Kraniyal Nöral Krest Hücreleri Çoğullanmış Test için Üç Boyutlu İn Vitro Farklılaşma Protokolü

Geliştirme sırasında belirli bir kararın nasıl düzenlendiğini anlamakla ilgileniyoruz. Organoid modeller ve tek hücreli teknolojiler, daha önce mümkün olmayan soruları sormamıza izin veriyor. İn vitro organoid modellerin kullanımı, özellikle nöral krest gibi geçici hücre popülasyonları için daha fazla miktarda veri üretmemizi sağlar.

Önemli değişkenlik modeli çıktıları büyük bir deneysel zorluk olmaya devam etmektedir. Kraniyal kret hücrelerinin, farklılaşma potansiyelini genişletmek için prepotens genlerini yeniden eksprese ettiğini gösterdik. Başlamak için, DMEM nakavt ortamında mililitre başına iki miligram konsantrasyonda taze bir kollajenaz çözeltisi hazırlayın.

ESC ortamını %70 ila 80 birleşik mESC içeren kuyu plakasından aspire edin. Şimdi, kuyu kenarına yavaşça bir mililitre PBS ekleyin. Eşit yıkama sağlamak için plakayı sallayın.

PBS'yi pipetleyin ve iki mililitre kollajenaz çözeltisi ile değiştirin. 37 santigrat derecede 30 ila 45 dakika inkübe edin. Plakayı 20 dakikalık inkübasyondan sonra ve ardından her beş dakikada bir 10X büyütmede bir ışık mikroskobu altında kontrol edin.

Koloniler kıvrılmış kenarlar gösterdiğinde, kolonileri ayırmak için plaka tarafına kuvvetlice vurun. Beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, ayrılan kolonileri toplayın ve bunları 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Kolonileri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 16 G'de santrifüjleyin.

Alttaki kolonileri rahatsız etmeden konik borudan mümkün olduğunca fazla besiyeri aspire edin. Daha sonra, pelete bir mililitre% 0.05 tripsin çözeltisi ekleyin ve inkübe edin. Bir P1000 ve P200 mikropipetleriyle, kolonileri ayırmak için süspansiyonu kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyin, ardından tripsini bloke etmek için iki mililitre mESC kültür ortamı ekleyin.

Tüpü oda sıcaklığında üç dakika boyunca 160 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı pipetleyin, ardından bir mililitre CNCC farklılaşma ortamı ekleyin. Hücreleri otomatik bir hücre sayma cihazı ile veya mikroskop altında sayın, daha sonra 50 mikrolitre başına 3.000 canlı hücre konsantrasyonu elde etmek için hücreleri CNCC farklılaşma ortamında seyreltin.

Bir P200 mikropipet ile, TC ile muamele edilmemiş U tabanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 50 mikrolitre hücre süspansiyonu tohumlayın. Her bir kuyucuğu CNCC farklılaşma ortamı ile 200 mikrolitreye kadar doldurun ve inkübe edin. Her bir oyuğun dibinde net kenarlı küçük kümelerin görünür olduğundan emin olmak için 24 saatlik farklılaşmış hücre kültürünü içeren plakayı ışık mikroskobu altında gözlemleyin.

Plakayı gece boyunca inkübatöre geri koyun. İkinci günde, her kuyucuktan 100 mikrolitre ortamı yavaşça çıkarın. Ardından, kalan ortamla birlikte nörosferleri aspire etmek için ucu uçtan üç ila dört milimetre kesilmiş bir P200 mikropipet kullanın.

Nörosferleri ve kalan ortamı, TC ile muamele edilmemiş düz tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Aktarımı ışık mikroskobu altında doğrulayın. Her bir kuyucuğu 200 mikrolitre önceden ısıtılmış CNCC farklılaştırma ortamına doldurun.

