Fizyolojik intraluminal basınçlarda küçük pulmoner venlerde Ca2+ sinyallerinin görüntülenmesi
21 Mart 2025
Bu protokolde, intrapulmoner venlerde (küçük pulmoner venler veya PV'ler) fizyolojik intraluminal basınçlarda Ca2+ sinyallerinin kaydedilmesi ve analiz edilmesi için yeni bir teknik sunuyoruz. Teknik, küçük PV'lerin izole edilmesini, bunların bir Ca2+ göstergesi ile inkübe edilmesini, kanüle edilmesini ve basınçlandırılmasını, Ca2 + sinyallerinin konfokal görüntülemesini ve veri analizini içerir.
Kalsiyum sinyalleri, kaynak ve rol bakımından değişen kan damarı fonksiyonunu düzenler. Vasküler duvardaki spesifik fonksiyonlarını anlamayı ve hastalığa bağlı anormallikleri tanımlamayı amaçlıyoruz. Akciğer kan damarı çalışmalarının çoğu, pulmoner damarlara değil, arterlere veya kılcal damarlara odaklanır.
Fizyolojik ilgilerine rağmen normal intraluminal basınçlar altında pulmoner venlerdeki kalsiyum sinyallerini inceleyen hiçbir çalışma yoktur. Pulmoner venler, kardiyo döngüleri sırasında basınç değişikliğine uğrar, ancak kalsiyum sinyalleri üzerindeki etkileri araştırılmamıştır. Protokolümüz, normal basınçta küçük pulmoner venlerdeki kalsiyum sinyallerinin alınmasını ve otomatik olarak analiz edilmesini sağlar.
Protokolümüz, intraluminal basıncın küçük pulmoner venlerdeki kalsiyum sinyallerini nasıl etkilediğine dair gelecekteki çalışmalara olanak tanıyarak, bunların düzenlenmesi ve sağlık ve hastalıktaki rollerinin daha iyi anlaşılmasını sağlar. Başlamak için, diseksiyon aletlerini ve bulaşıkları% 100 etanol ile temizleyin, ardından deiyonize suda yıkayın. Bir makasla.
Ötenazi yapılmış bir farenin göğüs boşluğunu açın. Akciğerlere en az dokunuşla kalbi ve akciğerleri göğüs boşluğundan dikkatlice çıkarmak için forseps kullanın. Daha sonra, dokuyu soğuk HEPES tamponlu fizyolojik tuz çözeltisi içeren conta koruyucu kaplı bir plakaya yerleştirin.
Diseksiyon pimleri kullanarak kalbi ve akciğerleri sabitleyin, böylece büyük pulmoner venler ve pulmoner arterler açıkça görülebilir ve akciğerin sol lobu hafifçe gerilir. Büyük pulmoner venleri referans noktası olarak kullanarak, küçük pulmoner damarları çevreleyen dokuyu ince makas yardımıyla dikkatlice çıkarın. Daha sonra küçük pulmoner damarları çevreleyen dokudan nazikçe izole edin.
Daha sonra, DMSO ile 2.5 milimolar Fluo-4'lik bir stok konsantrasyonu hazırlayın. Stok çözeltisini kullanarak yükleme çözeltisini hazırlayın. Küçük pulmoner damarları yükleme solüsyonu ile 1.5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.
Tüpü alüminyum folyo ile örtün, bir saat boyunca 37 santigrat derecede bir su banyosunda inkübe edin. Küçük pulmoner damarları kanüle etmek için, yıkama solüsyonundan bir damarı çıkarın. Hazırlanmış bir basınç miyografi odasına yerleştirin.
Bir çift ince uçlu forseps ile, küçük pulmoner venin bir ucunu kanüllerden birine dikkatlice kanül edin, ardından küçük pulmoner venin kanüllü ucunun etrafına bir düğüm atmak için bir naylon iplik mikrofilamenti kullanın ve kanülün ucunu sabitlemek için. Pulmoner ven içindeki kanı çıkarmak için fizyolojik tuz solüsyonunu kanülden hafifçe itin. Diğer ucunu mikro filamentler kullanarak bir cam kanül ile bağlamak için naylon iplik kullanın.
