Name: İmmünofloresan ile Memeli Hücrelerinde Nükleer Kanama ve DNA Sızıntısının Tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Öğrenin, immünofloresan yöntemiyle HeLa hücrelerinde nükleer kanama ve DNA sızıntısını tespit etmeyi. Bu teknik, laminopati bozukluklarında DNA onarım mekanizmalarını incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Navarro, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+ZMPSTE24+%28FACE1%29+mutations+in+patients+affected+with+restrictive+dermopathy+or+related+progeroid+syndromes+and+mutation+update%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">New ZMPSTE24 (FACE1) mutations in patients affected with restrictive dermopathy or related progeroid syndromes and mutation update.</a> Eur J Hum Genet. 22 (8), 1002-1011 (2014).</li>
<li>Dittmer, T. A., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lamin+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">The lamin protein family.</a> Genome Biol. 12 (222), 1-16 (2011).</li>
<li>Gruenbaum, Y., Margalit, A., Goldman, R. D., Shumaker, D. K., Wilson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+lamina+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The nuclear lamina comes of age.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 21-31 (2005).</li>
<li>Navarro, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A+and+ZMPSTE24+%28FACE-1%29+defects+cause+nuclear+disorganization+and+identify+restrictive+dermopathy+as+a+lethal+neonatal+laminopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Lamin A and ZMPSTE24 (FACE-1) defects cause nuclear disorganization and identify restrictive dermopathy as a lethal neonatal laminopathy.</a> Hum Mol Genet. 13 (20), 2493-2503 (2004).</li>
<li>Barrowman, J., Wiley, P. A., Hudon-Miller, S. E., Hrycyna, C. A., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ZMPSTE24+disease+mutations%3A+Residual+proteolytic+activity+correlates+with+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Human ZMPSTE24 disease mutations: Residual proteolytic activity correlates with disease severity.</a> Hum Mol Genet. 21 (18), 4084-4093 (2012).</li>
<li>Richards, S., Muter, J., Ritchie, P., Lattanzi, G., Hutchison, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+accumulation+of+un-repairable+DNA+damage+in+laminopathy+progeria+fibroblasts+is+caused+by+ROS+generation+and+is+prevented+by+treatment+with+N-acetyl+cysteine%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The accumulation of un-repairable DNA damage in laminopathy progeria fibroblasts is caused by ROS generation and is prevented by treatment with N-acetyl cysteine.</a> Hum Mol Genet. 20 (20), 3997-4004 (2011).</li>
<li>Davies, B. S., Fong, L. G., Yang, S. H., Coffinier, C., Young, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+post-translational+processing+of+prelamin+A+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">The post-translational processing of prelamin A and disease.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 10, 153-174 (2009).</li>
<li>Barrowman, J., Hamblet, C., George, C. M., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+prelamin+A+biogenesis+reveals+the+nucleus+to+be+a+CaaX+processing+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Analysis of prelamin A biogenesis reveals the nucleus to be a CaaX processing compartment.</a> Mol Biol Cell. 19, 5398-5408 (2008).</li>
<li>Young, S., Meta, M., Yang, S. H., Fong, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prelamin+A+farnesylation+and+progeroid+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Prelamin A farnesylation and progeroid syndromes.</a> J Biol Chem. 281 (52), 39741-39745 (2006).</li>
<li>Houthaeve, G., Robijns, J., Braeckmans, K., De Vos, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bypassing+border+control%3A+Nuclear+envelope+rupture+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol%22%5BJournal%5D)">Bypassing border control: Nuclear envelope rupture in disease.</a> Physiol. 33 (1), 39-49 (2017).</li>
<li>Schreiber, K. H., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+lamins+go+bad%3A+Nuclear+structure+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">When lamins go bad: Nuclear structure and disease.</a> Cell. 152 (6), 1365-1375 (2013).</li>
