Name: Kas-İskelet Dokusundaki Primer Kirpiklerin ARL13B-CENTRIN-2 Fare Modeli Kullanılarak Hacimsel Görüntülenmesi ve Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Keşfedin, ARL13B-CENTRIN-2 transgenik fare modeli kullanarak kas-iskelet dokusundaki primer kirpiklerin hacimsel görüntülenmesi ve analizi yöntemini. Bu teknik, gelişimsel biyolojide hücre sinyalleşmesini ve doku morfojenezini anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Wheatley, D. N., Wang, A. M., Strugnell, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+primary+cilia+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Expression of primary cilia in mammalian cells.</a> Cell Biol Int. 20 (1), 73-81 (1996).</li>
<li>Donnelly, E., Ascenzi, M. G., Farnum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+are+highly+oriented+with+respect+to+collagen+direction+and+long+axis+of+extensor+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Primary cilia are highly oriented with respect to collagen direction and long axis of extensor tendon.</a> J Orthop Res. 28 (1), 77-82 (2010).</li>
<li>McGlashan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+loading+modulates+chondrocyte+primary+cilia+incidence+and+length%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Mechanical loading modulates chondrocyte primary cilia incidence and length.</a> Cell Biol Int. 34 (5), 441-446 (2010).</li>
<li>Farnum, C. E., Wilsman, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+primary+cilia+of+articular+chondrocytes+in+three-dimensional+space%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Orientation of primary cilia of articular chondrocytes in three-dimensional space.</a> Anat Rec. 294 (3), 533-549 (2011).</li>
<li>Coveney, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+protein+IFT88+controls+post-natal+cartilage+thickness+and+influences+development+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arth+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">The ciliary protein IFT88 controls post-natal cartilage thickness and influences development of osteoarthritis.</a> Arth Rheumatol. 74 (1), 49-59 (2021).</li>
<li>Coveney, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+IFT88+protects+coordinated+adolescent+growth+plate+ossification+from+disruptive+physiological+mechanical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Ciliary IFT88 protects coordinated adolescent growth plate ossification from disruptive physiological mechanical forces.</a> J Bone Miner Res. 37 (6), 1081-1086 (2022).</li>
<li>Andrea, C. E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+organization+reflects+polarity+in+the+growth+plate+and+implies+loss+of+polarity+and+mosaicism+in+osteochondroma%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Primary cilia organization reflects polarity in the growth plate and implies loss of polarity and mosaicism in osteochondroma.</a> Lab Invest. 90 (7), 1091-1101 (2010).</li>
<li>Ascenzi, M. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+localization%2C+length+and+orientation+of+chondrocytic+primary+cilium+on+murine+growth+plate+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">Effect of localization, length and orientation of chondrocytic primary cilium on murine growth plate organization.</a> J. Theor Biol. 285 (1), 147-155 (2011).</li>
<li>Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+specificity+of+primary+cilia+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo.</a> Nat. Cell Biol. 17 (2), 113-122 (2015).</li>
<li>Larkins, C. E., Aviles, G. D. G., East, M. P., Kahn, R. A., Caspary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arl13b+regulates+ciliogenesis+and+the+dynamic+localization+of+Shh+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Arl13b regulates ciliogenesis and the dynamic localization of Shh signaling proteins.</a> Mol Biol Cell. 22 (23), 4694-4703 (2011).</li>
