Yerinde İzolasyon Çipi (iChip) Kullanılarak İnatçı Toprak Bakterilerinin İzolasyonu ve Kültürlenmesi

Zengin mikrop depoları, toprak, su kütleleri ve aşırı ortamlar gibi çeşitli doğal ortamlarda bulunur. Bununla birlikte, bu muazzam biyolojik çeşitliliğe dokunmak, laboratuvar yöntemleri ve medya ile büyük ölçüde sınırlıdır. Bu kültür engelini aşarak ve bu biyoçeşitlilikten yararlanarak, çeşitli biyoteknolojik ihtiyaçları karşılamanın yanı sıra küresel zorlukları çözme potansiyeline sahiptir.

Örneğin, anti-mikrobiyal direncin gelişimi küresel halk sağlığına ayarlanmıştır. Laboratuvarda yetiştirilmesi zor olan toprak bakterileri, anti-mikrobiyal sistemlerin küresel zorluğunun ele alınmasında değerli olabilecek güçlü anti-mikrobiyal aktiviteye sahip yeni biyoaktif bileşikler üretebilir. Çevresel mikropların muazzam çeşitliliği ve ürünleri, geleneksel laboratuvar kültürü tabanlı teknolojiler genellikle benzer bilinen mikropların izolasyonuna yol açtığından araştırılmamıştır. Bu deneyin amacı, IChip teknolojisini kullanarak inatçı toprak bakterilerinin yüksek verimli kültürünü yerinde göstermektir. Bu protokolde, yetiştirilmesi zor bakterilerin yüksek verimli yerinde yetiştirilmesi ve bu teknolojinin bir uygulaması olarak anti-mikrobiyal üreten bakterilerin geri kazanılması için kullanılabilecek bu IChip teknolojisinin yapısını ve kullanımını göstereceğiz.

[Sunucu] Başlamak için, bir sunum yazılımında izolasyon çipinin üst, alt ve orta plakalarının bir ön tasarımını oluşturun. IChip görevi görecek şekilde gerekli boyutlarda daireler eklemek için sunum yazılımındaki şekil ekle seçeneğini kullanın. IChip kanallarını temsil etmek için içine daha küçük daireler ekleyin. IChip'in üst, alt ve orta plakası için bir ön tasarım hazırlamak için daha küçük daireleri istenen desende düzenleyin. Tasarımı seçin ve ön tasarımı resim olarak kaydetmek için sağ tıklama menüsünü kullanın. Ön tasarımı şablon olarak kullanarak, bilgisayar destekli bir tasarım yazılımı kullanarak iki boyutlu bir tasarım oluşturmaya başlayın. Çizim menüsünden, IChip plakaları ve kanal alanı için temel tasarımı oluşturmak üzere önceden tanımlanmış şekiller, ağırlıklı olarak daireler ekleyin. Plakaların ve kanalların gerçek boyutlarını ayarlamak için boyut seçeneğini kullanın. Tasarımı sonlandırmak için Tamam'a tıklayın ve ardından 2B tasarımı istenen kalınlıkta bir 3B modele dönüştürmek için ekstrüzyon işlevini kullanın. Son olarak, 3B modelin bir kopyasını 3B yazdırma için uyumlu hareketsiz litografi dosya biçiminde kaydetmek için dosya menüsünü kullanın.

[Sunucu] Toprak numunesi alımı için gerekli olacak tüm temel öğeleri toplayın ve numunenin alınacağı yere ulaşın. Coğrafi kodlama mobil uygulamasını açın ve örnekleme sitesinin benzersiz üç kelimelik adresini bulun ve kaydedin. Ardından, sıcaklık, tarih, saat, örnekleme derinliği, hava durumu ve öğelere saha maruziyeti gibi ilgili örnek meta verilerini kaydedin. Bir kürek ve IChip'in dikileceği polistiren kutuya% 70 etanol püskürtün. Kağıt mendille silerek temizleyin ve etanolün tamamen kurumasını bekleyin. Ardından, üst toprağı açığa çıkarmak için yaprak çöpü veya kayalar gibi yüzey kalıntılarını temizlemek için dekontamine küreği kullanın. Küreği daha önce olduğu gibi tekrar dekontamine edin. Küreği kullanarak, toprağa üç ila altı derinlikte erişin, yerin altına alın ve yaklaşık dört ila beş kg toprağı düzgün bir derinlikten polistiren kutuya aktarın. Kutu yaklaşık% 75 dolu olmalıdır. Toplanan toprağı hemen laboratuvara geri taşıyın. Toplanan toprak örneğinden, enkaz, kaya ve yaprak çöpünden arındırılmış bir gram toprağı 10 ml steril salin içeren 50 millik steril bir santrifüj tüpüne ağırlıklandırın. Bir toprak bulamacı oluşturmak için yaklaşık 10 saniye girdap yaparken toprağı tuzlu su ile karıştırın. Tüpteki büyük toprak parçacıklarının çökelmesini sağlamak için santrifüj tüpünü beş dakika boyunca rahatsız etmeyin. Daha sonra, süpernatan toprak süspansiyonunu dikkatlice S olarak etiketlenmiş yeni bir test tüpüne aktarın. Seyreltilmemiş numune olarak toprak süspansiyonunu kullanarak, numunenin bir ml'sini taze bir tüpte dokuz ml steril salin içine aktararak sıfır seyreltme gerçekleştirin. Seyreltme hazırlayın, 10'dan eksi bire kadar eksi bir'e kadar 10'a kadar eksi beşe kadar seyreltme hazırlayın. Bir biyogüvenlik kabini içinde, IChip'in üst plakasını, alt plakasını ve orta plakasını 10 dakika boyunca %70 etanol içinde bekleterek yüzey dekontamine edin. IChip bileşenlerini steril deiyonize su ile yıkayarak fazla etanolü durulayın ve steril bir Petri kabını havayla kurutmalarına izin verin. IChip'in orta plakasını tohumlamaya hazır steril bir Petri kabına yerleştirin. SMS agar ortamını bir mikrodalgada eritin. Soğumasını bekleyin ve ardından 22.5 ml SMS agarını 45 derecede steril 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Buna, 2,5 ml uygun bir seyreltilmiş toprak numunesi ekleyin ve hava kabarcıklarının girmesini önlerken hafifçe ters çevirerek iyice karıştırın. Tüm yüzeyi kaplayan IChip'in orta plakasının üzerine tohumlanmış SMS agar ortamının yaklaşık üç ila dört ml'sini yavaşça dökün. Ardından SMS agar ortamının yaklaşık beş ila 10 dakika sertleşmesine izin verin. SMS agar ortamının ayarlanıp ayarlanmadığını kontrol edin. Daha sonra steril tıraş bıçağıyla, tek tek difüzyon odalarındaki agar tapalarını geride bırakarak IChip metal plakasının yüzeyindeki fazla SMS agarını kazıyın. Koruyucu tabakayı 0.03 mikrometre polikarbonat membran filtreden birinden çıkardıktan sonra, steril bir forseps kullanarak IChip'in üst bıçağının içine dikkatlice yerleştirin. Ardından, steril bir forseps kullanarak ekilen metal plakanın açıkta kalan tarafına başka bir 0.03 mikrometre polikarbonat membran filtre yerleştirin. IChip'in üst ve alt plakalarını, orta plakayı ve polikarbonat membranları sandviç şekilde yerleştirin ve IChip montajını tamamlamak için bu vida deliklerini tüm plakalarda hizalamaya dikkat edin. IChip aksamını sabitlemek için somunları ve cıvataları sıkıca sıkın. Steril bir kürek kullanarak polistiren kutudaki toprak toplayıcıdaki IChip'in boyutundan daha büyük bir çöküntü oluşturun. IChip düzeneğini çukurun içine dikey olarak yerleştirin ve IChip'in tüm yüzeylerinin tamamen kaplandığından emin olarak toprakla sıkıca paketleyin. Daha sonra, iki ila dört hafta arasında istenen süre boyunca kültürde yerinde izin verin. Kuluçka sırasında, difüzyon odasındaki tohumlanmış SMS agar tıkaçlarının kurumasını önlemek için toprak çevresini, ekilen IChip'i periyodik olarak nemlendirmek için steril damıtılmış su kullanın. İstenilen inkübasyondan sonra, geri kazanmak için ekilen IChip'in etrafındaki toprağı nazikçe yerinden çıkarın. Ardından, yapışan kir parçacıklarını çıkarmak için IChip'i steril tuzlu su ile yıkayın ve daha sonraki işlemler için bir biyogüvenlik kabinine aktarın. Somunları ve cıvatayı IChip aksamından sökün ve IChip'i dikkatlice sökün. Steril bir forsep kullanarak, polikarbonat membranları çıkarın ve IChip'in orta plakasını hazırlanan Petri kabına aktarın. Her bir difüzyon odasındaki ayrı agar tapalarını kurtarmak için steril ahşap aplikatör kullanın. Laboratuvar yetiştiriciliğini denemek için agar tıkaçlarını SMS agar veya 0.1X Triptik Soya Suyu Agar gibi uygun ortamlara aşılayın. Ekili izolatlar daha sonra, test cihazı suşları kullanılarak agar kaplaması gibi rutin yöntemlerle anti-mikrobiyal üretim için taranabilir. Burada, Staphylococcus aureus ATCC 29213 ve Acinetobacter baumannii B8342'ye karşı IChip agar tıkaçlarından elde edilen IC-1 ila 12 kültür için temsili tarama sonuçlarını gösteriyoruz. IC-6 ve IC-8 kültürlerinin sırasıyla gram pozitif ve gram negatif test cihazı suşlarına karşı aktivite gösterdiğini unutmayın. Alternatif olarak, yerinde koşullar altında mikro kolonilerin büyümesini doğrulamak için yerinde ekili inatçı toprak bakterileri içeren geri kazanılmış agar tıkaçlarını boyayın ve görüntüleyin. Bu yaklaşımı kullanarak, inatçı toprak bakterilerini yerinde yüksek verimli bir şekilde geri kazanmak mümkündür. 3D baskılı IChip, 156 agar tapasını barındırabilir. Bununla birlikte, IChip'in her kanalına bir bakteri hücresinin tohumlandığından emin olmak için tohumlama sırasında doğru seyreltmeyi seçmek gerekir. Gerekli bakteriler daha sonra laboratuvar koşullarında kültürlenebiliyorlarsa, metabolit üretimi, enzim üretimi, biyopolimer üretimi vb. gibi istenen biyoaktiviteler için taranabilir. Bununla birlikte, bazı bakterilerin laboratuvar koşullarında ürememesi de muhtemeldir ve bu gibi durumlarda, mikrobiyal varlığı fark etmek ve biyosentetik potansiyellerine erişmek için metagenomik yaklaşımları benimsemek zorunda kalabiliriz. Tarif edilen yöntem çok kolaydır ve küçük değişikliklerle çeşitli çevresel koşullarda mikropları biyolojik olarak araştırmak için kolayca kullanılabilir.