<li>Fong, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterozygosity+for+Lmna+deficiency+eliminates+the+progeria-like+phenotypes+in+Zmpste24-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Heterozygosity for Lmna deficiency eliminates the progeria-like phenotypes in Zmpste24-deficient mice.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (52), 18111-18116 (2004).</li>
<li>Pendas, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+prelamin+A+processing+and+muscular+and+adipocyte+alterations+in+Zmpste24+metalloproteinase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Defective prelamin A processing and muscular and adipocyte alterations in Zmpste24 metalloproteinase-deficient mice.</a> Nat Genet. 31, 94-99 (2002).</li>
<li>Goldman, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+mutant+lamin+A+causes+progressive+changes+in+nuclear+architecture+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Accumulation of mutant lamin A causes progressive changes in nuclear architecture in Hutchinson-Gilford progeria syndrome.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 8963-8968 (2004).</li>
<li>Eriksson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+de+novo+point+mutations+in+lamin+A+cause+Hutchinson%E2%80%93Gilford+progeria+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recurrent de novo point mutations in lamin A cause Hutchinson–Gilford progeria syndrome.</a> Nature. 423, 293-298 (2003).</li>
<li>Young, S. G., Fong, L. G., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+Lipid+post-translational+modifications.+Prelamin+A%2C+Zmpste24%2C+misshapen+cell+nuclei%2C+and+progeria%E2%80%94new+evidence+suggesting+that+protein+farnesylation+could+be+important+for+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: Lipid post-translational modifications. Prelamin A, Zmpste24, misshapen cell nuclei, and progeria—new evidence suggesting that protein farnesylation could be important for disease pathogenesis.</a> J Lipid Res. 46 (12), 2531-2558 (2005).</li>
<li>Worman, H. J., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prelamin+A+and+ZMPSTE24+in+premature+and+physiological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Prelamin A and ZMPSTE24 in premature and physiological aging.</a> Nucleus. 14 (1), 1-17 (2023).</li>
<li>Pande, S., Ghosh, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+proteostasis+imbalance+in+laminopathy-associated+premature+aging+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Nuclear proteostasis imbalance in laminopathy-associated premature aging diseases.</a> FASEB J. 37 (8), 1025-1035 (2023).</li>
<li>Odell, I. D., Cook, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence techniques.</a> J Invest Dermatol. 133 (4), 1-12 (2013).</li>
<li>Kumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+and+enzyme+immunomicroscopy+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunoassay+Immunochem%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence and enzyme immunomicroscopy methods.</a> J Immunoassay Immunochem. 21 (2-3), 235-253 (2000).</li>
<li>Tjaden, A., Giessmann, R. T., Knapp, S., Schroder, M., Muller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+live-cell+multiplex+screen+for+chemogenomic+compound+annotation+based+on+nuclear+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-content live-cell multiplex screen for chemogenomic compound annotation based on nuclear morphology.</a> STAR Protoc. 3 (101791), 1-15 (2022).</li>
<li>Gunn, A. L., Yashchenko, A. I., Dubrulle, J., Johnson, J., Hatch, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content+screen+reveals+new+regulators+of+nuclear+membrane+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A high-content screen reveals new regulators of nuclear membrane stability.</a> Sci Rep. 14, 6013(2024).</li>
<li>Yu, L., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+DNA+sensing+by+cGAS%3A+Regulation%2C+function%2C+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytosolic DNA sensing by cGAS: Regulation, function, and human diseases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (170), 1-14 (2021).</li>
<li>Odinammadu, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+farnesyl+transferase+inhibitor+%28FTI%29+lonafarnib+improves+nuclear+morphology+in+ZMPSTE24-deficient+fibroblasts+from+patients+with+the+progeroid+disorder+MAD-B%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">The farnesyl transferase inhibitor (FTI) lonafarnib improves nuclear morphology in ZMPSTE24-deficient fibroblasts from patients with the progeroid disorder MAD-B.</a> Nucleus. 14 (1), 1-14 (2023).</li>
</ol>