Dördüncü günde, her kuyucuktan 100 mikrolitre ortam aspire edin. 100 mikrolitre önceden ısıtılmış CNCC farklılaştırma ortamı ile değiştirin ve ardından tekrar inkübe edin. Beşinci ve altıncı günlerde, nörosferlerin bağlantılarını ışık mikroskobu altında kontrol edin.

Nörosferlerden ayrılan daha hafif hücrelerin ana gövdesini çevrelemeye başladığından emin olun. CNCC bakım ortamını verilen bileşime göre hazırlayın. Sığır serum albüminini ortama eklemeden önce 0.22 mikrometrelik bir filtreden süzün.

Büyüme faktörleri eklendikten sonra, ortamı ışıktan korunduğundan emin olarak üç haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın. TC ile muamele edilmemiş 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre fibronektin çözeltisi ekleyin. Plaka dinlenirken, TC ile muamele edilmemiş düz tabanlı 96 oyuklu plakanın kuyularından mümkün olduğunca fazla CNCC farklılaşma ortamı aspire edin.

Ortamı 50 mikrolitre Accutase ile değiştirin. 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Daha sonra, Accutase'i söndürmek için her bir kuyucuğa 100 mikrolitre CNCC bakım ortamı ekleyin.

Fibronektin'i alıcı plakanın kaplanmış oyuklarından çıkarın. daha sonra ayrılan göç sonrası CNCC'yi 40 mikrometrelik bir filtreden alıcı plakanın kuyularına süzün. İstenilen zaman noktasında, nöroküreleri 96 oyuklu plakadan düşük bağlayıcı iki mililitrelik bir DNA tüpüne aktarmak için kesik uçlu bir P200 mikropipeti kullanın.

Nörokürelerin oda sıcaklığında üç dakika boyunca tüpe yerleşmesine izin verdikten sonra, mümkün olduğu kadar çok ortamı pipetleyin, ardından bir mililitre soğuk PBS ile durulayın. Montaj odalarını hazırlamak için, bir mikroskop lamı üzerine üç kat çift taraflı şeffaf fiberless bant yerleştirin. Bir usturayla, çift taraflı bantta üç milimetreye sekiz milimetrelik bir pencere kesin.

Bir stereoskop altında, P200 kesik uçlu bir pretere altında, temizleme maddesindeki nöroküreleri dikkatlice montaj odasına pipetleyin. Tüm odanın görüş alanını sağlamak ve nörosferleri tanımlamak için 2X ile 4X arasındaki büyütmeleri kullanın. Hazne yüzeyine bir kapak fişi yerleştirin ve yapıştırmak için yanlarına hafifçe bastırın.

Doku dışı plakalardaki nörosfer kültürleri, beşinci günden itibaren tek tip ekler sergilerken, Petri kabı kültürleri, özellikle dördüncü günde belirgin olan nörosferlerin değişken bağlanma ve füzyonunu gösterdi. Nörosferlerin boyut değişkenliği, 96 oyuklu plaka kültürlerinde dördüncü ve yedinci günlerde Petri kabı kültürlerine kıyasla önemli ölçüde azalmıştır. 96 oyuklu plakalardaki nörosferlerin çapı dördüncü günde 139 mikrometre ila 295 mikrometre ve yedinci günde 383 mikrometre ila 552 mikrometre arasında değişirken, Petri kabı kültürleri daha geniş bir aralık gösterdi.

Nörosfer büyümesi, hücre sayıları açısından üstel idi ve ikinci günde ortalama 1.082 hücreden dokuzuncu günde 48.352 hücreye yükseldi. Çap büyümesi doğrusaldı ve ikinci günde ortalama 136 mikrometreden dokuzuncu günde 570 mikrometreye yükseldi. İmmünofloresan analizi, nörosferlerin ve delaminasyon hücrelerinin dokuzuncu ve 13. günlerde CNCC belirteçleri AP2 alfa ve SOX9 ve EMT belirteci TWIST1'i eksprese ettiğini doğruladı.

PAX7 sadece nörosferlerde mevcuttu.