İnsan Monositinden Türetilmiş Makrofajların İn vitro Tahliller için Yeniden Programlanması

Araştırmamız, monosit ve makrofaj soyunu araştırdı, olağanüstü plastisitesini ve iltihaplanma, doku onarımı ve enfeksiyonlar sırasında efektör tepkisini şekillendirmek için çevreden gelen çoklu sinyalleri entegre etme yeteneğini vurguladı. Makrofaj vücudun her yerinde bulunur ve korunan ve bağışıklık aracılı patolojiyi etkileyen doğuştan gelen ve uyarlanmış bağışıklığın başlatılmasını ve çözülmesini koordine eder. Makrofajın yeniden programlanması bu alandaki en umut verici özelliktir.

Ortaya çıkan omik teknolojisi, makrofaj biyolojisi anlayışımızda devrim yaratarak fenotipik çeşitlilikleri, fonksiyonel özellikleri, programlama potansiyelleri ve bu hücrelerin gelişimsel kökeni hakkında fikir verdi. Makrofaj farklılaşmasını ve polarizasyonunu keşfetmenin önündeki ana engel ve tuzak, literatürdeki heterojen deneysel koşullar ve protokoller ve makrofaj teriminin tanımlanmasında fikir birliği olmamasıdır. İlaç ve lipid mediatörünün makrofaj polarizasyonu üzerindeki yeniden programlama etkisini gösteriyoruz ve makrofaj ve glioblastoma hücreleri arasındaki etkileşimin 3 boyutlu in vitro modelini geliştiriyoruz.

Ek olarak, trombositlerin monosit kaynaklı makrofaj farklılaşmasını N1 fenotipine lisansladığını gösterdik. Başlamak için, antikoagüle periferik kan örneklerini bir santrifüje yerleştirin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 200G'ye döndürün.

Üstte trombositten zengin plazmanın ve altta kırmızı ve beyaz kan hücreleri de dahil olmak üzere hücresel fraksiyonun ayrılmasını gözlemleyin. İlk santrifüjlemeden elde edilen hücresel fraksiyonu, oda sıcaklığına önceden ısıtılmış steril PBS ile seyreltin. Ficoll-Hypaque yoğunluk gradyan santrifüjüne devam etmeden önce çözeltiyi nazikçe homojenize edin.

15 mililitre Ficoll-Hypaque'ı 15 mililitrelik steril bir tüpe aktarın. Ficoll'un üzerine dikkatlice ve yavaşça 30 mililitre seyreltilmiş kan ekleyin ve fazlar arasında minimum karışım sağlayın. Ficoll ve seyreltilmiş kan içeren tüpü 600G'de oda sıcaklığında 25 dakika santrifüjleyin.

Steril üç mililitrelik bir Pasteur pipeti ile sarı üst tabakanın bir kısmını çıkarın. Sarı tabaka ile Ficoll tabakası arasındaki arayüzü steril bir Pasteur pipeti ile dikkatlice toplayın. Toplanan periferik kan mononükleer hücrelerini veya PBMC'leri en az üç mililitre steril PBS içeren yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın.

Toplam 12 ila 15 mililitre hacme ulaşmak için tüpü steril PBS ile doldurun. Daha sonra numuneyi 600G'de 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, PBMC süspansiyonunu 300G'de 8 ila 10 santigrat derecede beş dakika döndürün.

Hücreleri% 2 FBS ile istenen steril soğuk PBS hacminde yeniden süspanse edin. Bir sonraki adıma kadar hücreleri 4 santigrat derecede tutun. İstenilen hacimde PBMC süspansiyonunu beş mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.

Daha sonra her 100 mikrolitre hücre süspansiyonu için 10 mikrolitre pozitif seçim kokteyli ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe etmeden önce süspansiyonu iyice karıştırın. Daha sonra, 100 mikrolitre hücre süspansiyonu başına 10 mikrolitre manyetik nanopartikül pipetleyin.

Manyetik nanopartiküllerin düzgün bir şekilde süspansiyonunu sağlamak için beş defadan fazla kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyin. Oda sıcaklığında 10 dakikalık bir inkübasyondan sonra, toplam hacmi 2,5 mililitreye çıkarmak için süspansiyona FBS ve EDTA içeren PBS ekleyin. Hücreleri iki ila üç kez nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin.

Tüpü mıknatıs sıralayıcıya yerleştirin ve beş dakika boyunca rahatsız edilmeden durmasına izin verin. Mıknatısı tüple birlikte tek bir sürekli hareketle ters çevirin. Mıknatısı ve tüpü dik konuma getirmeden önce iki ila üç saniye ters çevirin.

Tüpü mıknatıstan çıkarın ve ardından tüpe tekrar 2,5 mililitre PBS-FBS-EDTA tamponu ekleyin. Karıştırmak için hücre süspansiyonunu iki ila üç kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin. Tüpü tekrar mıknatısa yerleştirin ve beş dakika boyunca ayırın.

Tek bir sürekli hareketle, süpernatant fraksiyonu atarak mıknatısı ve tüpü tekrar ters çevirin. Tüpü mıknatıstan çıkarın ve hücreleri EDTA olmadan uygun bir PBS-FBS hacminde yeniden askıya alın. Pozitif olarak seçilen hücreler artık kullanıma hazırdır.

Şimdi sıralanmış CD14 hücrelerine PBS-FBS tamponu ekleyin ve kalan EDTA'yı seyreltmek için toplam hacmi 12 ila 14 mililitre yapın. 600G'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, pozitif olarak seçilmiş CD14 monositlerini iki mililitre PBS-FBS tamponunda yeniden süspanse edin.

Otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. Kültür hazırlanana kadar hücreleri buz üzerinde tutun. Kültürleme için, peleti takviye edilmiş RPMI 1640 ortamında mililitre başına bir milyon hücre konsantrasyonunda yeniden süspanse edin.

Hazırlanan hücre süspansiyonunun 250 mikrolitresini 48 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna pipetleyin. Her oyuğa mililitre başına 50 nanogram makrofaj koloni uyarıcı faktör içeren 250 mikrolitre antibiyotik takviyeli RPMI ortamı ekleyin. Makrofaj farklılaşmasını başlatmak için hücre kültürü plakasını nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.

Makrofaj farklılaşmasının dördüncü gününde, her kuyucuktan kültür ortamının yarısını değiştirin. İstenilen polarizasyon koşulları için sitokinler veya reaktifler ekleyin ve üç gün daha kültürlemeye devam edin. Fenotipik karakterizasyon için makrofaj türevli monositleri yedinci günde hasat edin.

İnterferon gama artı lipopolisakkarit tarafından indüklenen M1 makrofajları, en yüksek CD64 ekspresyonu, CD206 yokluğu ve düşük CD163 ve MERTK seviyeleri sergiledi. İnterlökin 4 tarafından indüklenen M2a makrofajları, artmış CD206 ekspresyonu ve azalmış CD64, CD163 ve MERTK seviyeleri ile karakterize edildi. İnterlökin 10 veya deksametazon tarafından indüklenen M2c makrofajları, artmış CD163 ve CD14 ekspresyonu, orta seviyelerde CD64 ve MERTK ekspresyonunda bir artış sergiledi.