Name: Biyolojik Sıvılardan Hücre Dışı Veziküllerin Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 7 s
Description: Öğrenin, tetraspanin çip kullanarak biyolojik sıvılardan hücre dışı vezikülleri karakterize etme yöntemini. Bu yaklaşım, küçük hacimli örneklerden zengin veri çıkarımı sağlayarak göz sağlığında invaziv olmayan biyobelirteç araştırmalarını ilerletir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<table><tbody><tr><td>ChipWasher 100</td><td>NanoView</td><td>EV-CW100</td><td>Tetraspanin talaşlarını inkübe eder, yıkar, durular ve kurutur. Bu mevcut model artık mevcut değil. Satın alma sırasındaki fiyat: 9,995.00 $&nbsp;</td></tr><tr><td>ExoView Analyzer yazılımı</td><td>NanoView</td><td>N/A</td><td>Çip bilgilerini analiz eder ve daha fazla analiz için excel dosyaları üretir. Artık mevcut değil.</td></tr><tr><td>ExoView R100</td><td>NanoView</td><td>EV-R100</td><td>Tetraspanin çiplerini 3 dalga boyunda taramak için kullanılır. Bu mevcut model artık mevcut değil. Satın alma sırasındaki fiyat:&nbsp; $110,000.00</td></tr><tr><td>ExoView Tarayıcı yazılımı</td><td>NanoView</td><td>N/A</td><td>Çipleri 3 farklı dalga boyunda tarar. Artık mevcut değil.</td></tr><tr><td>İnsan Tetraspanin Kitleri</td><td>Zincirsiz Labs</td><td>EV-TETRA-C</td><td>8 tetraspanin cipsi, Kuluçka Çözeltisi, Bloke Etme Çözeltisi, CD63 antikoru, CD81 antikoru, CD9 antikoru, Çözelti A, Çözelti B, USB ve plaka kapağı içerir.</td></tr></tbody></table>