<li>Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mouse+line+with+green-fluorescent+protein-labeled+Centrin+2+allows+visualization+of+the+centrosome+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells.</a> Transgenic Res. 13 (2), 155-164 (2004).</li>
<li>arivis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Application+Note+%2347+-+Applying+Cellpose+models+in+arivis+Vision4D%22">Application Note #47 - Applying Cellpose models in arivis Vision4D</a>. , 1-20 (2021).</li>
<li>Huff, J., Bergter, A., Luebbers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+Note%3A+Multiplex+mode+for+the+LSM+9+series+with+Airyscan+2%3A+fast+and+gentle+confocal+super-resolution+in+large+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Application Note: Multiplex mode for the LSM 9 series with Airyscan 2: fast and gentle confocal super-resolution in large volumes.</a> Nat Methods. , (2019).</li>
<li>Ning, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-associated+wound+repair+mediated+by+IFT88+in+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cilia-associated wound repair mediated by IFT88 in retinal pigment epithelium.</a> Sci Rep. 13 (1), 8205-8219 (2023).</li>
<li>Palla, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+on+muscle+stem+cells+are+critical+to+maintain+regenerative+capacity+and+are+lost+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Primary cilia on muscle stem cells are critical to maintain regenerative capacity and are lost during aging.</a> Nat Commun. 13 (1), 1439-1451 (2022).</li>
<li>Brewer, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+dynamic+ciliary+ARL13B+and+ADCY3+localization+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Postnatal dynamic ciliary ARL13B and ADCY3 localization in the mouse brain.</a> Cells. 13 (3), 259-277 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>22 x 50 mm Kapak Astarı</td><td>FisherScientific&nbsp;</td><td></td><td></td>12373128</tr><tr><td>arivis Vision4D yazılımı</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Görüntü analiz yazılımı&nbsp;</td></tr><tr><td>Konfokal lazer tarama mikroskobu&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 980 Airyscan 2</td><td></td></tr><tr><td>CoverGrip Lamel Mastik&nbsp;</td><td>Biyotyum&nbsp;</td><td>23005</td><td></td></tr><tr><td>Kriyofilm tipi 3C(16UF) (levha tipi) 2.0 cm genişlik</td><td>Section-lab</td><td>C-FUF303</td><td>Doğrudan Section-lab'den satın alınacak</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1900 UV</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Taban Kalıpları&nbsp;</td><td>epredia</td><td>58952</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu</td><td>su gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sigma</td><td>20260630</td><td></td></tr><tr><td>Imaris yazılımı&nbsp;</td><td>Oxford Aletleri&nbsp;</td><td>N/A</td><td>3D rekonstrüksiyon için görüntü analiz yazılımı&nbsp;</td></tr><tr><td>Daldırma Yağı 518F</td><td>Zeiss</td><td>ISO 8036&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom bıçakları</td><td>Tüy</td><td>02.075.00.006</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Cam Antifade Mountant&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>S36917</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Süper Kriyoembedding Ortamı (SCEM)</td><td>Section-lab</td><td>C-EM001</td><td>Doğrudan Section-lab'den satın alınacak</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Mikroskop slaytları</td><td>avantor</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>Zen yazılımı</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Konfokal lazer tarama mikroskobu için Ücretsiz Yazılım</td></tr></tbody></table>