Nükleer lamina, nükleer zarın altında yatan ve lamin adı verilen proteinlerden oluşan bir filament ağıdır. Nükleer lamina, nükleer mimaride, nükleer gözeneklerin konumlandırılmasında, gen ekspresyonunun düzenlenmesinde, kromatin organizasyonunda, DNA replikasyonunda ve DNA onarımında önemli roller oynar 1,2,3. Lamin proteinlerinin ekspresyonunda rol oynayan genlerdeki mutasyonlar laminopati adı verilen genetik bozukluklara yol açar3.
Restriktif dermopati (RD), ağırlıklı olarak ZMPSTE24 gen4'te erken sonlandırma kodonları oluşturan ve metalloprotaz ZMPSTE24 yokluğuna yol açan bileşik heterozigot mutasyonların neden olduğu ciddi bir laminopati bozukluğudur. Bu laminopati intrauterin gelişme geriliği, sıkı, sert cilt, küçük boyutlu ağız, ince kıl ve kemik mineralizasyon kusurları ile karakterizedir1. RD hastaları genellikle akciğer yetmezliği nedeniyle yaşamlarının ilk haftasını geçemezler1. Atipik Hutchinson-Gilford Progeria Sendromu (AT-HGPS) ve Mandibuloakral displazi tip B (MAD-B) olarak bilinen diğer iki laminopati bozukluğu, azalmış ZMPSTE24 ekspresyonunu içerir ve azalmış yaşam süresi ile ilişkilidir ve erken yaşlanma bozukluklarıyla benzerlikler gösterir5. Bu laminopatilerde etkilenen ZMPSTE24 proteaz, nükleer laminanın kritik bir bileşeni olan lamin A'nın translasyon sonrası modifikasyonunda hayati öneme sahiptir. ZMPSTE24 eksikliği, prelamin A2 olarak bilinen, eksik işlenmiş bir lamin A formunun birikmesine neden olur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67719/67719fig1.jpg"> 
Şekil 1: Lamin A işlemi normal vs. RD hücreleri. Normal hücrelerde Lamin A işleme yolu (solda) ve RD'de değiştirilmiş lamin A işleme veya ZMPSTE eksikliği olan hücrelerde (sağda). Farnezil (Fa) ve metil (Me) grupları belirtilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67719/67719fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Şekil 1'de görüldüğü gibi, normal lamin A işleminde, C-terminalinin yakınındaki bir sistein kalıntısına bir farnezil (lipid) grubu bağlanır, ardından üç C-terminal amino asidin 3,6 proteolitik bölünmesi gelir. Sistein kalıntısı daha sonra metillenir. Bu iki modifikasyon, prelamin A'nın iç nükleer zar2'ye hedeflenmesine izin verir. ZMPSTE24 daha sonra, son 15 C-terminal amino asidin, farnezil ve metil grupları ile birlikte, nükleer lamina 6,7,8'e iletilen olgun Lamin A proteini üretmek için uzaklaştırıldığı bir bölünme reaksiyonu gerçekleştirir. RD, AT-HGPS ve MAD-B'de, ZMPSTE24 metalloproteinaz eksik olduğundan veya tam olarak işlevsel olmadığından işlemenin son adımı etkili bir şekilde gerçekleşmez 8,9. Bu, kalıcı olarak farnesillenmiş ve metillenmiş olarak kalan prelamin A'nın birikmesine neden olur9. Bu son gruplar, prelamin A'nın, Şekil 1'de görüldüğü gibi, olgun lamin A'nın nihayetinde bulunması gereken nükleer laminaya lokalize olmak yerine iç nükleer membrana yapışmasına neden olur. Bu nedenle, ZMPSTE eksikliği, nükleer yapı10,11,12,13,14,15 ile birlikte çeşitli nükleer fonksiyonlar üzerinde derin etkilere sahiptir. Nükleer yapıdaki bu değişiklikler, DNA'nın sitozole sızmasına ve sitozolün çekirdeğe girmesine neden olabilen nükleer kanama ve hatta nükleer yırtılmayı içerebilir. Anormal şekilli çekirdekler, kusurlu prelamin A işleminin neden olduğu çok sayıda diğer fenotiple birlikte gerçekten de laminopati bozukluklarının ayırt edici bir özelliğidir16,17. Nükleer laminadaki kusurlar, nükleoplazmada nükleer protein kalite kontrolünün ve DNA onarım proteinlerinin yanlış lokalizasyonu da dahil olmak üzere çok sayıda zararlı etkiye yol açar ve bu da nükleer fonksiyonda çok sayıda kusura neden olur18. Laminopati fenotiplerini iyileştirmeyi amaçlayan terapötik yaklaşımların geliştirilmesine yönelik araştırmaları kolaylaştırmak için laminopatilerin bu ayırt edici özelliklerini tanımlamaya ve izlemeye yardımcı olabilecek basit bir tekniğe sahip olmak önemlidir. Laminopatili fareler için, nükleer kanamanın ortadan kaldırılmasının, laminopati fenotiplerinin16 genelleştirilmiş eliminasyonu ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. İnsan hücrelerinde nükleer bütünlüğün izlenmesine izin veren bir teknik, hastalık fenotiplerini ortadan kaldırmak veya önemli ölçüde iyileştirmek için potansiyel tedavilerin çalışmasını geliştirebilir.
Dolaylı immünofloresan (IF), ilgilenilen bir hedefi tespit etmek için hem birincil etiketlenmemiş bir antikor hem de birincil antikoru tanıyan florofor etiketli bir ikincil antikor kullanan hassas ve yaygın olarak kullanılan bir tekniktir19. IF yöntemleri, belirli hücre içi bileşenleri ve yapıları görselleştirmek için güçlü bir araç sağlayabilir. Birden fazla ikincil antikor molekülünün birincil antikor ile etkileşime girmesi ve bu da sinyalin19 amplifikasyonuna neden olması da mümkündür. Dolaylı IF, ikincil antikorlar, tür19 içinde korunan birincil antikorun Fc alanına karşı yükseltildiğinden, nispeten küçük bir ikincil antikor seti ile çoklu birincil antikorun saptanmasına da izin veren çok yönlü bir tekniktir.
Bu makale, sırasıyla DNA ve nükleer laminayı tespit etmek için çift sarmallı DNA (dsDNA) ve lamin B1'e karşı antikorlar kullanarak, ZMPSTE24 eksik hücrelerde nükleer kanama ve DNA sızıntısını değerlendirmek için dolaylı (IF) bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yaklaşımın faydasını göstermek için, prosedür, ZMPSTE24 ifade eden bir HeLa hücre hattının yanı sıra, nakavt edilmiş ZMPSTE24 ekspresyonu olan bir HeLa hücre hattına uygulandı ve iki hücre hattının sonuçları karşılaştırıldı.