biyolojik sıvılardan hücre dışı veziküllerin karakterizasyonu

Characterizing Extracellular Vesicles from Biological Fluids

Çipler üzerindeki noktaları analiz ederken, CD63, CD81 ve CD9 kanallarında floresan etiketli EV'leri gözlemleyerek optimum bir EV konsantrasyonu hedefleyin ve MIgG kanalı 30,91 siyah kalmalıdır, çünkü bu, Şekil 3A'da görüldüğü gibi kontrol kanalıdır. Biyolojik sıvılar için CD81 azaltılacaktır. CD63, CD81 ve CD9 kanallarında floresan yoksa, EV'lerde yoktur (Şekil 3B). Çipi aşırı doyurmamaya dikkat edin (Şekil 3C). Bu, analiz yazılımının EV'lerin boyutunun, toplam parçacık sayısının ve fenotiplerinin doğruluğunu hesaplamasını zorlaştıracaktır. Optimal konsantrasyon noktalarından, analiz yazılımı EV'lerin boyutunu (50-200 nm), toplam partikül sayısını ve tetraspanin ekspresyonunu ölçebilecek (Şekil 4) ve daha fazla analiz için ayrı elektronik tablolara aktarılacaktır. Tetraspanin analizi, EV'ler üzerindeki yüzey proteinlerinin kolokalizasyonunu içerecektir. Yerelleştirme "/" ile temsil edilir, örneğin, "CD63/CD81". Bu, CD63 ve CD81'in birleştirildiği anlamına gelmez; bu, hem CD63 hem de CD81'in EV'nin yüzeyinde bulunduğu anlamına gelir.
Bu sonuçlar, sağlıklı ve hastalıklı örnekler arasında değerli bilgiler sağlayacaktır. Sağlıklı örneklerin veya hastalıklı örneklerin daha fazla EV, daha büyük veya daha küçük EV'ler üretip üretmediğini ve EV'lerin fenotipini belirleyebileceğiz. Bu özelliklerin herhangi biri veya tümü hastalığın biyogenezinde ve/veya ilerlemesinde rol oynayabilir. Bu sonuçlarla, hücre süreçleri ve EV'lerin oluşumu hakkında fikir verebilecek tetraspanin seviyelerinde bir eksiklik veya artış olup olmadığını görebileceğiz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig1.jpg"> 
Şekil 1: Farklı EV'lerin türleri ve boyutları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig2.jpg"> 
Şekil 2: Tetraspanin çiplerinin EV'leri nasıl yakaladığını ve tespit ettiğini gösteren şema. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig3.jpg"> 
Şekil 3: EV konsantrasyonlarının optimize edilmesi. (A) EV'lerin optimal konsantrasyonu. (B) Olumsuz sonuç: EV yok. (C) EV'lerin aşırı doygunluğu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig4.jpg"> 
Şekil 4: Nanopartikül analizörü tarafından üretilen veriler. (A) Nanometre cinsinden ölçülen EV çap boyutu. (B) EV'lerin toplam parçacık sayısı. (C) EV kolokalize fenotipi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Teknik</td>
			<td>Avantaj -ları</td>
			<td>Sınırlama</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasantrifüj</td>
			<td>Yüksek Saflık42,43</td>
			<td>EV morfolojisini değiştirir42,44</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Homojenlik42,45</td>
			<td>Büyük hacim gerektirir42,44,46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>İşlevsellik42,43</td>
			<td>Pahalı42,43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akış Sitometrisi</td>
			<td>Numuneleri birden fazla zaman noktasında değerlendirin47</td>
			<td>Zayıf sinyal48,49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Çoklu uç noktalar47,50</td>
			<td>Tıkalı gözenekler51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Yüksek verimli tek EV analizi52,53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yoğunluk Gradyan Santrifüjleme</td>
			<td>Son derece saf numuneler üretin54</td>
			<td>Emek yoğun55,56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Numune çeşitliliği55,57</td>
			<td>Zaman alıcı55,58 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Önemli verim kaybı54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yağış</td>
