Açık Kaynak Damlacık Mikroakışkanları ile Plazmid Stabilite Analizi

Hücre popülasyonu çeşitliliğini ve hücre-hücre etkileşimlerini incelemek için yüksek verimli mikrofilik IC yöntemleri geliştiriyoruz. Bu bağlamda, jel mikro damlacıklar, hapsolmuş hücrelerde yüksek derecede felçli bir şekilde lizis boyama DNA manipülasyonu ve mikroskopi gibi yararlı protokol adımlarını gerçekleştirmemizi sağlar. Damlacık mikrofilik iş akışları, ultra yüksek verim ve çok yönlülük ile bilinir, ancak benimseme genellikle üst düzey enstrümantasyon ve özel uzmanlık ihtiyacı ile sınırlıdır.

Protokolümüz, floresan boyama ve erişilebilir bir açık kaynaklı mikroskopi iş akışı ile yüksek verimli, tek hücreli analiz kullanarak geleneksel teknikleri geliştirir. Mini hücreleri ve mikro kolonileri aynı anda analiz etmek için mikroakışkanlar aracılığıyla hücreleri jel mikro damlacıklar halinde kapsüller. Yığın ve plaka kültürleri özgüllük ve çözünürlükten yoksun olsa da, bu yöntem çeşitli fenomenlerin kesin ve temsili istatistiklerini jelleştirir.

Protokollerimiz, damlacık mikroakışkanlarını, floresan mikroskobunu ve açık kaynaklı donanımı etiket tabanlı bir yöntemde birleştirir. Bu yaklaşım, tek hücre analizini daha esnek ve uygun maliyetli hale getirerek, bilim camiasının mikrobiyal topluluklarla ilgili karmaşık bilimsel soruları ele almasını sağlar. Başlamak için, ultra düşük jelleşme sıcaklığındaki agarozu Luria Bertani'de veya LB suyunda %2 ila 90 santigrat derece arasında ısıtın.

Karışımı sıcaklık kontrollü bir çalkalayıcıda 10 dakika çalkalayın, ardından agaroz çözeltisini soğutmak için termo çalkalayıcının sıcaklığını 39 santigrat dereceye düşürün. Escherichia coli süspansiyon tüpünü 39 santigrat dereceye kadar ısıtmak için dört dakika termo çalkalayıcıya yerleştirin. Bakteri süspansiyonunu ve agaroz çözeltisini bire bir oranında karıştırın ve 3.1 kez 10 üzeri mililitre başına altı hücrenin gücünde bir hücre süspansiyonu ile% 1'lik bir agaroz konsantrasyonu elde edin.

Bire bir oranında LB ve agaroz süspansiyonu kullanarak kontaminasyon izleme için negatif kontrol solüsyonunu hazırlayın. Gaz basıncı sürücüleri ve akış sensörleri dahil olmak üzere eksiksiz açık kaynaklı akış platformunu edinin. Agaroz hücre numunesinin çipe girerken sıcaklığını kontrol etmek için kuruluma bir cam sürgü ve pipet ucu ısıtıcıları ekleyin.

Ardından, mikroakışkan çipi flaşla geliştirilmiş mikroskopi aşamasına yerleştirin ve damlacık oluşturma bağlantısının görünür olduğundan emin olun. Kontrol yazılımı arayüzünü kullanarak pipet ucu ısıtıcısını ve cam sürgü ısıtıcısını 40 santigrat dereceye ayarlayın. Borulu bir şırınga ve bir PDMS tapası kullanarak, %1 agaroz hücre süspansiyon karışımını 200 mikrolitrelik bir pipet ucuna yükleyin.

Ucu uç ısıtıcıya yerleştirin ve mikroakışkan çipteki sulu fazın girişine yerleştirin. Ucun PDMS contasını akış kontrol sistemi borusuna bağlı olanla değiştirin. Ardından, yağ borusunu ikinci girişe ve çıkış borusu ucunu bir atık borusuna yerleştirin.

Ardından, kullanıcı arayüzündeki kabul ve yağ fazları için basıncı 80 milibara ayarlayın ve hücre süspansiyonu ve yağının infüzyonunu başlatın. Yağ fazını 320 milibara ve kabul fazını 180 milibara ayarlayın. Damlacık oluşumunun stabilizasyonu için bir dakika bekleyin.

Damlacık oluşumu stabilize olduğunda, çıkış borusunu atık tüpünden toplama tüpüne aktarın. Numune haznesi boşalana kadar buz üzerindeki damlacıkları toplamaya devam edin. Topladıktan sonra, agaroz jelin damlacıkların içine girmesine izin vermek için tüpleri bir saat boyunca dört santigrat dereceye yerleştirin.

Bakteri içeren jel mikro damlacıklarını ve negatif kontrol damlacıklarını koloni büyümesi için dört saat veya gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, jel mikro damlacık emülsiyonunun tabanından mümkün olduğunca fazla yağı dikkatlice çıkarmak için 21 gauge iğneli üç mililitrelik bir şırınga kullanın. 50 mikrolitre jel mikro damlacıklarını yeni bir mikrotüpe aktarın ve daha fazla damlacık analizi için dört santigrat derecede saklayın, kalan emülsiyona eşit bir hacimde PFO ile bire bir florlu yağ karışımı ekleyin.

Daha sonra, emülsiyonun üzerine yaklaşık 200 mikrolitre% 0.9 sodyum klorür tamponu ekleyin. Karışımı girdaplayın ve sabit hızlı bir santrifüjde kısa bir süre döndürün. Yağ fazını sıvı arayüzünün altından dikkatlice çıkarın ve üstten 100 mikrolitre sodyum klorür çözeltisini atın.

İki mikrolitre jel mikro damlacığı bir görüntüleme odası slaytına aktarın ve optimum görüntüleme için tek katmanlı bir damlacık oluşturmaya yardımcı olmak için beş mikrolitre florlu yağ ekleyin. Mikroskopta, parlak alan görüntüleme için üstten beyaz LED matris aydınlatmasını etkinleştirin. Hazırlanan slaydı monte edin.

Tek katmanlı damlacıkları bulmak ve parlak alanlı bir görüntü yakalamak için örneğe odaklanın. Ardından, filtre tekerleğini yeşil dalga boyu filtresiyle hizalanacak şekilde ayarlayın. Uyarma için 470 nanometre LED'e geçin ve numuneyi hareket ettirmeden kolonilerin floresan bir görüntüsünü yakalayın.

Probidyum iyodür lekeli mikro jellerin iki mikrolitresini bir görüntüleme odası çipine aktarın ve tek katmanlı bir mikro jel oluşturmak için beş mikrolitre% 0.9 sodyum klorür çözeltisi ekleyin. Görüntüleme sırasında buharlaşmayı önlemek için çipin giriş ve çıkışını kapatın. Promidyum iyodür görüntüleme için kırmızı dalga boyu aralığı filtresini ayarlayın ve parlak alan ve flüoresan görüntüleri yakalayın.

Jel mikrodamlacıklardaki hücre kapsüllemesi, farklı kapsüllenmiş hücrelere sahip tek tip damlacıkları gösteren parlak alan mikroskobu ile doğrulandı. Plazmid kodlu floresan kaybeden koloniler, floresan oranı analizi kullanılarak tanımlandı. Analiz edilen 2.785 koloniden 100'ü floresan kaybetti ve bu da %3.6'lık bir plazmit kaybı oranına işaret etti