<table><tbody><tr><td>22 mm Kare Cam Lameller</td><td>Propper Manufacturing Company</td><td>M8710</td><td>Standart bir mikroskop lamına sabitlenebildikleri sürece herhangi bir boyut veya şekil kullanılabilir.</td></tr><tr><td>% 36,5 Formaldehit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td>Fiksasyon Reaktifi.</td></tr><tr><td>75 cm 2 Şişe</td><td>Corning</td><td>430725U</td><td>Hücre kültürü için.</td></tr><tr><td>Sığır Serum Albinum (BSA)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td>Antikor seyreltme tamponu.</td></tr><tr><td>1 g / L glikoz, L-glutamin ve sodyum piruvat içeren DMEM</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td>Hücre kültürü için.</td></tr><tr><td>Etanol (200 Kanıt)</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>Montajdan önce numunelerin dehidrasyonu için, çoklu konsantrasyonlar yapmak üzere seyreltilir.</td></tr><tr><td>EVOS FL Dijital Ters Floresan Mikroskobu</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-563-460</td><td>Görüntüleme.</td></tr><tr><td>Balık Jelatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7041</td><td>Antikor seyreltme tamponu.</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Foto ağartmayı önlemek için montaj ortamı.</td></tr><tr><td>Parafilm (4 inç)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td>Kullanılan lameller sığabildiği sürece herhangi bir boyut değiştirilebilir.</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td>Hücre kültürü için.</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td> <td>N / A</td><td>N / A</td><td>Doku kültürü ve çözeltileri için laboratuvarda yapılır ve sterilize edilir.</td></tr><tr><td>Premium Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>Hücre kültürü için.</td></tr><tr><td>Superfrost Premium Mikroskop Slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td>Herhangi bir standart mikroskop lamı kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Doku Kültürü Tedavi Edilmiş 6 Kuyulu Düz Tabanlı Plakalar</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>Hücre kültürü için.</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Thermofisher Bilimsel</td><td>A16046. AP</td><td>Yıkamak için.</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.5)</td> <td>Gibco</td><td>15-400-054</td><td>Hücre kültürü için.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>9005-64-5</td><td>Hücre Geçirgenliği reaktifi.</td></tr></tbody></table>