			<td>Basit59,60</td>
			<td>Kirlenme36,44,61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Hızlı61,62</td>
			<td>Spesifik Olmayan63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Yüksek Verim44,59,62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Nötr pH36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtrasyon</td>
			<td>Basit64 </td>
			<td>Tuzak eksozomları65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Hızlı64</td>
			<td>Büyük veziküllere zarar verir36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Ucuz64</td>
			<td>Filtre kek66,67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Eksozom tıkanması65</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: EV izolasyon tekniklerinin Avantajları ve Sınırlamaları. Avantajları ve sınırlamaları da dahil olmak üzere EV'leri izole etmenin çeşitli yollarının bir listesi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Teknik</td>
			<td>Avantaj -ları</td>
			<td>Sınırlama</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dinamik ışık saçılımı</td>
			<td>Boyutları 1 nm ila 6 μM arasında değişen partikülleri ölçün78 </td>
			<td>Büyük boyut aralığına sahip karmaşık eksozom numunelerinin ölçümü için uygun değildir79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Alt sınır 10 nm'dir, monodispers sistemler için uygundur79 </td>
			<td>Kontamine proteinleri eksozomlardan ayırt edememe79</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmisyon elektron mikroskobu (TEM)</td>
			<td>Eksozomların morfolojisini gözlemleyin79,80 </td>
			<td>Karmaşık numune hazırlamaişlemleri 79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>İç yapıyı gözlemleyin81 </td>
			<td>Abartılı floresan sinyalleri nedeniyle eksozomları boyut ve şekle göre ayırt edememe82 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopartikül İzleme analizi</td>
			<td>10 nm ila 2 μM aralığındaki eksozomların konsantrasyonunu, boyutunu ve boyut dağılımını ölçün78 </td>
			<td>EV'leri protein agregatlarından ve diğer kirleticilerden ayırt edemez83 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>Hızlı numune hazırlama ve ölçme78,84</td>
			<td>Pahalı NTA cihazı85 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Örnekler yerel formda geri kazanılabilir84 </td>
			<td>Titreşimlere karşı hassas85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Batı Lekesi (WB'ler)</td>
			<td>Marker proteinleri kalitatif ve kantitatif olarak analiz edebilir79,86 </td>
			<td>Karmaşık ve zaman alıcı79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Hücre kültürü ortamından eksozomların analizi79 </td>
			<td>EV izolatları lipoproteinler ve diğer kirleticiler içerebilir86 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Akış sitometrisi</td>
			<td>Daha yüksek hassasiyet ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme</td>
			<td rowspan="2">400 nm79,88 algılama limiti ile zaman alıcı ve zahmetli </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lekeli eksozomları muhafazalardan ayırt edin87 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Gerekli düşük numune konsantrasyonu79 </td>
			<td>Optik sinyaller doğruluğu ve çözünürlüğü engelliyor88 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dış Görünüm</td>
			<td>Eksozomlar89 üzerindeki Tetraspaninleri (CD9, CD63 ve CD81) ölçün </td>
			<td>Daha büyük EV boyutlarını ölçmez75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EV kargo proteinleriniölçer 90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 2: EV karakterizasyon tekniklerinin avantajları ve sınırlamaları.

