Hücre Duvarı ve Hücre Zarı Proteinlerinin Aşağı Akış Protein Analizi için Mycobacterium tuberculosis'ten Ayrılması ve Fraksiyonlanması

Araştırmamız, Mycobacterium tuberculosis'in çözünmeyen hücre duvarı ve hücre zarı proteinlerini doğrudan proteomik ve immünolojik testler için basit fraksiyonlara ayırmak için modern bir yöntem geliştirmeye odaklandı. Elektroforetik tekniklerdeki ilerlemeler artık karmaşık proteinlerin daha az protein fraksiyonuna ayrılmasına izin vererek, fonksiyonel proteomik ve immünolojik uygulamalar için verimli kütle spesifikasyonuna dayalı izolasyonu kolaylaştırır. Temel zorluklar arasında, yüz miligramın üzerinde çökelen hidrofobik proteinin zayıf çözünürlüğü ve enzim aktivite analizleri gibi doğal doğrulama gerektiren aşağı akış uygulamasını engelleyen SDS-PAGE kaynaklı denatürasyon yer alır.

Mevcut hiçbir protokol, çözünmeyen hidrofobik hücre duvarı ve hücre zarı proteinlerini, işlevi anlamanın ve müdahaleleri yönlendirmenin anahtarı olan doğrudan proteomik ve immünolojik analiz için tanımlanmış suda çözünür fraksiyonlara sistematik olarak ayırmaz. Gelecekteki araştırmalarımız, daha iyi hastalık kontrolünü desteklemek amacıyla erken, doğru bir TB tespiti için T hücresi antijen bazlı teşhisler geliştirmeye ve bunların TB popülasyonundaki duyarlılığını, özgüllüğünü ve performansını değerlendirmeye odaklanacaktır. Başlamak için, Mycobacterium tuberculosis basilinin tüm hücre lizatından hücre duvarı, hücre zarı ve sitozolik protein örneklerini alın.

Hücre duvarı ve hücre zarı proteinlerini izoelektrik odaklama tamponunda çözündürün. Bir ila dört oranında 3 ila 10 ve 4 ila 6 pH aralıkları arasında %2 amfolit ekleyin. Şimdi çözündürülmüş proteinleri, bir soğutma suyu banyosu ile dört santigrat derecede tutulan sıvı izoelektrik odaklama sisteminde parçalara ayırın.

Üreticinin talimatlarını izleyerek 12 watt'lık sabit bir güç uygulayarak izoelektrik odaklı ayırma işlemini gerçekleştirin. Bireysel izoelektrik odaklı fraksiyonları bir vakum pompasıyla toplayın. Her fraksiyonun pH değerlerini belirleyin.

Ayrılan fraksiyonların 50 mikrogramını SDS-PAGE'e tabi tutun ve Coomassie Brilliant Blue veya gümüş boyama kullanarak proteinleri görselleştirin. IEF ile ayrılmış hücre duvarı ve hücre zarı fraksiyonlarını SDS jel elektroforez numune tamponu ile karıştırarak başlayın. Karışımı 95 santigrat derecede beş dakika ısıtın.

%12,5 çözücü jel ve %4 istifleme jeli içeren 16 x 20 santimetre poliakrilamid jeller kullanarak ikinci boyuttaki protein fraksiyonlarını ayırın. Ardından, numuneyi jele yüklemek için 13 santimetre uzunluğunda tek bir numune kuyusu kullanın. Boya cephesi jelin dibine ulaşana kadar jel başına 50 miliamperlik sabit bir akımda elektroforez gerçekleştirin.

Elektroforezden sonra, jeli elüsyon tamponunda 10 dakika dengeleyin. Jeli, cihaz üreticisinin talimatlarına göre bütün bir jel elüter aparatına aktarın. Proteinleri jelden ayrıştırmak için elüteri bir saat boyunca 250 miliamperlik sabit bir akımda çalıştırın, ardından jelden her biri üç mililitre olan yaklaşık 30 protein fraksiyonunu toplamak için bir vakum pompası kullanın.

Bisinkoninik asit protein tahlilini kullanarak ayrıştırılan fraksiyonlardaki protein konsantrasyonunu ölçün. Ayrıştırılan protein fraksiyonlarının 10 mikrogramını SDS-PAGE analizine tabi tutun ve bantları Coomassie Brilliant Blue boyama ile görselleştirin. Mycobacterium tuberculosis'in ilk süpernatant: hücre duvarı, hücre zarı ve sitozol fraksiyonlarında farklı protein bantlama paternleri gözlendi ve başarılı hücre altı fraksiyonasyonu doğrulandı.

Hücre duvarı proteinlerinin izoelektrik odaklanması, pH'ı 2.5'in altında olan fraksiyonlarda en yüksek protein konsantrasyonunu gösterdi. Hücre duvarı IEF fraksiyonlarının SDS-PAGE'si, ağırlıklı olarak Fraksiyon 1 ila 8'de olmak üzere farklı protein bantları ortaya çıkardı. IEF ile hücre zarı protein ayrımı, pH 4 ile pH 10 arasında ana protein konsantrasyonu zirvelerini ortaya çıkardı ve en yüksek konsantrasyon pH 10 civarında meydana geldi.

Hücre zarı IEF fraksiyonlarının SDS-PAGE'si, Fraksiyon 1 ila 9'da daha net bantlara sahip çeşitli protein profilleri gösterdi. IEF ile çözülmüş hücre duvarı proteinlerinin hazırlayıcı SDS-PAGE ayrımı, ağırlıklı olarak mililitrede 100 mikrogramın altında fraksiyonlar üretti. Ayrıştırılan hücre duvarı protein fraksiyonlarının SDS-PAGE'si, Fraksiyon 6 ila 10'da daha konsantre bantlarla çok çeşitli protein moleküler ağırlıkları sergiledi.

Hücre zarı protein fraksiyonlarının hazırlayıcı SDS-PAGE'si, fraksiyonların yarısından fazlasının mililitrede 50 ila 199 mikrogram arasında protein konsantrasyonlarına sahip olduğunu ortaya çıkardı. Ayrıştırılan hücre zarı protein fraksiyonlarının SDS-PAGE'si, Şerit 1 ila 8 ve 13 ila 16'da konsantre bantlar ortaya çıkardı.