Açık Kaynak Damlacık Mikroakışkanları ile Plazmid Stabilite Analizi
December 27th, 2024
Bakterilerde plazmit retansiyonunun paralelleştirilmiş analizi için erişilebilir, açık kaynaklı bir mikroakışkan iş akışı sunulmaktadır. Jel mikro damlacıklar içindeki tek hücreli mikrokolonilerde plazmit varlığını ölçmek için floresan mikroskobu kullanan bu yöntem, geleneksel plaka sayımına kesin, erişilebilir ve ölçeklenebilir bir alternatif sunar.
Hücre popülasyonu çeşitliliğini ve hücre-hücre etkileşimlerini incelemek için yüksek verimli mikrofilik IC yöntemleri geliştiriyoruz. Bu bağlamda, jel mikro damlacıklar, hapsolmuş hücrelerde yüksek derecede felçli bir şekilde lizis boyama DNA manipülasyonu ve mikroskopi gibi yararlı protokol adımlarını gerçekleştirmemizi sağlar. Damlacık mikrofilik iş akışları, ultra yüksek verim ve çok yönlülük ile bilinir, ancak benimseme genellikle üst düzey enstrümantasyon ve özel uzmanlık ihtiyacı ile sınırlıdır.
Protokolümüz, floresan boyama ve erişilebilir bir açık kaynaklı mikroskopi iş akışı ile yüksek verimli, tek hücreli analiz kullanarak geleneksel teknikleri geliştirir. Mini hücreleri ve mikro kolonileri aynı anda analiz etmek için mikroakışkanlar aracılığıyla hücreleri jel mikro damlacıklar halinde kapsüller. Yığın ve plaka kültürleri özgüllük ve çözünürlükten yoksun olsa da, bu yöntem çeşitli fenomenlerin kesin ve temsili istatistiklerini jelleştirir.
Protokollerimiz, damlacık mikroakışkanlarını, floresan mikroskobunu ve açık kaynaklı donanımı etiket tabanlı bir yöntemde birleştirir. Bu yaklaşım, tek hücre analizini daha esnek ve uygun maliyetli hale getirerek, bilim camiasının mikrobiyal topluluklarla ilgili karmaşık bilimsel soruları ele almasını sağlar. Başlamak için, ultra düşük jelleşme sıcaklığındaki agarozu Luria Bertani'de veya LB suyunda %2 ila 90 santigrat derece arasında ısıtın.
Karışımı sıcaklık kontrollü bir çalkalayıcıda 10 dakika çalkalayın, ardından agaroz çözeltisini soğutmak için termo çalkalayıcının sıcaklığını 39 santigrat dereceye düşürün. Escherichia coli süspansiyon tüpünü 39 santigrat dereceye kadar ısıtmak için dört dakika termo çalkalayıcıya yerleştirin. Bakteri süspansiyonunu ve agaroz çözeltisini bire bir oranında karıştırın ve 3.1 kez 10 üzeri mililitre başına altı hücrenin gücünde bir hücre süspansiyonu ile% 1'lik bir agaroz konsantrasyonu elde edin.
Bire bir oranında LB ve agaroz süspansiyonu kullanarak kontaminasyon izleme için negatif kontrol solüsyonunu hazırlayın. Gaz basıncı sürücüleri ve akış sensörleri dahil olmak üzere eksiksiz açık kaynaklı akış platformunu edinin. Agaroz hücre numunesinin çipe girerken sıcaklığını kontrol etmek için kuruluma bir cam sürgü ve pipet ucu ısıtıcıları ekleyin.
Ardından, mikroakışkan çipi flaşla geliştirilmiş mikroskopi aşamasına yerleştirin ve damlacık oluşturma bağlantısının görünür olduğundan emin olun. Kontrol yazılımı arayüzünü kullanarak pipet ucu ısıtıcısını ve cam sürgü ısıtıcısını 40 santigrat dereceye ayarlayın. Borulu bir şırınga ve bir PDMS tapası kullanarak, %1 agaroz hücre süspansiyon karışımını 200 mikrolitrelik bir pipet ucuna yükleyin.