Kalsiyum görüntüleme için, önce HEPES tamponlu fizyolojik tuz çözeltisi içeren bir boruya bir servo basınç kontrolörü takın. Küçük pulmoner veni bir uçtan basınçlandırmak için denetleyiciyi kullanın. Şimdi bir peristaltik pompayı bir girişe ve bir prize ve bir prize bağlayın ve çözeltiyi süper kaynaştırın.
Dengeleme periyodundan sonra, 1.000 kare için kalsiyum görüntüleri elde etmek için 40x su daldırma objektifini ve dönen disk konfokal görüntüleme sistemini kullanın. Görüntü analizi gerçekleştirmek için özel olarak tasarlanmış Spark'ı ve yazılımı başlatın. Görüntüleri yumuşatmak için beşe beş filtreyi ve medyan filtreyi kullanın, ardından Olay Otomatik Algılama için birden çok hücreli pulmoner venin düz bir bölgesini özetleyen bir çerçeve izleyin.
Görüntüle'ye ve Olay Otomatik Algılama'ya tıklayın. Olay eşiğini F0 üzerinden 1,3 F genliğe, toleransı %20'ye, tarama kutusunu yediye yedi piksele ve çalışma ortalamasını yedi görüntüye ayarlayın. Aramayı Başlat'a veya göz simgesine tıklayın.
Görünüm menüsünün altındaki küçük olaylar tablosuna tıklayarak olaylar tablosunu bulun, ardından algılanan kalsiyum iyon sinyallerinin sayısını seçilen çerçevenin alanına bölerek mikrometre kare başına olayları hesaplayın. Beş milimetre cıva intraluminal basıncında küçük pulmoner damarlarda kendiliğinden meydana gelen kalsiyum sinyallerinin sayısı, bazal koşullar altında mikrometre kare başına dakikada 0.73 artı veya eksi 0.2 olaydı. Riyanodin ilavesi, kalsiyum sinyalleme aktivitesini büyük ölçüde azalttı.
Genel Bakış
Bu çalışma, akciğer kan damarı araştırmalarında daha önce keşfedilmemiş bir alan olan, fizyolojik intralüminal basınçlardaki küçük pulmoner venlerdeki (PV'ler) kalsiyum (Ca2+) sinyallerinin spesifik işlevlerini incelemektedir. Yazarlar, küçük PV'lerin izole edilmesi, Ca2+ indikatörlerinin uygulanması ve bu sinyalleri analiz etmek için konfokal görüntüleme yapılmasını içeren yeni bir protokol sunmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Kardiyovasküler fizyoloji
- Kalsiyum sinyalleri
- Vasküler biyoloji
Arka Plan
- Kalsiyum sinyalleri, kan damarı fonksiyonu için kritiktir.
- Pulmoner venlerin (PV) pulmoner kan akışını etkilemesi nedeniyle bunların araştırılması esastır.
- Daha önce normal basınçlar altındaki PV'lerde Ca2+ sinyallerini değerlendiren çalışma yapılmamıştır.
Kullanılan Yöntemler
- Fare akciğerlerinden küçük PV'lerin izolasyonu
- Kalsiyum görüntülemesi için Fluo-4 AM kullanımı
- Sinyal tespiti ve analizi için konfokal mikroskopi
Temel Sonuçlar
- Küçük PV'lerde Ca2+ sinyalizasyonunu analiz etmek için bir protokol oluşturulmuştur.
- Bazal Ca2+ sinyalizasyon frekansı, kare mikrometre başına dakika başına 0,73 ± 0,2 olay olarak ölçülmüştür.
- Ryanodin tedavisi, Ca2+ sinyalizasyon aktivitesini önemli ölçüde azaltmıştır.
Sonuçlar
- Bu çalışma, intralüminal basıncın küçük PV'lerdeki Ca2+ sinyallerini nasıl etkilediğine dair anlayışı geliştirmektedir.