kas-İskelet dokusundaki primer kirpiklerin arl13b-centrin-2 fare modeli kullanılarak hacimsel görüntülenmesi ve analizi

Volumetric Imaging and Analysis of Primary Cilia in Musculoskeletal Tissue using the ARL13B-CENTRIN-2 Mouse Model

6 haftalık farenin büyüme plakası, tarif edilen protokol ve dokuda haritalanan primer kirpik organizasyonu kullanılarak görüntülendi. Büyüme plakasının üç bölgesinin de (dinlenme, proliferatif ve hipertrofik) bir görüntüsü yakalandı ve analiz hattından geçirildi (Şekil 2A). Bireysel hücreler, siliyer aksonemleri kırmızı ve sentriolleri yeşil renkte olmak üzere DAPI boyama ile tanımlanabilir. Bu yöntemi kullanan çözünürlük, tek tek sentriolleri ayırt etmek için yeterince yüksektir (Şekil 2B). Bu çözünürlükte, kirpikler 3 boyutlu ortamlarında farklı yönlere işaret ederek görselleştirilebilir (Video 1).
Daha yüksek büyütme hedeflerine sahip daha düşük çözünürlüklü görüntüler, daha geniş bir doku bölgesindeki birincil kirpikleri görselleştirmek için de yakalanabilir; ancak bunlar kirpik oryantasyonunun 3D analizi için uygun değildir. Örneğin, eklem kıkırdağındaki primer kirpikler 20x objektif ile görüntülendi ve bu da yöntemin diğer dokularda da işe yaradığını gösterdi (Şekil 2C). Bu çözünürlükte, kırmızı renkli siliyer aksonemler tanımlanabilir, ancak sentriollerin ayırt edilmesi daha zordur. Subkondral kemik, çok fazla GFP arka plan sinyali sunma eğilimindedir ve bu dokuda sentriolün tanımlanmasını zorlaştırır.
Boru hattı, tek tek hücreleri, birincil kirpikleri ve sentriolleri tespit edebilir ve 10 haftalık farelerde olduğu gibi, kolonların daha az iyi tanımlandığı yüksek düzeyde organize genç büyüme plakaları ve daha yaşlı büyüme plakaları için çalışır (Şekil 3). Hücreler ve kirpikler, z-yığını boyunca görüntülenebileceği gibi 3D olarak algılanır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67693/67693fig01.jpg"> 
Şekil 1: Deneysel iş akışı. Doku toplamadan görüntü analizine kadar protokoldeki farklı adımların akış şeması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/67693fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67693/67693fig02.jpg"> 
Şekil 2: ARL13B-CENTRIN-2 faresinin murin dokularındaki primer kirpikler. (A) 6x objektif ile görüntülenen, DAPI'nin beyaz, CENTRIN-2'nin yeşil ve ARL13B'nin kırmızı olduğu 40 haftalık bir büyüme plakası. (B) Tek bir birincil silyum ve iki sentriyolünü yakınlaştırın. (C) 4 haftalık bir farenin eklem kıkırdağı ve subkondral kemiği, 20x objektif ile görüntülendi. (D) Kas-iskelet dokusu ile aynı boru hattı kullanılarak görüntülenen 6 haftalık bir farenin böbreği. (E) Böbrekteki bireysel primer kirpikleri ve merkezlerini gösteren D'deki beyaz kutunun büyütülmesi. Ölçek çubukları = 20 μm (A,D), 4 μm (B), 60 μm (C), 6 μm (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/67693fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67693/67693fig03.jpg"> 
Şekil 3: Hücre ve kirpik algılama boru hattı. 10 haftalık bir büyüme plakası üzerinde görüntü analizi boru hattının örnek uygulaması. (A) Yazılımda açılan görüntü. (B) Hücre algılama boru hattının sonucu. (C) Kirpikler ve sentriol tespit boru hattının sonucu. Kirpikler pembe ve sentrioller yeşil renktedir. Yan görünüm, çözünürlüğün 3D'de farklı yönlere yönlendirilmiş kirpikleri ayırt edecek kadar yüksek olduğunu örneklemektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/67693fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Video 1: ARL13B-CENTRIN-2 faresinden alınan 6 haftalık bir büyüme plakasının üç boyutlu rekonstrüksiyonu. Üç boyutlu rekonstrüksiyon Imaris yazılımında yapıldı ve animasyon videosu olarak kaydedildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Video-1.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil S1: Mikroskop sisteminde görüntü elde etme ayarları. (A) Kanalları eklemek ve Airyscan modunu seçmek için Akıllı Kurulum penceresi. (B) Döşemeleri görüntüye seçmek ve önizlemek için döşeme görüntüleyici. (C) Airyscan Dedektör Ayarlama penceresi, tüm karolar yeşile döndüğünde Airyscan dedektörlerinin hizalamasının onaylandığı yer. (D) Üç kanal için lazer ayarları. (E) Edinme Modu ve Z-Stack ayarları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Supp-file-1.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil S2: Mikroskop sisteminde görüntü işleme ayarları. (A) Airyscan İşleme ayarları. (B) Dikiş ayarları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Supp-file-2.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil S3: Özel görüntü analizi işlem hatları. (A) GFP ve DAPI kanallarını kullanan hücre algılama boru hattı. (B) Sırasıyla mCherry ve GFP kanallarını kullanan birincil kirpikler ve merkezsel tespit boru hattı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Supp-file-3-.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Kas-İskelet Dokusundaki Primer Kirpiklerin ARL13B-CENTRIN-2 Fare Modeli Kullanılarak Hacimsel Görüntülenmesi ve Analizi

The primary cilium is a non-motile, solitary organelle assembled by most cell types. It is essential to the development and homeostasis of the skeleton ...