Biyolojik Sıvılardan Hücre Dışı Veziküllerin Karakterizasyonu

Extracellular vesicles (EVs) are structures that are produced from cells and participate in intercellular communication by transporting biomolecules from ...

Hücre dışı veziküller, fizyolojik durumları yansıtan hastalık biyobelirteçleri olarak işlev görür. Yaklaşımımız, küçük gözyaşı hacimlerinden zengin veri çıkarımına olanak tanıyarak biyolojik sıvılarda EV araştırmalarını ilerletmektedir. Temel deneysel zorluklar arasında küçük numunelerden yeterli hücre dışı vezikül konsantrasyonları elde edilmesi, izolasyon sırasında numune kaybının en aza indirilmesi ve çip aşırı doygunluğunu veya zayıf sinyal algılamasını önlemek için analizin optimize edilmesi yer alır.Bu protokol, izolasyon adımlarını atlayarak işlem süresini azaltır ve küçük numune hacimlerinden hücre dışı vezikül analizine izin verir, bu da onu gözyaşı gibi sınırlı biyolojik numuneler için ideal hale getirir. Non-invaziv biyobelirteçler, kornea bozukluklarının erken tespiti ve yönetimi için çok önemlidir. Hücre dışı vezikül biyobelirteçleri, hastalıkların izlenmesini, kişiselleştirilmiş tedavileri, daha iyi hasta uyumunu ve daha iyi yaşam kalitesini mümkün kılar.Laboratuvarımız, KC deneklerinden alınan gözyaşı örneklerinde hücre dışı veziküllerin analizine öncülük etti ve benzersiz tEV imzalarını belirledi. Bu, gelecekteki teşhis ve EV odaklı terapötik hedeflerin önünü açıyor. Başlamak için, çalışma alanına biyolojik numuneleri ve bir tetraspanin çipini yerleştirin.Bir insan tetraspanin kitinin B çözeltisi ile önceden karıştırılmış 70 mikrolitre insan biyolojik örneğini bir çip üzerine pipetleyin. Numunenin buharlaşmasını önlemek için filmi bir talaş yıkama plakasına yerleştirin. 16 saat sonra plakayı talaş yıkayıcıya yerleştirin.Yerine kilitleyin ve kapağı kapatın. Talaş yıkayıcı üzerindeki CW-TETRA v0 seçeneğine basın. Talaşlar yıkanırken, talaş başına 300 mikrolitre engelleme solüsyonu hazırlayın.Bloke edici çözeltiye çip başına her antikordan 0.6 mikrolitre ekleyin. İyice karıştırmayı sağlamak için blokaj solüsyonunu antikor kokteyli ile girdaplayın. Talaş yıkama işlemi tamamlandığında, her bir talaşın üzerine antikor kokteyli ile 250 mikrolitre bloke edici solüsyon ekleyin.Ardından kapağı kapatın ve Devam'a basın. Talaş yıkayıcı cıvıl ötüş gösterdiğinde, talaş yıkama plakasını çıkarın. Çipleri rampadan yukarı taşıyın.Plakayı, yerine güvenli bir şekilde kilitlendiğinden emin olarak talaş yıkayıcıya geri yerleştirin. Kapağı kapatın ve Devam'a basın. Başlamak için bir nanopartikül analizörünü açın.Nanopartikül analizörüne bağlı masaüstünde tarama yazılımı programını başlatın. Her bir tetraspanin çipini seçmek için çip klasörünü seçin ve ayna üzerindeki Çip Konumunda bulun. Floresanı açmak için Chip Position'ın altındaki üç kareye tıklayın.Kareler sarı, mavi ve kırmızıya dönecektir. Mandren kapağına bastırın ve çıkarmak için çekin. Ardından, numune yüklü tetraspanin çiplerini aynaya sıkıca sabitleyin.Mandren kapağının mandallarını deliklerle hizalayın ve aşağı doğru bastırın. Yerine kilitlemek için kapağı kaydırın. Ardından mandreni sahneye yerleştirin ve yerine kilitleyin.Ardından, yazılım arayüzünden Scan Chips'e tıklayın, ardından Tamam'a tıklayın. Sahne tamamen makineye girdiğinde, kapıyı kapatın. Tarama tamamlandığında, sahneyi çıkarmak ve sonuçları doğrulamak için kapıyı açın. Taramalar başarılı olduysa, çipleri atın.Bir sonraki cips setini aynanın üzerine yerleştirin. Alternatif olarak, boş mandreni sahneye geri koyun. Yazılımdan çıkın ve işiniz bittiğinde makineyi kapatın.CD63, CD81 ve CD9 kanallarında hücre dışı veziküllerin optimal floresan seviyeleri gözlenirken, MIgG kontrol kanalı siyah kaldı ve kontrol özgüllüğünü doğruladı. Biyolojik sıvılar için CD81 azaltıldı. CD63, CD81 ve CD9 kanallarında floresan olmaması, hücre dışı veziküllerin yokluğunun göstergesidir.Floresanın aşırı doygunluğu belirgindi, bu da özellikle CD63, CD81 ve CD9 kanallarında aşırı etiketleme nedeniyle anlamlı verileri ayırt etmeyi zorlaştırıyordu.

characterizing-extracellular-vesicles-from-biological-fluids

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kanda bulunan hücre dışı veziküller çeşitli hastalıklar için yeni biyobelirteçler olarak önerilmiştir. Burada, periferik kan örneklerinden büyük plazma zarından türetilmiş mikroparçacıkların izolasyonu ve bunların konvansiyonel akış sitometrisi ve Western Blot ile müteakip analizleri için bir protokol sunuyoruz.

Periferik kan Microvesicles izolasyonu ve özelliklerinin belirlenmesi

Bu protokol için hızlı izole edilmesi insan tam kan üzerinden ekstraselüler veziküller ve belirli işaretleri karakterizasyonu için tam iş akışı floresans tabanlı nanopartikül izleme analizi ile açıklanmaktadır. Sunulan sonuçlar tekrarlanabilirlik yüksek düzeyde göstermek ve hücre kültür supernatants için ayarlanabilir.