Ucu uç ısıtıcıya yerleştirin ve mikroakışkan çipteki sulu fazın girişine yerleştirin. Ucun PDMS contasını akış kontrol sistemi borusuna bağlı olanla değiştirin. Ardından, yağ borusunu ikinci girişe ve çıkış borusu ucunu bir atık borusuna yerleştirin.
Ardından, kullanıcı arayüzündeki kabul ve yağ fazları için basıncı 80 milibara ayarlayın ve hücre süspansiyonu ve yağının infüzyonunu başlatın. Yağ fazını 320 milibara ve kabul fazını 180 milibara ayarlayın. Damlacık oluşumunun stabilizasyonu için bir dakika bekleyin.
Damlacık oluşumu stabilize olduğunda, çıkış borusunu atık tüpünden toplama tüpüne aktarın. Numune haznesi boşalana kadar buz üzerindeki damlacıkları toplamaya devam edin. Topladıktan sonra, agaroz jelin damlacıkların içine girmesine izin vermek için tüpleri bir saat boyunca dört santigrat dereceye yerleştirin.
Bakteri içeren jel mikro damlacıklarını ve negatif kontrol damlacıklarını koloni büyümesi için dört saat veya gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, jel mikro damlacık emülsiyonunun tabanından mümkün olduğunca fazla yağı dikkatlice çıkarmak için 21 gauge iğneli üç mililitrelik bir şırınga kullanın. 50 mikrolitre jel mikro damlacıklarını yeni bir mikrotüpe aktarın ve daha fazla damlacık analizi için dört santigrat derecede saklayın, kalan emülsiyona eşit bir hacimde PFO ile bire bir florlu yağ karışımı ekleyin.
Daha sonra, emülsiyonun üzerine yaklaşık 200 mikrolitre% 0.9 sodyum klorür tamponu ekleyin. Karışımı girdaplayın ve sabit hızlı bir santrifüjde kısa bir süre döndürün. Yağ fazını sıvı arayüzünün altından dikkatlice çıkarın ve üstten 100 mikrolitre sodyum klorür çözeltisini atın.
İki mikrolitre jel mikro damlacığı bir görüntüleme odası slaytına aktarın ve optimum görüntüleme için tek katmanlı bir damlacık oluşturmaya yardımcı olmak için beş mikrolitre florlu yağ ekleyin. Mikroskopta, parlak alan görüntüleme için üstten beyaz LED matris aydınlatmasını etkinleştirin. Hazırlanan slaydı monte edin.
Tek katmanlı damlacıkları bulmak ve parlak alanlı bir görüntü yakalamak için örneğe odaklanın. Ardından, filtre tekerleğini yeşil dalga boyu filtresiyle hizalanacak şekilde ayarlayın. Uyarma için 470 nanometre LED'e geçin ve numuneyi hareket ettirmeden kolonilerin floresan bir görüntüsünü yakalayın.
Probidyum iyodür lekeli mikro jellerin iki mikrolitresini bir görüntüleme odası çipine aktarın ve tek katmanlı bir mikro jel oluşturmak için beş mikrolitre% 0.9 sodyum klorür çözeltisi ekleyin. Görüntüleme sırasında buharlaşmayı önlemek için çipin giriş ve çıkışını kapatın. Promidyum iyodür görüntüleme için kırmızı dalga boyu aralığı filtresini ayarlayın ve parlak alan ve flüoresan görüntüleri yakalayın.
Jel mikrodamlacıklardaki hücre kapsüllemesi, farklı kapsüllenmiş hücrelere sahip tek tip damlacıkları gösteren parlak alan mikroskobu ile doğrulandı. Plazmid kodlu floresan kaybeden koloniler, floresan oranı analizi kullanılarak tanımlandı. Analiz edilen 2.785 koloniden 100'ü floresan kaybetti ve bu da %3.6'lık bir plazmit kaybı oranına işaret etti
Genel Bakış
Bu çalışma, bakterilerde plazmit tutulumunu analiz etmek için floresan mikroskopi kullanarak açık kaynaklı bir mikroakışkan iş akışını sunar. Yöntem, jel mikrodamlacıklar içinde kapsüllenmiş tek hücreli mikrokolonilerde plazmit varlığını kesin olarak kantitize etmeyi sağlayarak, geleneksel plaka sayımına ölçeklenebilir bir alternatif sunar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikroakışkanlar
- Hücre biyolojisi
- Floresan mikroskopi
Arka Plan
- Mikroakışkan teknikler, hücre popülasyonlarının yüksek verimli analizini sağlar.