- Bulgular, sağlıklı durumlarda ve hastalıklarda vasküler regülasyonun anlaşılması açısından önem taşımaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektörel İlişkilendirme
Fizyolojik basınçlarda küçük pulmoner venlerdeki Ca2+ sinyallerinin kantitatif görüntülemesi, vasküler biyolojideki kritik bir boşluğu doldurarak pulmoner vasküler hedef doğrulaması için mekanistik risk azaltmaya olanak tanır. Bu yetkinlik, fizyolojik koşullara yakın şartlar altında vasküler sinyallemenin doğrudan ve kantitatif okumalarını sağlayarak erken keşif aşamasındaki öngörü güvenilirliğini artırır. Yöntem, aday müdahalelerin hastalıkla ilgili vasküler sinyal yolakları üzerindeki fonksiyonel etkisini netleştirerek portföy kararlarını destekler.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Hastalıkla ilgili vasküler sistemlerde Ca2+ aracılı sinyalizasyonun doğrudan sorgulanmasına olanak tanır.
- Rayanodin reseptör modülasyonunun vasküler fonksiyon üzerindeki etkilerini izole ederek mekanizmaya dayalı risk azaltımını destekler.
- Pulmoner vasküler araştırmalarda fonksiyonel hedef doğrulaması için kantitatif son noktalar sağlar.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bütün vascular dokularda Ca2+ sinyallerinin görüntülenmesi ve miktarının belirlenmesi için tekrarlanabilir bir iş akışı oluşturur.
- Tanımlanmış basınç koşulları ve otomatik olay tespit eşikleri aracılığıyla analiz standardizasyonunu kolaylaştırır.
- Bileşiklerin vasküler Ca2+ sinyalizasyon dinamikleri üzerindeki etkilerinin güvenilir şekilde karşılaştırılmasına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bulguların translasyonel ilgisini artırmak için deneysel koşulları fizyolojik basınçlarla uyumlu hale getirir.
- Hastalıkla ilgili fonksiyonel okumalar sağlayarak keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar sürekliliği destekler.
- Hedef dışı veya advers vasküler etkilerin erken tespitine olanak tanıyarak translasyonel riski azaltır.
Hat ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu görüntüleme protokolü; hipotez testi, hedef doğrulama ve fizyolojik koşullar altında vasküler sinyallemenin kantitatif değerlendirmesi için bir platform sağlayarak, keşiften preklinik aşamaya uzanan sürekliliğe entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Pulmoner venlerdeki Ca2+ sinyal yolaklarının hipotez odaklı sorgulanmasını destekler.
- Tarama: Farklı durumlar ve bileşikler arası karşılaştırmalar için standartlaştırılmış, kantitatif çıktılar sağlar.
- Analitik: Güçlü istatistiksel analizler için otomatik olay tespiti ve frekans kantifikasyonu sunar.
- Translasyonel Araştırma: Fizyolojik basınç koşullarını koruyarak in vitro bulgular ile in vivo uygunluk arasında köprü kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli vasküler araştırma programları için yeniden kullanılabilir bir görüntüleme ve analiz platformu sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Vasküler hedef doğrulamada öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik için görüntüleme ve analiz iş akışlarını standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Sürecin erken aşamalarında kantitatif ve fizyolojik olarak ilgili veriler sağlayarak devam/durdur kararlarına temel oluşturur.
- Portföy Etkisi: Vasküler hedeflerin ve aday müdahalelerin riske göre ayarlanmış önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Vasküler dissection, basınç miyografisi ve konfokal görüntüleme konularında uzmanlık gerektirir.
- Yüksek hızlı döner diskli konfokal mikroskoba ve otomatik analiz yazılımına erişim gerektirir.
- Basınç ayarlarının ve olay tespit eşiklerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Translasyonel uygunluğu sağlamak için farklı damar boyutlarına veya türlere yönelik adaptasyon gerektirebilir.
- Ex vivo analizlerle sınırlıdır; tam translasyonel güven için in vivo doğrulama gerekebilir.
