Fizyolojik intraluminal basınçlarda küçük pulmoner venlerde Ca²⁺ sinyallerinin görüntülenmesi

Bu protokolde, intrapulmoner venlerde (küçük pulmoner venler veya PV'ler) fizyolojik intraluminal basınçlarda Ca²⁺ sinyallerinin kaydedilmesi ve analiz edilmesi için yeni bir teknik sunuyoruz. Teknik, küçük PV'lerin izole edilmesini, bunların bir Ca²⁺ göstergesi ile inkübe edilmesini, kanüle edilmesini ve basınçlandırılmasını, Ca^{2 +} sinyallerinin konfokal görüntülemesini ve veri analizini içerir.

Kalsiyum sinyalleri, kaynak ve rol bakımından değişen kan damarı fonksiyonunu düzenler. Vasküler duvardaki spesifik fonksiyonlarını anlamayı ve hastalığa bağlı anormallikleri tanımlamayı amaçlıyoruz. Akciğer kan damarı çalışmalarının çoğu, pulmoner damarlara değil, arterlere veya kılcal damarlara odaklanır.

Fizyolojik ilgilerine rağmen normal intraluminal basınçlar altında pulmoner venlerdeki kalsiyum sinyallerini inceleyen hiçbir çalışma yoktur. Pulmoner venler, kardiyo döngüleri sırasında basınç değişikliğine uğrar, ancak kalsiyum sinyalleri üzerindeki etkileri araştırılmamıştır. Protokolümüz, normal basınçta küçük pulmoner venlerdeki kalsiyum sinyallerinin alınmasını ve otomatik olarak analiz edilmesini sağlar.

Protokolümüz, intraluminal basıncın küçük pulmoner venlerdeki kalsiyum sinyallerini nasıl etkilediğine dair gelecekteki çalışmalara olanak tanıyarak, bunların düzenlenmesi ve sağlık ve hastalıktaki rollerinin daha iyi anlaşılmasını sağlar. Başlamak için, diseksiyon aletlerini ve bulaşıkları% 100 etanol ile temizleyin, ardından deiyonize suda yıkayın. Bir makasla.

Ötenazi yapılmış bir farenin göğüs boşluğunu açın. Akciğerlere en az dokunuşla kalbi ve akciğerleri göğüs boşluğundan dikkatlice çıkarmak için forseps kullanın. Daha sonra, dokuyu soğuk HEPES tamponlu fizyolojik tuz çözeltisi içeren conta koruyucu kaplı bir plakaya yerleştirin.

Diseksiyon pimleri kullanarak kalbi ve akciğerleri sabitleyin, böylece büyük pulmoner venler ve pulmoner arterler açıkça görülebilir ve akciğerin sol lobu hafifçe gerilir. Büyük pulmoner venleri referans noktası olarak kullanarak, küçük pulmoner damarları çevreleyen dokuyu ince makas yardımıyla dikkatlice çıkarın. Daha sonra küçük pulmoner damarları çevreleyen dokudan nazikçe izole edin.

Daha sonra, DMSO ile 2.5 milimolar Fluo-4'lik bir stok konsantrasyonu hazırlayın. Stok çözeltisini kullanarak yükleme çözeltisini hazırlayın. Küçük pulmoner damarları yükleme solüsyonu ile 1.5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.

Tüpü alüminyum folyo ile örtün, bir saat boyunca 37 santigrat derecede bir su banyosunda inkübe edin. Küçük pulmoner damarları kanüle etmek için, yıkama solüsyonundan bir damarı çıkarın. Hazırlanmış bir basınç miyografi odasına yerleştirin.

Bir çift ince uçlu forseps ile, küçük pulmoner venin bir ucunu kanüllerden birine dikkatlice kanül edin, ardından küçük pulmoner venin kanüllü ucunun etrafına bir düğüm atmak için bir naylon iplik mikrofilamenti kullanın ve kanülün ucunu sabitlemek için. Pulmoner ven içindeki kanı çıkarmak için fizyolojik tuz solüsyonunu kanülden hafifçe itin. Diğer ucunu mikro filamentler kullanarak bir cam kanül ile bağlamak için naylon iplik kullanın.

Kalsiyum görüntüleme için, önce HEPES tamponlu fizyolojik tuz çözeltisi içeren bir boruya bir servo basınç kontrolörü takın. Küçük pulmoner veni bir uçtan basınçlandırmak için denetleyiciyi kullanın. Şimdi bir peristaltik pompayı bir girişe ve bir prize ve bir prize bağlayın ve çözeltiyi süper kaynaştırın.

Dengeleme periyodundan sonra, 1.000 kare için kalsiyum görüntüleri elde etmek için 40x su daldırma objektifini ve dönen disk konfokal görüntüleme sistemini kullanın. Görüntü analizi gerçekleştirmek için özel olarak tasarlanmış Spark'ı ve yazılımı başlatın. Görüntüleri yumuşatmak için beşe beş filtreyi ve medyan filtreyi kullanın, ardından Olay Otomatik Algılama için birden çok hücreli pulmoner venin düz bir bölgesini özetleyen bir çerçeve izleyin.

Görüntüle'ye ve Olay Otomatik Algılama'ya tıklayın. Olay eşiğini F0 üzerinden 1,3 F genliğe, toleransı %20'ye, tarama kutusunu yediye yedi piksele ve çalışma ortalamasını yedi görüntüye ayarlayın. Aramayı Başlat'a veya göz simgesine tıklayın.

Görünüm menüsünün altındaki küçük olaylar tablosuna tıklayarak olaylar tablosunu bulun, ardından algılanan kalsiyum iyon sinyallerinin sayısını seçilen çerçevenin alanına bölerek mikrometre kare başına olayları hesaplayın. Beş milimetre cıva intraluminal basıncında küçük pulmoner damarlarda kendiliğinden meydana gelen kalsiyum sinyallerinin sayısı, bazal koşullar altında mikrometre kare başına dakikada 0.73 artı veya eksi 0.2 olaydı. Riyanodin ilavesi, kalsiyum sinyalleme aktivitesini büyük ölçüde azalttı.