İmmünofloresan ile memeli hücrelerinde nükleer kanama ve dna sızıntısının tespiti

Detection of Nuclear Blebbing and DNA Leakage in Mammalian Cells by Immunofluorescence

Bu çalışma, çift sarmallı DNA (dsDNA) ile birlikte nükleer laminayı görselleştirmek için bir IF yöntemi sunmaktadır. IF gerçekleştirildikten sonra, yakalanan görüntüler nükleer kanama ve DNA sızıntısı belirtileri açısından incelenebilir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67719/67719fig2.jpg"> 
Şekil 2: HeLa CT ve ZMPSTE24...

İmmünofloresan ile Memeli Hücrelerinde Nükleer Kanama ve DNA Sızıntısının Tespiti

The nuclear lamina is a network of filaments underlying the nuclear membrane, composed of lamins and lamin-associated proteins. It plays critical roles in ...

detection-nuclear-blebbing-dna-leakage-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Canlı hücreler içinde ayrı DNA molekülleri gözlenmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Bu teknik ilgi DNA içine yerleştirilmiştir bağlanma yerleri için bir floresan etiketlendi lac represör proteininin bağlayıcı esas alınmaktadır. Bu yöntem, zaman içindeki çok sayıda canlı hücreler rekombinant DNA izlemek için adapte edilebilir.

Floresan Mikroskobu ile Çoklu Nesiller boyunca Canlı Memeli Hücrelerinde Plazmid Çoğaltma İzlenmesi

Bu videoda, ışınlanmış hücre çekirdeğindeki çift sarmallı DNA kırılma bölgelerinde DNA onarım proteinleri γH2AX ve 53BP1'in lokalizasyonunu görselleştirmek için immünofloresan yöntemini açıklıyoruz.

DNA Onarım Protein Etkileşimlerinin İmmünofloresan Tabanlı Görselleştirilmesi

Bu videoda, insan mononükleer hücrelerinde DNA çift sarmallı kırılma bölgelerinde lokalize olan spesifik DNA hasar yanıt proteinlerini tespit etmek için immünofloresan mikroskopi tekniğini açıklıyoruz. Proteinler, spesifik birincil antikorlar tarafından tanınır ve bu antikorlar, mikroskobik görselleştirme sırasında floresan olan florofor etiketli ikincil antikorlara bağlanır ve proteinlerin hücre çekirdeği içinde farklı floresan odaklar olarak görselleştirilmesini sağlar.

DNA Çift İplikli Kırılmaların Analizi için İmmünofloresan Mikroskobu

Bu el yazması, floresan işaretli nanopartiküllerin doğrudan canlı hücrelerde endositozundan sonra hücre içi gen ekspresyonunun saptanmasına izin veren yeni bir tekniği tanımlamaktadır. Yöntem, hücrelerin manipülasyonunu gerektirmez ve hedef gen veya türe göre sınırlı değildir.