Büyüyen uzvu daha iyi anlamak için, hücrelerin çevrelerine tepkilerini düzenlemede önemli bir rol oynayan bir organel olan birincil silyumu inceledik. Silyumun büyümedeki rolünü araştırmak için, onları yeni kemiğin büyüdüğü bir kıkırdak tabakası olan büyüme plakası içinde görüntülüyoruz. Birincil silyum son derece küçüktür, beş mikrometreden daha kısadır, bu da özellikle üç boyutta görüntülemeyi zorlaştırır.Kıkırdak ve kemik gibi matris açısından zengin, kısmen kalsifiye dokular içinde görüntülemek, konum, yönelim ve boyut bir yana, varlıklarını doğru bir şekilde keşfetmeyi daha da zorlaştırır. Büyüme plakası içindeki tüm hücrelerde primer kirpiklerin 3 boyutlu organizasyonunu haritalayabiliriz, hasta hücrelerin doku morfogenezine göre nerede ve nasıl yönlendirildiğini sorabiliriz. Birincil kirpikler daha önce sadece büyüme plakalarında veya çok az sayıda 2D olarak incelenmiştir.Silyum ve sentrioller için endojen floresan sinyaller, yüksek gürültü sinyali nedeniyle siliyer tanımlamanın güvenini getirir ve immünohistokimya ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu protokol aynı zamanda dokudaki yüzlerce kirpiklerin yüksek verimli toplu görüntülemesine izin vererek, kirpikleri üzerinde çalıştığımız morfogenez olaylarıyla uzamsal olarak ilişkilendirmemizi sağlar. Bu görüntüleme ve analiz metodolojisi, dokular ve organlar arasında primer kirpikleri haritalamak için diğer dokulara uygulanabilir.Bu, birincil kirpik yapısı ve işlevi arasındaki bağlantının daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır. Başlamak için, fare dokusunun hazırlanmış donmuş kriyo bölümünü alın ve slaytı çözülmesi için oda sıcaklığında yatay olarak yerleştirin. Sahteyi çıkarmak için slaytı bir damla PBS kullanarak her biri beş dakikalık üç döngü boyunca yıkayın.Slayta 10 mikromolar DAPI solüsyonu uygulayın ve bir dakika boyunca boyayın. Ardından numuneyi monte edin, üzerini bir örtü ile örtün ve gece boyunca oda sıcaklığında bırakın. Kapak astarı sızdırmazlık maddesi kullanarak kapak astarının kenarlarını kapatın.Konfokal mikroskobu kurmak için açın, yazılımı açın ve Sistem düğmesine tıklayın. Edinme sekmesi altında, kanalları ayarlamak ve GFP, mCherry ve DAPI kanallarını eklemek için Akıllı Kurulum'a tıklayın. Ardından, çözünürlük ve hız arasındaki ARI tarama üçgeninden ARI Tarama seçeneğini ve sR8-Y işlevini seçin.En İyi Sinyal'e tıklayın ve ardından onaylamak için Tamam'a tıklayın. Mikroskop Kontrolü altındaki Bul sekmesinde, yağa daldırma ile 40 kez ve 1.4 objektifi seçin. Ardından, sürgüyü sürgü tutucuya yerleştirin ve yağ kapak kızağına temas edene kadar hedefi yukarı kaldırın.Ardından büyüme plakasını veya ilgilenilen başka bir bölgeyi ışık yolunun altına yerleştirin. Bul sekmesinde, Floresans'a tıklayın ve DAPI'yi seçin. Ve göz merceğini kullanarak, büyüme plakasını veya ilgilenilen bölgeyi görüş alanının altına yerleştirmek için kaydırma tutucuyu joystick ile hareket ettirin.Alım sekmesinde yalnızca DAPI kanalını seçin. DAPI kanalının görüntüsünü ekranda görüntülemek ve büyüme plakasının görünür olduğundan emin olmak için Sürekli'ye tıklayın. Döşeme görüntüleyiciyi açmak için, Kutucuklar sekmesinde Görüntüleyiciyi Göster'i tıklatın.Genellikle X yönünde bir döşeme ve Y yönünde üç ila beş döşeme olmak üzere gerekli sayıda döşeme ekleyin. Ardından Önizleme ve Başlat'a tıklayın. Şimdi karoların büyüme plakasının üç bölgesini, dinlenme, proliferasyon ve hipertrofik kaplamasını kontrol edin.Gerekirse döşeme konumunu ve numarasını ayarlayın. Görüntü parametrelerini ayarlamak için, Edinme sekmesinde Sürekli'ye tıklayın. ARI tarama dedektörünü hizalamak için, alttaki döşemeli rozet sembolüne tıklayarak ARI Tarama Dedektörü Ayar Penceresini açın.Tüm fayanslar yeşile dönene kadar bekleyin. Kanallar sekmesinde, çekirdekleri ekranda net bir şekilde görüntülemek için kazanç ustasını ve lazer gücünü