- Geleneksel yöntemler genellikle özgüllük ve çözünürlükten yoksundur.
- Jel mikrodamlacıklar, tek hücre analizi için çok yönlü bir platform sağlar.
- Açık kaynak yaklaşımlar, gelişmiş metodolojileri kullanılabilir hale getirebilir.
Çalışmanın Amacı
- Bakteriyel plazmit tutulumunu incelemek için yüksek verimli bir yöntem geliştirmek.
- Tek hücre analiz tekniklerinin erişilebilirliğini ve uygunluğunu artırmak.
- Geleneksel kültür yöntemlerine ölçeklenebilir bir alternatif sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Bakteryal hücreler içeren agaroz jel mikrodamlacıklar hazırlanması.
- Damla üretimi ve manipülasyonu için mikroakışkanların kullanımı.
- Plazmit tutulumunu görüntülemek ve kantitize etmek için floresan mikroskopi.
- Plazmit kaybı oranlarını belirlemek için koloni floresansının analizi.
Ana Sonuçlar
- Hücrelerin jel mikrodamlacıklar içinde kapsüllenmesinin parlak alan mikroskopi ile doğrulanması.
- Analiz edilen koloniler arasında %3,6 plazmit kaybı oranının belirlenmesi.
- Yüksek verimli analiz için açık kaynak iş akışının etkinliğinin gösterilmesi.
- Çeşitli bakteri popülasyonlarında plazmit tutulumuna ilişkin kesin istatistiklerin sağlanması.
Sonuçlar
- Geliştirilen yöntem, mikrobiyal toplulukların çalışmasını geliştirir.
- Tek hücre analizi için esnek ve uygun maliyetli bir yaklaşım sunar.
- Bu iş akışı, farklı uzmanlık seviyelerinde araştırmacılar tarafından benimsenebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Plasmid stability is a critical parameter in synthetic biology and microbial engineering, directly impacting the reliability of engineered strains in biopharma R&D. High-throughput, quantitative analysis of plasmid retention without antibiotic selection enables robust target validation and de-risks early discovery workflows. Open-source droplet microfluidics democratizes access to advanced single-cell analytics, supporting scalable portfolio decisions and translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of plasmid stability in engineered microbial populations.
- Supports functional validation of genetic constructs under selection-free conditions.
- Provides high-resolution data for mechanistic de-risking of synthetic circuits.
- Facilitates predictive confidence in strain performance for downstream applications.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microbial systems for high-throughput screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs for assay standardization.
- Enables parallel analysis of thousands of microcolonies, increasing statistical power.
- Supports scalable and reusable assay platforms for diverse genetic constructs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microbial system stability with translational biomarker strategies when relevant.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by quantifying genetic retention.
- Reduces risk of late-stage failure due to plasmid instability in engineered strains.
- Provides mechanistic insights for predictive de-risking in translational workflows.
Pipeline & Workflow Integration
This open-source microfluidic workflow integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling robust single-cell analytics from early target validation through assay development and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying plasmid retention at single-cell resolution.
- Screening: Delivers reproducible, high-throughput assay outputs for reliable compound or construct evaluation.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence-based measurements to compare genetic stability across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by ensuring engineered strain fidelity.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, open-source platform adaptable to various genetic and microbial systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in engineered strain validation.
- Operational Value: Standardizes and scales single-cell analysis with accessible instrumentation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust genetic stability data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial engineering projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, fluorescence microscopy, and microbial genetics.
- Needs open-source hardware for precise flow and temperature control.
- Demands cross-team standardization for reproducible data integration.
- Adaptable to various microbial models and genetic constructs with minimal modification.
- Limited by the need for fluorescence-based readouts and compatible imaging infrastructure.