İnsan kanı nanopartikül izleme analizi ile tek hücre dışı veziküller floresans tabanlı hızlı karakterizasyonu

Protokol hücre kültür supernatants ile kullanılmak üzere tasarlanmış küçük hücre dışı veziküller (EV) üzerinde yüzey epitopları algılamak için tekrarlanabilir yöntemi açıklanır. Yüzey antijeni CD9, tanıyan antikorlar ile CD63 ve CD81 birleştiğinde boncuk kullanarak belirli EV immunoprecipitation kullanır. Yöntem aşağı akım akış sitometresi analizi için optimize edilmiştir.

Hücre şartına ortamdan hücre dışı veziküller sitometrik analizinde akışı

Burada, küçük hücre dışı veziküller (EVs) tüm dokular, beyin ve tümör örnekleri de dahil olmak üzere gelen yalıtmak için detaylı bir protokol sağlar. Bu yöntem daha da aşağı akım analizleri için sağlam doku EVs ayıklamak için tekrarlanabilir bir teknik sunar.

Hücre dışı veziküller çekme--dan tüm doku

Bu rapor, mikroglia veya kan makrofajlarından ekstrasellüler vezikül (EV) izolasyonu için kronolojik gereksinimleri vurgulamaktadır. Mikroglia kaynaklı EV'ler nötral büyümenin düzenleyicisi olarak değerlendirilirken, c6 glioma hücre invazyonunun kontrolünde in vitro tahlillerde kan makrofajlı eV'ler incelendi. Amaç, belirli mikroortamlarda bağışıklık arabulucusu olarak bu EV fonksiyonlarını daha iyi anlamaktır.

İmmün Hücre Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin Karakterizasyonu ve Hücre Çevresi Üzerindeki Fonksiyonel Etkisinin İncelenmesi

Buradaki protokol, hücre dışı veziküllerin, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak şartlandırılmış hücre kültürü ortamından yeterince ayrılabileceğini göstermektedir.

Hücre Dışı Vezikülleri Şartlandırılmış Hücre Kültürü Ortamından Ayırmak için Boyut Dışlama Kromatografisi

Bu protokol, periferik kan ve katı dokulardan hücre dışı veziküllerin çıkarılması ve daha sonra yüzey antijenlerinin ve protein kargolarının profillenmesi için bir yöntem tanımlamaktadır.

Plazma ve Solid Dokulardan İzlenebilir ve İşlevselleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzlenmesi ve Analizi

En yeni nesil EV karakterizasyon araçları, aynı anda birden fazla parametre arasında tek EV analizi yapabilir. Nano-akış sitometrisi, etiketleme yapmadan 45 nm'den büyük tüm biyolojik parçacıkları ölçer ve çeşitli floresan etiketleme teknikleriyle alt popülasyonların spesifik özelliklerini tanımlar.

Nano-Flow Sitometri ile Tek Hücre Dışı Vezikül Transmembran Protein Karakterizasyonu

Bu makale, insan plazmasından türetilmiş hücre dışı veziküllerin (EV) izolasyonu, karakterizasyonu ve miktar tayinifisi için bir metodolojiyi açıklar ve sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) kullanılarak EV proteomunun etiketsiz analizi için bir iş akışı sunar.

Kardiyovasküler Biyobelirteç Keşfi için Plazma Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Proteomik Analizi

Bu protokol, mezenkimal stromal hücreler tarafından salınan hücre dışı veziküllerin (EV'ler) sıralanmasının ayrıntılı bir tanımını sağlar. Özellikle, cihaz ayarına ve sıralama koşullarının optimizasyonuna odaklanır. Amaç, özelliklerini koruyarak hücre dışı vezikülleri sıralamaktır.

Hücre dışı vezikül izolasyonu için başarılı bir sıralama ayarlama

Öğrenin, tetraspanin çip kullanarak biyolojik sıvılardan hücre dışı vezikülleri karakterize etme yöntemini. Bu yaklaşım, küçük hacimli örneklerden zengin veri çıkarımı sağlayarak göz sağlığında invaziv olmayan biyobelirteç araştırmalarını ilerletir.

Biyolojik Sıvılardan Hücre Dışı Veziküllerin Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet