Fare Akciğerinden Canlı Miyeloid ve Epitel Hücre Popülasyonlarının İzolasyonu

Viral enfeksiyon sonrası akciğer onarımını inceliyoruz. İmmün hücrelerin epitel onarımına aracılık ettiği mekanizmaları ve viral yaralanma ve müteakip onarımdan sonra yeniden şekillenmenin gelecekteki hastalık patolojilerini nasıl etkileyebileceğini anlamayı amaçlıyoruz. Bu protokol, epitelyal ve stromal hücreler veya bağışıklık hücreleri için optimize edilmiş akciğer sindirimlerinin uyumsuzluğunu ele alır.

Araştırmamız, canlı hücrelerin hem immün hem de immün olmayan bölmelerden izole edilmesini gerektiriyor. Ayrıca, epitel ve makrofaj alt kümeleri için alana fayda sağlayacağını umduğumuz bir geçit stratejisi ortaya koyduk. Laboratuvarımız, kararlı durum koşulları altında ve çevresel zorluklara yanıt olarak solunum yollarındaki bağışıklık ve epitel hücreleri arasındaki karışmayı araştırır.

Nihai hedefimiz, doku onarımını geliştirmek ve hastalık gelişimini önlemek için bu iletişimi en iyi nasıl modüle edeceğimizi belirlemektir. Başlamak için fareye %70 etanol püskürtün. İnce cerrahi makas ve yedi numaralı forseps kullanarak karın içine bir kesi yapın ve peritondan yanal olarak kesin.

Vakumu serbest bırakmak için diyaframda küçük bir kesik yapın. Ardından, akciğerleri ve kalbi ortaya çıkarmak için diyaframı ve alt göğüs kafesini vücut boşluğundan kesin. 27 gauge iğne ile donatılmış 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak, DPBS'de akciğerleri beş mililitre iki milimolar EDTA ile perfüze edin.

Göğüs kafesini açmak ve trakeayı ortaya çıkarmak için sternumdan ve yanlardan dikey olarak kesin. Trakeayı veya akciğerleri delmeden mümkün olduğunca fazla kas ve bağ dokusunu çıkarmak için ince makas ve yedi numaralı forseps kullanın. Daha sonra, trakeayı 2/0 dikişle sarın, bağlayacak gibi konumlandırın, ancak sıkmayın.

Trakeada lateral bir çentik yapın ve kateteri yerleştirin. Ardından, kateteri yerine sabitlemek için dikişi sıkıca çekin. Bir şırınga kullanarak akciğerleri bir mililitre DPBS ile şişirin.

Ardından, DPBS'yi çıkarmak için şırıngayı yavaşça geri çekin. Akciğerleri aynı DPBS ile yeniden şişirin ve bronkoalveoler lavaj sıvısını veya BAL'ı toplamak için şırıngayı tekrar geri çekin. Kateteri takılı bırakırken şırıngayı kateterden çıkarın.

Toplanan valfi bir mikro santrifüj tüpüne dağıtın. Daha sonra, aynı bir mililitrelik şırıngayı bir mililitre dispas ile doldurun. Şırıngayı katetere takın ve akciğerleri dispas ile şişirin.

Kateteri çıkarırken, dispas sızıntısını önlemek için trakea etrafındaki dikişi sıkın. Makas kullanarak trakeadan yanal olarak kesin. Akciğerleri ve trakeayı yukarı doğru çekerken göğüs kafesinin arkasındaki bağ dokusunu keserek akciğerleri vücut boşluğundan çıkarın.

Ardından, kalbi akciğerlerden çıkarın. Akciğerleri buz üzerinde beş mililitre DPBS'ye yerleştirin. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 400 G'de santrifüj valfi.

Bir pipet ile süpernatanı aspire edin ve peleti 100 mikrolitre RPM'de yeniden süspanse edin. Başlamak için, fareden alınan akciğerlerin beş lobunu inceleyin ve bağ dokusunu atın. Disseke akciğer dokusunu bir cam slayt üzerinde bir dakika boyunca makasla doğrayın.

Diseksiyon makası kullanarak, doğranmış akciğer dokusunu 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, üç mililitre sindirim karışımı ekleyin ve akciğer sindirim karışımını iki ila üç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Son olarak, RPM'de yeniden süspanse edilen BAL'dan geri kazanılan hücre peletini ekleyin.

Tüpü 45 dakika boyunca 37 santigrat derecede 140 RPM'ye ayarlanmış bir yörünge çalkalayıcıya 40 derecelik bir açıyla yerleştirin. İnkübasyondan sonra, tüpü çalkalayıcıdan çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin. Akciğer sindirim karışımını beş ila altı kez yukarı ve aşağı pipetleyin.

Karışımı 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirerek 50 mililitrelik yeni bir tüpe süzün. Kalan hücreleri filtreden yıkayın ve enzimleri RPMI ortamında 10 mililitre% 5 FBS ile nötralize edin. Numuneyi 600 G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin.

Bir vakum aspiratörü kullanarak süpernatanı aspire edin. Hücre peletini bir mililitre ACK lizis tamponunda yeniden süspanse edin ve kırmızı kan hücrelerini parçalamak için oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin. Ardından, dokuz mililitre PBS ekleyin ve çözeltiyi karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.

Yine, numuneyi santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarmak için bir vakum aspiratörü kullanın, ardından hücre peletini bir mililitre floresanla aktive edilen hücre sıralama tamponunda yeniden süspanse edin. Akış sitometrisi analizi için süspansiyonu 64 mikrometrelik bir ağdan bir mikrosantrifüj tüpüne süzün.