ayarlayın. Ardından, üç kanalı da seçin ve görüntülemeye başlamak için Sürekli'ye tıklayın.ARI tarama dedektörünün hizalanmasına izin verin. Edinme Modu sekmesinde görüntü boyutunu, piksel boyutunu, çerçeve boyutunu, hızı ve ortalama değerlerini tanımlayın. Edinme sekmesinde, Z yığını görüntülemeyi etkinleştirmek için Z Yığını onay kutusunu seçin.Ardından yalnızca DAPI kanalını seçin ve görüntüyü ekranda görüntülemek için Sürekli'ye tıklayın. Hedefi, görüntülenecek en yakın düzleme taşıyın. Z-Stack sekmesinde, İlk Düzlemi Ayarla'ya tıklayın, ardından görüntülenecek son düzleme odaklanın ve görüntüleme aralığını yapılandırmak için Son Düzlemi Ayarla'ya tıklayın.Z yığını düzlemleri arasındaki aralığı 0,15 mikrometre olarak ayarlayın. Z yığını görüntüleme aralığının merkezine geçin. Döşeme Bölgeleri altındaki Döşemeler sekmesinde, Doğrula'ya ve ardından Z Ayarla'ya ve İleri'ye Taşı'ya tıklayın.Şimdi Odak stratejisi sekmesinde, odak stratejisinin kutucuk kurulumunda tanımlanan Z değerlerini ve odak yüzeyini kullanacak şekilde ayarlandığını onaylayın. Ardından, görüntü alımına başlamak için Denemeyi Başlat'a tıklayın. Görüntüleri işlemek için İşleme sekmesine gidin, Tek veya Toplu Mod'u seçin, ARI Tarama İşleme'yi seçin, 3D İşleme seçeneğini işaretleyin ve Standart Otomatik Filtre'yi seçin.Elde edilen ham görüntüyü seçin ve işlemeye başlayın. ARI tarama işlemini tamamladıktan sonra, işleme yöntemlerinde Dikiş'i seçin. Yeni Çıktı, Sigorta Döşemeleri, Gölgelendirmeyi Düzelt ve Referansa Göre Tümü'nü seçin ve referans DAPI olarak ayarlanmıştır.ARI taraması işlenmiş görüntüyü seçin ve birleştirme işlemini başlatın. Başlamak için, alınan CZI görüntü dosyasını yazılıma aktarın ve Analiz panelini açın. Açılan menüde Yeni İşlem Hattı'nı seçin.İşlem hattına işleçler eklemek için İşlem Ekle düğmesini kullanın. Bir hücre algılama işlem hattı oluşturmak için, hücre sonrası Python segmenterini işlem hattına aktarın. Model adını Cyto 2, giriş kanalını 2, ikinci kanalı 3, mikrometre cinsinden çapı 10 olarak ayarlayın.akış eşiği 0,4'e ve hücre olasılık eşiği 0'a kadardır. Ardından, işlem hattından önce bir belge nesneleri içe aktarma operatörü ekleyin ve bunu El ile Etiketleri İçeri Aktar olarak yeniden adlandırın. Ardından işlem hattından sonra bir nesne özelliği filtre işleci ekleyin ve bunu Boyut Filtresi olarak yeniden adlandırın.İlk düzlemde ve son düzlemde Çokgen aracını kullanarak ilgi alanını çizin. Oluşturulan nesneyi yeniden adlandırın ve etiketleyin. İşlem hattını çalıştırmak için Analiz panelinin üst kısmındaki ileri mavi oka tıklayın.Birincil kirpik ve merkezlik algılama işlem hattı oluşturmak için Analiz panelini açın ve açılır menüden Yeni İşlem Hattı'nı seçin. İşlem hattına belge nesnelerini içe aktarma, iki eşik işleci, bölme, nesne, özellik, filtre ve bölme gibi işleçler ekleyin ve ayarlayın. Ardından, işlem hattını çalıştırmak için Analiz panelinin üst kısmındaki ileri mavi oka tıklayın.Nesneler penceresini açın, hücreleri, birincil kirpikleri ve sentriyolleri içeren nesneyi seçin, burada bölme hücresi olarak adlandırılır ve İçe/Dışa Aktar'a tıklayın. Excel Dışa Aktar'ı seçin. Çocuk sayısı, ad, ebeveyn adları, 3B yönelimli ciltli kısa kenar, orta kenar, uzun kenar, XY açısı, XZ açısı, XZ açısı, sınırlayıcı kutu X1, X2, Y1, Y2, Z1, Z2, X1, Z2, boyut, X, Y boyutu, Z boyutu, geometri merkezi X, Y, Z, düzlem ilk, son, sayım, ağ, hacim ağı ve kaydetmek için yüzey alanı ağı gibi özellikleri seçin.Birincil kirpik organizasyonu, altı haftalık bir farenin büyüme plakasında başarıyla haritalandı. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme, tek tek sentriolleri ve birincil kirpikleri üç boyutlu ortamlarında görselleştirme yeteneğini gösterdi. Hücreler ve birincil kirpikler, yana dönük birincil kirpikleri geriye dönük olanlardan ayırt edebilen görüntü analizi boru hattı kullanılarak 3D olarak algılanır.

