyunca dikkatlice orta hat kesisi yapın. Ardından, makasın alt bıçağını foramen magnumuna ve üst bıçağı kafatasına yerleştirin. İkinci kesimi tamamlamak için kafatasının üst yarısını buruna kadar kesin. Makası kısmen kesilmiş kafadan geri çekin. Makasın alt bıçağını kafatasının altına ve üst bıçağı foramen magnumun altına yerleştirin. Üçüncü kesimi tamamlamak için başın alt yarısını buruna kadar kesin. İnce forseps ve makas kullanarak beyin, kaslar ve bağ dokusu dahil olmak üzere temporal kemiği çevreleyen yumuşak dokuları dikkatlice ayırın. Daha sonra, farenin yarım kafalarını PBS içeren 24 oyuklu bir plakanın kuyularına yerleştirin. Fiksasyon için PBS'yi %4 paraformaldehit solüsyonu ile değiştirin ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Fiksasyondan sonra, dokuyu PBS ile beş ila 10 dakika boyunca üç kez durulayın. Farenin yarım kafasının içindeki temporal kemiği veya iç kulak kapsülünü bulun. İnce forseps kullanarak, iç kulak kapsülünü çevreleyen yumuşak dokuyu dikkatlice ayırın. Gevşetildikten sonra, iç kulak kapsülünün etrafındaki dokuyu kesin. Ardından, tamamen serbest bırakmak için forseps kullanarak iç kulak kapsülünü çevreleyen alana hafif bir baskı uygulayın. İç kulak örneklerini PBS'de dört santigrat derecede saklayın. Başlamak için, yetişkin ötenazi fareyi cerrahi bir platforma yerleştirin. Keskin diseksiyon makası kullanarak, boyundan başlayıp buruna doğru uzanan kafa derisi boyunca orta hat kesisi yapın. İlk kesim sırasında kafatasını ortaya çıkarmak için cildi geriye doğru katlayın. Makasın alt bıçağını foramen magnum'a ve üst bıçağı kafatasına yerleştirin. İkinci kesimi tamamlamak için kafatasının üst yarısını buruna kadar kesin. Makası kısmen kesilmiş kafadan geri çekin. Alt bıçağı kafatası tabanına ve üst bıçağı foramen magnumuna yerleştirin. İç kulaklardan kaçınarak başın alt yarısını orta hat boyunca buruna kadar kesin. Her yarım kafa için, beyin, kaslar ve bağ dokusu dahil olmak üzere temporal kemiği çevreleyen yumuşak dokuyu ayırmak için forseps ve makas kullanın. Ardından, kafatası dokusunu parmaklarınızla ters kıvırın ve temporal kemiğin alt tarafına hafif bir baskı uygulamak için başparmağınızı kullanın. Kemiği çevresindeki ataşmanlardan yavaş yavaş gevşetin. İç kulak kapsülü çıkarıldıktan sonra, PBS ile iyice durulayın. Mikroskop altına %4 paraformaldehit ile doldurulmuş bir Sylgard kabı yerleştirin. Tabağa tek bir iç kulak kapsülü yerleştirin. İç kulakta herhangi bir yapışkan yumuşak doku veya kemik olup olmadığını inceleyin ve nazikçe çıkarın. Oval pencereyi tanımlayın ve forseps kullanarak stapesleri nazikçe çıkarın. Daha sonra, ince forseps kullanarak, kokleanın tepesinde küçük bir delik açın. %4 paraformaldehit ile doldurulmuş bir P20 pipeti kullanarak, seyreltik kan veya endolenf gibi sıvıların oval pencereden çıkmasını sağlamak için kokleayı yıkayın. Sabit kokleayı% 4 paraformaldehit ile doldurulmuş 24 oyuklu bir plakaya aktarın. Zamanı işaretleyin ve bir külbütör veya nutatör kullanarak hafif çalkalama ile 30 ila 60 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, numuneyi PBS ile beş ila 10 dakika boyunca üç kez durulayın. Son durulamayı takiben, kokleayı 1.25 milimolar EDTA'ya yerleştirin ve dört santigrat derecede iki ila üç gün sallanmasına izin verin. EDTA tedavisinden sonra, kokleayı PBS ile beş dakika boyunca üç kez durulayın. Başlamak için, diseke edilmiş iç kulak kapsülünü% 10 sükroz çözeltisine yerleştirin ve oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra,% 10 sükroz çözeltisini% 20 sükroz ile değiştirin ve iki saat daha inkübe edin. Daha sonra %20 sükroz çözeltisini %30 sükroz ile değiştirin ve numuneyi gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün,% 30'luk sükroz çözeltisinin yarısını çıkarın. Alanı optimum kesme sıcaklığı veya OCT bileşiği ile doldurun ve numunenin 30 dakika ila iki saat arasında sallanmasına izin verin. Numuneleri OCT bileşiği ile doldurulmuş etiketli kriyokalıplara aktarın. Gömülü kriyobloktaki kokleanın yönünü kontrol edin. İç kulağın olduğundan emin olun; İçbükey taraf, standart koklear kesitler için kriyomoldun dar kenarlarına bakar. Daha sonra, kuru buzu küçük bir kaba koyun ve beş ila 10 mililitre dimetilbütan ekleyin. Bloğu hızlı bir şekilde dondurmak için OCT içeren kriyokalıpları ve numuneyi köpüren kuru buzun üzerine yerleştirin. Kriyoblokları eksi 20 santigrat dereceye kadar önceden soğutulmuş bir kriyostat odasına aktarın. Numunelerin 30 ila 60 dakika dengelenmesine izin verin. Bir kurşun kalem veya tükenmez kalem kullanarak, kesit alma için doğru yönlendirmeyi sağlamak için kriyoblokun koklear pozisyona karşılık gelen tarafını işaretleyin. Ardından, aynaya küçük bir OCT havuzu ekleyin ve kriyo bloğunu üzerine yerleştirin, kalem işareti olmayan geniş tarafın aşağı baktığından emin olun. OCT'yi ve numuneyi içeren mandreni soğutulmuş kriyostat odasına yerleştirin ve OCT'nin tamamen donmasına izin verin. Birkaç dakika sonra, sampile birlikte aynayı, kalem işareti sağa veya sola bakacak şekilde ayna tutucusuna yerleştirin. Bir kriyostatta, doku belirginleşene kadar 40 mikrometrelik bir ayar kullanarak bloğu kesin. Doku belirginleştikten sonra, kriyoseksiyon için tasarlanmış slaytları kullanarak 12 mikrometrelik bir kesit elde edin. Mikroskop altında kesit konumunu kontrol edin. Koklear dönüşler yaklaşıyorsa, tüm koklear dönüşler bölümlere ayrılana kadar konumu periyodik olarak kontrol ederek 12 mikrometrelik bölümleri toplamaya devam edin.