Floresan etiketli Nanopartiküller kullanma Fare, İnsan ve domuz Menşe Canlı hücreler hücre içi Gen İfade Algılama

Burada, genotoksik strese maruz kalan süspansiyon hücre kültürlerinde ATM ve p53 arasındaki doğrudan protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve görselleştirmek için in situ Proximity Ligation Assay (PLA) 'nın nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

Lazer microirradiation yaşayan hücrelerde DNA onarım çalışmaları için yararlı bir araçtır. Çeşitli DNA lezyonlar ikna etmek için UVA lazerler kullanımı için bir metodolojik yaklaşım gösterilir. Normal hücre döngüsü tutar yerel microirradiation için bir yöntemi optimize; Böylece, ışınlanmış hücre mitoz devam edin.

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

DNA hasar inducing ve DNA onarım proteinler seçili alt nükleer alanlarda yanıt izlemek confocal floresan mikroskopi ve lazer mikro-ışınlama teklif araçları. Bu teknik, hasar tespiti, sinyal ve işe alım ile ilgili bilgilerimizi önemli ölçüde ilerlemiştir. Bu el yazması tek ve Çift Kişilik strand sonu onarım incelemek için bu teknolojilerin gösterir.

Lazer mikro-ile kullanma için tek incelenmesi ve çift Strand Break onarım memeli hücrelerinde

Canlı hücre görüntüleme bilgi hazinesi tek hücreler veya tüm nüfus üzerinde ulaşılamaz olan sabit hücre tek başına Imaging tarafından sağlar. Burada, hücre kader kararlar tedavi Anti-Mitotik uyuşturucu Paklitaksel ile aşağıdaki değerlendirmek için canlı hücre görüntüleme iletişim kuralları açıklanır.

Uzun vadeli canlı hücre kader Paklitaksel karşılık olarak değerlendirmek için Imaging hücreli

Çift iplikli kırılmalara DNA tamiri lezyon ele sonra sadece onarım kompleksleri, tatili, aynı zamanda onların çözünürlük oluşumu gerektiren dinamik bir süreçtir. Burada, ayirt mikroskobu geçici ve uzun ömürlü çift iplikçikli tatili için bir araç olarak bu genom bakım mekanizma incelemek için kullanırız.

DNA onarım işlemleri, Darbe Gerilimlerinden ve uzun süreli iki iplikçikli DNA sonları ayirt mikroskobu ile karakterize

Bor nötron yakalama terapisinde (BNCT) kullanılan nötron karışık ışınıile aktive edilen radyasyona bağlı DNA hasar tepkisi tam olarak belirlenmemiştir. Bu protokol, nötron-karışık ışın ile ışınlama sonra insan kolon kanseri hücre hatlarında immünofloresan boyama tarafından onarım proteinlerinin radyasyonkaynaklı foci (RIF) tespit etmek için adım adım bir prosedür sağlar.

İnsan Kolon Kanseri Hücrelerinde DNA Hasarı ve Onarım Foci İmmünofloresan Görüntüleme

Mevcut protokolde, immünofluoresans bazlı bir yöntem kullanarak hücre döngüsünün S/G2 aşamasında DNA çift iplik ucu rezeksiyonunun nasıl görselleştirilerek görselleştirilmeyi gösteriyoruz.

BrdU-DNA Etiketlemesi Kullanılarak Küresel DNA Çift Telli Uç Rezeksiyonunun Değerlendirilmesi Hücre Döngüsü Ayrımcılığı Görüntüleme ile birleştiğinde

Öğrenin, immünofloresan yöntemiyle HeLa hücrelerinde nükleer kanama ve DNA sızıntısını tespit etmeyi. Bu teknik, laminopati bozukluklarında DNA onarım mekanizmalarını incelemek için kullanılır.

İmmünofloresan ile Memeli Hücrelerinde Nükleer Kanama ve DNA Sızıntısının Tespiti

Daha fazla video keşfet