Kıyı Sulak Alanlarında Metan Döngülü Mikrobiyal Dinamiklerin Görselleştirilmesi

Bu çalışma, Güney Teksas kıyı sulak alanlarındaki temel metan döngülü mikrobiyal genlerin mekansal ve zamansal dağılımını görsel olarak eşleştirdi, çevresel faktörlerin metan dinamiklerini nasıl düzenlediğini araştırıyor. Bulgularımız, Güney Teksas kıyı sulak alanlarındaki metan döngüsü genlerinin bolluğunun, tuzluluk ve mevsim dahil olmak üzere çevresel koşullara duyarlı olduğunu ortaya koymaktadır. Özellikle, bir tür metan monooksijenaz geni olan mmoX, daha soğuk mevsimlerde en bol miktarda bulunur.

Bu protokol, çevresel faktörlerden etkilenen mekansal ve mevsimsel mikrobiyal dinamikleri görselleştirmek için yeni araçlar sunarak metan döngülü mikrobiyal genleri tespit etme araştırmalarını ele almaktadır. Optimize edilmiş PCR yöntemlerini CBS görselleştirme ile entegre eden bu protokol, çevresel faktörlerden etkilenen dinamik, mekansal ve mevsimsel mikrobiyal kalıpları yakalarken metan döngüsü genlerinin gelişmiş tespitini ve uzamsal haritalamasını sağlar.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, eDNA ve diğer bileşenlerle 25 mikrolitrelik bir cPCR reaksiyon karışımı hazırlayın. Tüpleri PCR makinesine yerleştirin ve cPCR reaksiyonunu uygun parametrelerle çalıştırın. cPCR'den sonra, şablon DNA hariç, siber yeşil içeren qPCR reaksiyon karışımını hazırlayın. Hazırlanan reaksiyon karışımından 57 mikrolitreyi her bir PCR tüpüne dağıtın. Her tüpe 3 mikrolitre şablon DNA, standart veya nükleaz içermeyen su ekleyin ve karıştırmak için tüpe hafifçe vurun. Hazırlanan reaksiyon karışımından her tüpten 20 mikrolitrelik bir 96 oyuklu qPCR plakasının belirlenmiş kuyucuklarına alikot edin. PCR plakasını bir aplikatör kullanarak yapışkan bir PCR sızdırmazlık filmi ile kapatın. Ve uygun karışımı sağlamak için bir dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin ve kuyucuklardaki kabarcıkları ortadan kaldırın. PCR plakasını termal döngüleyiciye yerleştirin. qPCR makinesini açın ve protokolü ayarlamak için ilgili yazılımı açın. qPCR programını kurun ve çalıştırmayı başlatın. Coğrafi bilgi sistemi yazılımı olan ArcGIS Pro'yu açın ve proje dosyasını Study Area adıyla bilgisayardaki belirtilen klasöre kaydedin. Harita'ya tıklayın, ardından Temel Harita'yı seçin ve temel harita olarak etiketli araziyi seçin. Bul'a tıklayın, ardından Ara'ya tıklayın. Arama çubuğu açıldığında, haritada bulmak için çalışma alanının adını yazın. Coğrafi referanslama kullanarak belirli bir alanı çizmek için, Görünüm'e ve ardından üst katmandan Katalog Bölmesi'ne tıklayın. Katalogdan klasöre çift tıklayın ve gerekli dosya adını seçin. Geo-database .gdb dosyasına sağ tıklayın. Yeni'ye tıklayın ve Özellik Sınıfı'nı seçin. Ardından Özellik Sınıfı Oluştur penceresi görünecektir. Ad ve Takma Ad kutusunu yazın ve alttaki Son'a tıklayın. Şimdi, Görüntüle'ye ve ardından İçindekiler'e tıklayın. Diğer ad adı, İçindekiler bölmesinde gösterilir. Üst katmandan Düzenle'ye ve ardından Oluştur'a tıklayın. Özellik Oluştur bölmesi açılacaktır. Özellik Oluştur bölmesindeki takma ada çift tıklayın ve Araç Geri Bildirimini Yapılandır seçenekleri görünecektir. Çizgileri seçin, ardından çalışma alanı sınırını oluşturmak için harita üzerinde çizgiler çizin. İşlemi tamamlamak için haritayı çift tıklayın. CBS yazılımını simge durumuna küçültün ve bir elektronik tablo açın. İlk sütuna örnek adını, ikinci sütuna enlemi ve üçüncü sütuna boylamı yazın. pmoA1, pmoA2, mmoX ve mcrA'nın qPCR verileri için sonraki dört sütunu kullanın. Dosyayı CSV biçiminde bilgisayardaki belirli bir klasöre kaydedin. Ardından, CBS yazılımını açın ve Veri Ekle'ye ve ardından XY Nokta Verileri'ne tıklayın. Giriş Tablosu kutusundaki klasörden kaydedilen CSV dosyasını seçin. Çıktı Özellik Sınıfı kutusunda dosyayı yeniden adlandırın ve örnekleme noktalarını haritada görüntülemek için Çalıştır'ı tıklatın. Şimdi, üstteki arama çubuğuna tıklayın ve Kriging'i arayın. Örnekleme istasyonu dosyasını seçin ve pmoA1'i seçin. Ardından ortamı tıklatın, katman ve maskede örnekleme istasyonunu seçin ve Çalıştır'ı tıklatın. Haritanın bir düzenini oluşturmak için Ekle, Yeni Düzen'e tıklayın ve ANSI-Landscape'i seçin. Harita Çerçevesi'ne tıklayın, kriging ile haritayı seçin ve dikdörtgenler çizerek tüm haritaları düzene yerleştirin. Kuzey Ok'u seçin ve kuzey yönünü belirtmek için düzene yerleştirin. Ardından, haritada alanın ölçeğini görüntülemek için Ölçek Çubuğu'nu seçin. Gösterge'ye tıklayın, ardından harita göstergelerini görüntülemek için düzene yerleştirin. Izgara'ya tıklayın, ardından enlem ve boylam içeren bir ızgara oluşturmak için herhangi bir siyah graticule seçeneğini seçin. Izgara, İçindekiler bölmesinde Black Horizontal Label Graticule etiketiyle görünecektir. Siyah Yatay Etiket Boşluğu'na çift tıklayın, Bileşenler'i seçin ve sağlarındaki çarpı işaretine tıklayarak Onay 1 ve Izgara'yı kaldırın. Son olarak, üst katmandan Paylaş'a tıklayın, ardından Dışa Aktarma Düzeni'ne tıklayın. Dosya türünü PDF olarak seçin, Ad kutusunu kullanarak dosyayı bilgisayara kaydedin, dikey çözünürlüğü 500 DPI olarak ayarlayın ve haritanın PDF dosyasını oluşturmak için Dışa Aktar'ı tıklatın. cPCR analizi, tüm LB ve RV örneklerinde tespit edilen, ancak BC örneklerinde bulunmayan ve tuzluluğu metanojen dağılımına bağlayan mcrA genleri ile metan döngüsüyle ilgili gen tespitinde mekansal değişkenliği ortaya çıkardı. cPCR, A1-mb661 primer çiftleri ile pmoA1 için daha parlak bantlar gösterdi ve LB ve BC'de yokken RV örneklerinde düşük ancak tespit edilebilir bolluğu doğruladı. qPCR analizi, mmoX genlerinin serin mevsimde en bol ve pmoA1'in sıcak mevsimde en bol olduğu yüksek mevsimsel varyasyon gösterdi.