volumetric-imaging-analysis-primary-cilia-musculoskeletal-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Havayolu kirpikler hareketliliği ve kirpikler oluşturulan akış fare trakea kullanarak görselleştirme ve ölçülmesi için kolay ve güvenilir bir tekniktir açıklanmıştır. Bu teknik faktörler çok çeşitli farmakolojik ajanlar, genetik faktörler, çevresel maruziyet, ve / veya mukus yük gibi mekanik faktörler de dahil olmak üzere, kirpikler hareketliliği nasıl etkilediğini belirlemek için değiştirilebilir.

Kemirgen Havayolu Epiteli içinde Cilia Motilite Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme için ex vivo Yöntemi

Koku alma duyusal nöronlarının kirpikleri, sinyal iletim kaskadının proteinlerini içerir, ancak kriyoseksiyonlarda dağılımlarının ayrıntılı bir uzamsal analizi zordur. Burada, siliyer proteinlerin tüm montaj etiketlemesi ve yüz görselleştirmesi için optimize edilmiş bir yaklaşımı açıklıyoruz.

Fareler Ana Koku Sistemde Cilia Whole Dağı Etiketleme

Birincil kirpikler çeşitli sinyal yollarını etkiler. Memeli kokleası, düzlemsel hücre polaritesi (PCP) sinyalini incelemek için idealdir. Kirpikler disfonksiyonu koklear büyümeyi, hücresel paternlenmeyi ve saç hücresi oryantasyonunu, PCP okumalarını etkiler. Amacımız, fare kokleasında PCP sinyalizasyonunu fenotipik analiz, immünohistokimya ve taramalı elektron mikroskobu ile analiz etmektir.

Ciliopathy Fare Mutant Kohlea Planar-Hücre-Polarite fenotipleri Değerlendirilmesi

Bu el yazması xarakteristikaları ve kemirgenler çene kemiğinde düzgün içinde hücresel değişikliklerin analizi için yöntemler sunar.

Bir xarakteristikaları ve fare çene kemiğinde düzgün için hücresel analiz yöntemi

Son zamanlarda ulaşım yolları çeşitli proteinlerin canlı hücrelerdeki birincil kirpikler içinde translocating için üç boyutlu (3D) kayma yerlerini eşleştirilmiş. Burada deneysel kurulum, biyolojik örneklerin işlem ve veri analizleri yaklaşım yeni görüntüleme 3D süper çözünürlük floresan için uygulanan bu kağıt ayrıntıları birincil kirpikler yaşıyorum.

Yüksek hızlı süper çözünürlük hızı mikroskobu canlı birincil Cilium içinde uygulanması

Primer silia centriole ile ilişkili hücre dışı yapılardır. İmmünfloresan boyama ile primer silia tespiti son derece yüksek kaliteli görüntülerle sonuçlanan nispeten basit bir işlemdir. Bu protokolde primer silya yı ifade eden fibroblastlar sabit, immünolekeli ve floresan veya konfokal mikroskopta görüntülendi.

İmmünfluoresan siyon ile Primer Silya'nın Basit Tespiti

Bu protokol, canlı hayvan intravital mikroskopisi kullanılarak CCL5 aracılı periosteal iskelet kök hücre göçünün gerçek zamanlı olarak saptanmasıdır.

Farelerde Periosteal İskelet Kök Hücrelerinin CCL5 Kaynaklı Göçünün Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi

Görüntüleri analiz etmek için yapay zekanın (Ai) kullanımı, yaygın olarak kullanılan yöntemlere kıyasla güçlü, daha az önyargılı ve hızlı bir yaklaşım olarak ortaya çıkıyor. Burada Ai'yi hücresel bir organel, birincil cilia'yı tanıması ve uzunluk ve lekelenme yoğunluğu gibi özellikleri titiz ve tekrarlanabilir bir şekilde analiz etmesi için eğitdik.

Birincil Cilia'yı Değerlendirmede Yapay Zeka Yaklaşımları

2D ve 3D insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hIPSC) tabanlı neokortik gelişim modellerinin üretimi ve karakterizasyonu için ayrıntılı protokollerin yanı sıra primer selyyum (PC) biyogenez ve fonksiyonunun nitel ve nicel analizini sağlayan tamamlayıcı metodolojiler sunuyoruz.

Neokortik Gelişim Sırasında Primer Seyum Tutulumını Diseksiyona Yönelik 2D ve 3D İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Bazlı Modeller

Mevcut protokoller, oküler lensteki periferik yapıların görüntü niceleme yöntemleriyle görselleştirilmesi için yeni tam montajlı görüntülemeyi tanımlamaktadır. Bu protokoller, lens mikro ölçekli yapıları ile lens gelişimi/işlevi arasındaki ilişkiyi daha iyi anlamak için yapılan çalışmalarda kullanılabilir.

Periferik lens yapısını, hücre morfolojisini ve organizasyonunu görselleştirmek ve ölçmek için tam montajlı görüntüleme

Burada, farelerde kraniyomaksillofasiyal kemik gelişiminin mevcut yöntemlerle mümkün olandan daha iyi değerlendirilmesi için farelerde kraniyomaksillofasiyal kemiklerin 3D modellerini segmentlere ayırmak ve ölçmek için mikrobilgisayarlı tomografiye dayanan bir yöntemi derinlemesine açıklıyoruz.

Üç Boyutlu Mikrobilgisayarlı Tomografi Kullanılarak Farelerde Kraniyomaksillofasiyal Malformasyonların Analizi

Keşfedin, ARL13B-CENTRIN-2 transgenik fare modeli kullanarak kas-iskelet dokusundaki primer kirpiklerin hacimsel görüntülenmesi ve analizi yöntemini. Bu teknik, gelişimsel biyolojide hücre sinyalleşmesini ve doku morfojenezini anlamanıza yardımcı olur.

Kas-İskelet Dokusundaki Primer Kirpiklerin ARL13B-CENTRIN-2 Fare Modeli Kullanılarak Hacimsel Görüntülenmesi ve Analizi

Daha fazla video keşfet